מאמר שיטה

גילוי רצף הרומן מאת גנומיקה מופחתים

DOI:

10.3791/58877

⸱

25 בינואר 2019

 ,  , 
1Biology Department, American University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המטרה של פרוטוקול זה היא להשתמש שילוב של חישובית ומחקר ספסל למצוא רצפי חדשניים אשר לא ניתן להפריד בקלות בין רצף טיהור משותף, אשר עשוי להיות מוכר באופן חלקי בלבד.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גנומיקה מופחתים ניתן להשתמש במחקר כלשהו שבו המטרה היא לזהות את הרצף של גנים, חלבונים או אזור כללי שמוטבעת בתוך הקשר גנומית גדול. גנומיקה מופחתים מאפשר חוקר לבודד המטרה רצף של עניין (T) על ידי רצף מקיף ומחסר החוצה מרכיבים גנטיים מוכרים (הפניה, R). השיטה יכולה לשמש לזיהוי רצפים הרומן המיטוכונדריה, מהכלורופלסט, וירוסים, או germline מוגבלת כרומוזומים, יעיל במיוחד כאשר T לא יכול להיות בקלות מבודד מ ר מתחיל עם הנתונים גנומית מקיף (R + T), השיטה משתמש בסיסי מקומי יישור חיפוש כלי (פיצוץ) נגד רצף הפניה או רצפים, כדי להסיר את התאמת ידועים רצפי (R), משאיר מאחור את המטרה (T). עבור חיסור לפעול בצורה הטובה ביותר, R צריך להיות טיוטה שלמה יחסית שחסרה לו ט מאז רצפים שנותרו לאחר חיסור נבדקים דרך כמותיים תגובת שרשרת פולימראזית (qPCR), R לא צריך להיות מושלם. שיטת העבודה. כאן אנחנו קישור צעדים חישובית עם מדרגות ניסיוני לתוך מחזור זה יכול להיות iterated בהתאם לצורך, ברצף הסרת מספר רצפי הפניה וכוונון החיפוש אחר טי היתרון של גנומיקה מופחתים הוא כי ברצף ולחלוטין היעד ניתן לזהות אפילו במקרים שבהם טיהור פיזית קשה, בלתי אפשרי או יקר. החיסרון של השיטה הוא מציאת הפניה מתאימה עבור חיסור וקבלת T-חיובי ושלילי דגימות לבדיקת qPCR. אנו מתארים שלנו ויישום שיטת הזיהוי של הגן הראשון של כרומוזום germline מוגבלת של זברה פינק. במקרה זה סינון חישובית מעורב 3 הפניות (R), ברצף להסיר מעל בשלושה מחזורים: מכלול לא שלם גנומית, הנתונים הגולמיים גנומית, ונתונים transcriptomic.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטרת שיטה זו הוא לזהות של הרומן היעד (T) רצף גנומית, DNA או RNA, ההקשר גנומית, או הפניה (R) (איור 1). השיטה זו שימושית במיוחד אם היעד לא יכולה להיות מופרדים פיזית, או שזה יהיה יקר לעשות זאת. רק כמה אורגניזמים לחלוטין סיימו את הגנום עבור חיסור, אז חידוש מפתח בשיטה שלנו היא שילוב של חישובית של השיטות הספסל לתוך מעגל הפעלת חוקרים לבודד המטרה רצפים כאשר ההפניה היא פגומה, או טיוטה הגנום של אורגניזם שאינו-מודל. בסוף מחזור, בדיקות qPCR משמש כדי לקבוע אם יש צורך חיסור נוסף. רצף המאומת המועמד T יראה זיהוי סטטיסטית בדגימות T-חיוביות מוכרות על-ידי qPCR.

