הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

קביעת קבוצות משנה תא T רגולטורי ב מאתר התימוס, הלבלב ניקוז הלימפה והטחול באמצעות Cytometry זרימה

11.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/58848

⸱

27 בפברואר 2019

 ,  ,  , 
1Department of Medical Cell Biology, Uppsala University

במאמר זה

סיכום

במסמך זה, אנו מציגים פרוטוקול להכנת תאים בודדים של בלוטת התימוס מאתר הלבלב ניקוז הלימפה והטחול ללימוד נוסף תאים אלה באמצעות cytometry זרימה. בנוסף, פרוטוקול זה שימש לקביעת תת-קבוצות של הרגולציה ותאי T באמצעות cytometry זרימה.

תקציר

המערכת החיסונית שלנו מורכב מספר ומגוון של תאים חיסוניים כולל הרגולציה ותאי T תאים (Treg). Treg תאים מתחלקים שתי קבוצות משנה, תאים Treg (tTreg) נגזר הרתי ותאים Treg (pTreg) באופן עקיף המושרה. הם נמצאים איברים שונים של הגוף שלנו, ניתן להבחין באמצעות סמנים ספציפיים, כגון הליוס ו- Neuropilin 1. בעבר דווח כי תאים tTreg הם באופן פונקציונלי יותר מדכא מאשר תאים pTreg. לכן, חשוב לקבוע את הפרופורציה של תאים הן tTreg והן pTreg, כאשר חוקרים אוכלוסיות הטרוגניות תא. במסמך זה, אספנו הרתי בלוטות לימפה המנקזים הלבלב, טחולים מ normoglycemic בעכברים סוכרתיים שאינם שמנים להבחין tTreg תאים מתאי pTreg באמצעות cytometry זרימה. הכנו באופן ידני את המתלים תא בודד מן האיברים האלה. Fluorochrome מצומדת CD4 משטח, CD8, CD25, נוגדנים Neuropilin 1 שימשו כדי להכתים את התאים. הם נשמרו במקרר למשך הלילה. ביום הבא, התאים היו מוכתמים נוגדנים Foxp3 ואת הליוס תאיים fluorochrome מצומדת. סמנים אלה שימשו כדי לאפיין את שתי קבוצות משנה של תאים Treg. פרוטוקול זה מדגים דרך פשוטה אך מעשית כדי להכין תאים בודדים של בלוטת התימוס מאתר הלבלב ניקוז הלימפה והטחול, להשתמש בהם עבור ניתוח cytometric תזרים עוקבות.

מבוא

הרגולציה ותאי T (Treg) הם קריטיים עבור הומאוסטזיס של מערכת החיסון. Treg תאים מוגדרים על-ידי הביטוי של פני השטח אנטיגנים CD4 ו CD25 ולאחר שעתוק מקדם forkhead P3 תיבת (Foxp3)1,2,3. Sakaguchi et al. קודם הראה כי CD25 מתבטאת צורונים על תאי T משתיק קול עכברים4, אשר סיפקה תצפית חלוצית לצורך זיהוי תאים אנושיים Treg. תאים Treg לשחק תפקיד מרכזי סובלנות המערכת החיסונית מצידה בעל יכולת מדכאים באמצעות מגוון של מנגנונים, כולל cytolysis באמצעות ההפרשה של granzymes כדי לגרום אפופטוזיס, צריכת ציטוקין וניגוד דרך הביטוי של ציטוטוקסיות לימפוציטים-T אנטיגן 45. בנוסף, הם יכולים להפריש ציטוקינים מעכבות כגון הפיכת גורם הגדילה בטא (TGF-β), אינטרלויקין-10 (IL-10) ו- IL-355. Treg תאים באופן טבעי הנגזרות התימוס, ובמקרה הזה והם מיועדים תאים Treg (tTreg) נגזר הרתי, או שהם יכולה להיגרם באיברים ההיקפיים באותו מקרה נקראים תאים Treg (pTreg) באופן עקיף המושרה.

הליוס, חבר של משפחת פקטור שעתוק Ikaros, דווח כדי להיות סמן להבחנה בין תאים tTreg, pTreg תאים6. מאוחר יותר, שתי קבוצות אחרות דיווחו כי Neuropilin 1 (Nrp1), קולטן השלישי semaphorin, יכול לשמש כסמן משטח של תאים tTreg תחת תנאים מסוימים,7,8. למרות זאת, סינג ואח הראו כי הליוס הוא סמן טוב יותר בהקשר זה נאיבי עכברים9.