גלגולים של השיטה יושמו גילוי חדש חיידקי סמים מטרות שאין המארח homolog....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. דה נובו להרכיב מתחיל רצף

הערה: נתונים הדור הבא ברצף (הגדרות) יכול לשמש, כל עוד הרכבה ניתן להפיק את הנתונים האלה. נתוני קלט מתאים כולל אילומינה, PacBio, או Nanopore אוקספורד הקראה התאספו לתוך קובץ fasta. עבור קונקרטיות, סעיף זה מתאר הרכבה transcriptomic מבוססי אילומינה ספיציפית המחקר זברה פינק ביצענו7; אולם להיות מודע כי הפרטים משתנים לפי פרוייקט. לפרויקט בדוגמה שלנו, הנתונים הגולמיים היו נגזרת של MiSeq, קריאות לזווג כ-10 מיליון, התקבלו כל דגימה.

  1. השתמש Trimmomatic 0.32 נקודות14 כדי להסיר מתאמים אילומינה ובסיסים באיכות נמוכה. בשורת הפקודה, הזן:
    java-ג'אר PE trimm....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאחר הפעלת הפיצוץ, קובץ הפלט יהיה רשימה של רצפי מהשאילתה התואמות במסד הנתונים. לאחר חיסור פיתון, מספר רצפי צורות להיות מושגת, ונבדק על ידי qPCR. התוצאות של זה, ואת השלבים הבאים, נדונים להלן.

שלילי התוצאה. ישנן שתי תוצאות שליליות אפשריות כי ניתן לראות לאחר הפיצוץ רצף הפניה. ייתכנו תוצאות הפיצוץ, כלומר כי הרצף סה כ אין כל רצפי דומה להפניה. זה עשוי להיות שגיאה בבחירת את רצף ההתייחסות הנכונה עבור המדגם וסודרו. אפשרו.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעוד גנומיקה מופחתים הוא רב עוצמה, זה לא בגישה לשירי, המחייב התאמה אישית מספר השלבים החשובים, וכן בחירה זהירה של רצפי הפניה ודוגמאות מבחן. אם מכלול שאילתה באיכות ירודה, סינון צעדים אולי רק לבודד חפצים הרכבה. לכן, חשוב יסודי לאמת את מכלול דה נובו באמצעות פרוטוקול האימות המתאים לפרוייקט ספציפי. עבור ה-RNA-seq, הנחיות מסופקים על אתר טריניטי18 , ה-dna כלי כמו REAPR23 יכול לשמש. עוד צעד קריטי כשמשתמשים הפיצוץ הוא הבחירה של e-הערך המתאים, אשר יקבע החיסור יהיה רגוע או מחמ.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים להכיר מישל בידרמן, אליסה פדרסן, קולין. ג'יי Saldanha לסיוע שלהם עם הפרויקט גנומיקה זברה פינק בשלבים שונים. אנו גם להכיר יבגני Bisk עבור מחשוב ניהול המערכת אשכול ואת NIH גרנט 1K22CA184297 (ל J.R.B.) NIH NS 042767 (ל C.J.S).

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Accustart II Taq DNA פולימראזQuanta Bio95141
Blasic Local Alignment Search Tool (BLAST)https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki/Transcriptome-Assembly-Quality-Assessment
עניבת פרפר 2https://www.python.org/download/releases/2.7/
BWA-MEM v. 0.7.12https://github.com/BenLangmead/bowtie2
Geneioushttps://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
PEAR v. 0.9.6http://www.mybiosoftware.com/reptile-1-1-short-read-error-correction.html
מחשב אישי ביומטרסhttp://www.geneious.com/
PowerSYBR qPCR mixThermoFisher4367659
Python v. 2.7https://sco.h-its.org/exelixis/web/software/pear/
Reptile v.1.1https://alurulab.cc.gatech.edu/reptile
Stratagene Mx3005PAgilent Technologies401456
TransDecoder v. 3.0.1https://sourceforge.net/projects/bio-bwa/files/
Trinity v. 2.4.0https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/wiki

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barh, D., et al. A Novel Comparative Genomics Analysis for Common Drug and Vaccine Targets in Corynebacterium pseudotuberculosis and other CMN Group of Human Pathogens. Chemical Biology & Drug Design. 78 (1), 73-84 (2011).
  2. Sarangi, A. N., Aggarwal, R., Rahman, Q., Trivedi, N.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

BLASTqPCRTrinity

מאמרים קשורים