קבוצות משנה של תאים Treg לשחק תפקיד מרכזי שמירה על הומאוסטזיס מערכת החיסון, הגנה מפני מחלת חיסון עצמי ולדלקת. לכן, חשוב לקבוע את המספרים ואת הפרופורציות של אוכלוסיות אלה ברקמות הלימפה והן הלא-הלימפה. כדי להשיג זאת, יש להכין את המתלים תא בודד מן האיברים האלה. מספר פרוטוקולים המתוארים או בשימוש במחקרים קודמים. בעיקר, dissociators אוטומטי שימשו דוחות שפורסמו בעבר10,11. שימוש dissociators אוטומטי הוא נוח והוא חסכון בזמן, אבל זה הליך יקר. לכן, השתמשנו בשיטה ידנית כדי להכין המתלים תא בודד מאתר בלוטות הרתי, הלבלב ניקוז הלימפה (PDLNs), טחולים normoglycemic (הנד) שאינו שמנים בעכברים סוכרתיים, תאים בודדים מבודדת מן האיברים האלה. בשיטה זו נעשה שימוש במחקרים קודמים שלנו ומצאנו כי השיטה הידנית להכנת התליה תא בודד הוא יעיל כמו dissociator אוטומטי שיטה9,12,13,14. יתר על כן, השתמשנו cytometry זרימה כדי לקבוע את הפרופורציות של CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg תאים, תת-קבוצות של Treg תאים תאים tTreg ו- pTreg. התאים tTreg ו- pTreg היו מכובדים באמצעות הליוס Nrp1 כסמני תא tTreg. לכן, התוצאות שלנו עולה כי השיטה הידנית עבור הכנת את התאים לעבוד בצורה יעילה המתלים מוכן תא בודד יכול לשמש עוד יותר עבור מחקרים באמצעות cytometry זרימה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

ועדת האתיקה בעלי חיים מקומיים באוניברסיטת אופסלה אישרה את הניסויים בבעלי חיים.

1. קצירת איברים מבעלי חיים

  1. להקריב את העכברים מאת נקע בצוואר הרחם.
  2. מקום בלוטות הרתי ומאוזנת טחולים בקבוקונים נצנוץ 20 mL או 15 מ"ל צינורות חרוט מלא עם 5 מ של Hanks´ תמיסת מלח (HBSS). המקום PDLNs 1.5 mL מיקרו צינורות מלאים 1 מ"ל של RPMI 1640. השתמש התימוס כל הטחול, ואני את כל PDLNs.
    הערה: איברים יש לשמור על קרח לאורך כל ההליך, החוקר צריך לנסות להיות מהיר תוך כדי הכנת המתלים תא בודד, במיוחד כאשר טיפול רקמות הרתי מאז תאים חיסוניים הרתי יכול להיות מושפל במהירות בטמפרטורות גבוהות.

2. ותא בידוד של בלוטת התימוס וה טחול

  1. מחצי ביסודיות את בלוטת התימוס וה טחול עם זוג מספריים כדי לשחרר את התאים החיסוניים. למחוק את הקפסולה הרתי, הטחול הנותרים.
  2. העברת התליה תא צינור חרוטי 15 מ"ל ו צנטריפוגה ב 433 x g למשך 5 דקות ב 4 ° C כדי ליצור גלולה. למחוק את תגובת שיקוע.
  3. כדי lyse כדוריות דם אדומות, resuspend התליה תא ב 5 מ של 0.2 מ' NH4קלרנית, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות היפוך הצינורות upside מטה בעדינות כל 2 דק הוסף 5 מ של HBSS בסוף הדגירה כדי לעצור את פירוק.
  4. Centrifuge הצינורות ב x 433 g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
  5. Resuspend בגדר תא כ 5 מ של HBSS. למלא את הצינורות HBSS.
  6. Centrifuge הצינורות ב x 433 g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
  7. Resuspend בגדר תא כ 5 מ של HBSS. למלא את הצינורות HBSS.
  8. Centrifuge הצינורות ב x 433 g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
  9. Resuspend בגדר תא ב 5 מ של HBSS עבור התימוס, 10 מ של הטחול.
  10. 1 מ"ל של התליה תא הרתי והעברת µL 500 של התליה תא הטחול 5 מ ל עגול התחתון צינורות עם תא מסננת כמוסות. החל התליה תא את הפקקים מסננת של התא.
    הערה: רשת ניילון מיקרומטר 35 הוא שולב הכיפה. כ 5-10 מיליון תאים נאספו כל צינור.

3. תא ותא בידוד מ- PDLN

  1. מיקום רשת מתכת מיקרומטר 250 סטרילי מעל צינור חרוטי 15 מ"ל בארון תקשורת. יש לשטוף את רשת השינוי עם 1 מ"ל של RPMI.
  2. להעביר את בלוטות הלימפה מתכת רשת שינוי, לטחון אותם דרך הרשת בעזרת זוג מספריים. החל מ 1 ל RPMI על מתכת רשת שינוי כדי לשטוף את התאים לתוך הצינור. חזרה 3 פעמים יותר ולהסיר את רשת השינוי.
  3. Centrifuge הצינורות ב x 433 g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
  4. Resuspend בגדר תא כ 5 מ של RPMI. למלא את הצינורות RPMI.
  5. Centrifuge הצינורות ב x 433 g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
  6. Resuspend בגדר תא כ 5 מ של RPMI. למלא את הצינורות RPMI.
  7. Centrifuge הצינורות ב x 433 g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
  8. Resuspend בגדר תא ב- 2 מ של RPMI. העברת 2 מ"ל של התליה תא 5 מ ל עגול התחתון צינורות עם תא מסננת כמוסות. החל התליה תא את הפקקים מסננת של התא.

4. דנ

  1. Centrifuge את המתלים תאים התימוס, PDLN, טחול ב x 433 g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
  2. כתם התאים עם נוגדנים השטח הבאים ב- 100 µL של cytometry זרימה מכתים מאגר (FACS מאגר): 0.75 נוגדן µg/100 µL FITC מצומדת CD4, 0.60 נוגדן CD8 APC-H7-מצומדת µL µg/100, µg/100 0.30 µL מצומדת PE CD25 נוגדן, 5 µL (1:20) נוגדנים Nrp1 מצומדת-APC. דגירה הצינורות על קרח למשך 40 דקות.
  3. להוסיף 200 µL FACS מאגר כל שפופרת. Centrifuge הצינורות ב x 433 g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע. אני חוזר עוד פעם אחת.
  4. לתקן, permeabilize את התאים על ידי resuspending בגדר תא ב- 500 µL של המאגר קיבוע Permeabilization (PFB).
    הערה: PFB מוכן על ידי ערבוב חלק 1 של קיבעון/Permeabilization להתרכז בשלושה חלקים של קיבעון/Permeabilization Diluent.
  5. להשאיר את הצינורות במקרר ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    הערה: דגירה 1 h עובד גם.
  6. Centrifuge הצינורות ב x 433 g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
  7. Resuspend בגדר תא ב- 500 µL של Permeabilization שטיפה מאגר (PWB). Centrifuge הצינורות ב x 433 g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
    הערה: PWB מוכן על ידי דילול Permeabilization מאגר (10 x) 1:10 במים מזוקקים.
  8. כתם התאים עם נוגדנים תאיים הבאים ב- 100 µL של PWB: 0.30 נוגדן µg/100 µL PE-Cy7-מצומדת Foxp3, נוגדן PacificBlue מצומדת הליוס µL 4 (1:25). דגירה הצינורות על קרח לשעה.
  9. להוסיף 500 µL של PWB כל שפופרת. Centrifuge הצינורות ב x 433 g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
  10. Resuspend בגדר תא ב- 500 µL של PWB. Centrifuge הצינורות ב x 433 g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
  11. Resuspend בגדר תא ב- 300 µL מאגר FACS.
  12. לנתח את התאים על cytometer זרימה.
  13. שער של תאים בודדים בהתבסס על הצד פיזור-אזור, גובה, רוחב, ו קדימה פיזור-אזור, גובה ורוחב. הפעל מיליון אירועים לניתוח.
  14. ייצוא קבצים FCS ניסויים ולנתח אותם באמצעות תוכנה מנתח cytometry זרימה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

לחקור את הביטוי של Nrp1, הליוס על תאים tTreg ו- pTreg, אנו מוכנים תאים בודדים מן בלוטות הרתי, PDLNs, טחולים normoglycemic הנד עכברים, מוכתם אותם Treg תא הסמנים CD4, CD25, Foxp3, הליוס ו Nrp1 עבור זרימה cytometric ניתוח. התוצאות נותחו כפי שמוצג עם הנציג של gating אסטרטגיות (איור 1). מצאנו כי היחס של הליוס+ תאים בין CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg תאים היה גבוה מזה של Nrp1+ תאי כל שלושת האיברים (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במחקר זה, אנחנו מבודדים תאים בודדים בלוטות הרתי, PDLNs, טחולים של עכברים הנהון, חקרה את הביטוי של הליוס, Nrp1 ב CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg תאים באמצעות cytometry זרימה. במחקר הנוכחי, הנהון עכברים שימשו, אשר הוא מודל מאתר של סוכרת מסוג 1. במחקר הקודם, השתמשנו פראי סוג העכבר זנים CD-1 ועכברים C57BL/6 לחקור אם הליוס או Nrp1 הוא סמן טוב יותר להבחנה בין tTreg תאים מתאי pTreg. במחקר הזה, השתמשנו פרוטוקול דומה כדי לקבוע תת-קבוצות של תאים Treg תמים עכברים9. מצאנו ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

המחקר הנוכחי נתמך כלכלית על ידי המועצה למחקר השבדי, EXODIAB, קרן סוכרת שוודית, קרן סוכרת ילד שבדי, סאב Diabetesfonden רוצה שתיכנס לשם ו Edla Johanssons vetenskapliga stiftelse. המחברים גם רוצה תודה לכל-אולה Carlsson, סטלאן סנדלר שלהם תומך ודיונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
עכברילחם ביתי
HBSSStatens veterinä rmedicinska anstalt991750
RPMI-1640Sigma-AldrichR0883-500ML
NH4ClEMD Millipore1011450500
eBioscience Foxp3 / סט מאגר צביעה של גורם שעתוקThermoFisher00-5523-00מכיל תרכיז קיבוע/פרמביליזציה, מדלל קיבוע/פרמביליזציה ומאגר פרמביליזציה (פי 10)
eBioscience Flow Cytometry מאגר צביעהThermoFisher00-4222-26
CD4 נוגדן חד שבטי (RM4-5), FITC, eBioscienceThermoFisher11-0042-85
CD25 נוגדן חד שבטי (PC61.5), PE, eBioscienceThermoFisher12-0251-83
BD Pharmingen  APC-H7 עכברוש נגד עכבר CD8aBD Biosciences560182
עכבר Neuropilin-1 נוגדן מצומד APCR& D SystemsFAB5994A
FOXP3 נוגדן חד שבטי (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscienceThermoFisher25-5773-82
פסיפיק כחול נגד עכברים/נוגדן הליוס אנושיBioLegend137220
Falcon 5 מ"ל מבחנה פוליסטירן תחתון עגול, עם מכסה הצמד מסננת תאיםCORNING352235A 35 µ רשת ניילון m משולבת בכובע הצמד במיקום כפול
צינור 15 מ"ל, 120 מ"מ x17 מ"מ, PPSarstedt62.554.002
מיקרו צינור 1.5 מ"לSarstedt72.690.001
בקבוקוני נצנוץ חד פעמייםWHEATON
Flow CytometryBD
Flow Flow Cytometry תוכנה לניתוח ציטומטריהInivaiTechnologies Flowlogic
NOD

מקורות

  1. Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
  2. Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells. Nature Immunology. 4 (4), 337-342 (2003).
  3. Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
  4. Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. The Journal of Immunology. 155 (3), 1151-1164 (1995).
  5. Vignali, D. A., Collison, L. W., Workman, C. J. How regulatory T cells work. Nature Review Immunology. 8 (7), 523-532 (2008).
  6. Thornton, A. M., et al. Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells. The Journal of Immunology. 184 (7), 3433-3441 (2010).
  7. Weiss, J. M., et al. Neuropilin 1 is expressed on thymus-derived natural regulatory T cells, but not mucosa-generated induced Foxp3+ T reg cells. Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1723-1742 (2012).
  8. Yadav, M., et al. Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo. Journal of Experimental Medicine. 209 (10), S1711-S1719 (2012).
  9. Singh, K., Hjort, M., Thorvaldson, L., Sandler, S. Concomitant analysis of Helios and Neuropilin-1 as a marker to detect thymic derived regulatory T cells in naive mice. Scientific Reports. 5, 7767(2015).
  10. Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of single-cell suspensions from mouse spleen with the gentleMACS Dissociator. Journal of Visualized Experiments. (22), (2008).
  11. Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator. Journal of Visualized Experiments. (29), (2009).
  12. Singh, K., et al. Interleukin-35 administration counteracts established murine type 1 diabetes--possible involvement of regulatory T cells. Scientific Reports. 5, 12633(2015).
  13. Digre, A., et al. Overexpression of heparanase enhances T lymphocyte activities and intensifies the inflammatory response in a model of murine rheumatoid arthritis. Scientific Reports. 7, 46229(2017).
  14. Li, X., et al. Pro-tumoral immune cell alterations in wild type and Shb-deficient mice in response to 4T1 breast carcinomas. Oncotarget. 9 (27), 18720-18733 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

THelios Neuropilin 1Foxp3 CD25 CD4 CD8
קביעת קבוצות משנה תא T רגולטורי ב מאתר התימוס, הלבלב ניקוז הלימפה והטחול באמצעות Cytometry זרימה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.