פרוטוקול זה מטרתו להדגים כיצד לשלב במבחנה microelectrode מערכים להתקנים microfluidic לימוד פוטנציאל הפעולה שידור בתרבויות עצביים. ניתוח נתונים, כלומר זיהוי ואפיון של הפצת פוטנציאל פעולה, הוא שבוצעו באמצעות חדש מתקדם, אך ידידותי למשתמש, זמינה בחופשיות, כלי חישובית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
התממשקות מיקרופלואידיקה עם מערכים Microelectrode ללמוד תקשורת עצביים והתפשטות אות עצב
במאמר זה
סיכום
תקציר
מערכים microelectrode (אותי) נמצאים בשימוש נרחב לימודים תפקוד במבחנה. מכשירים אלו מאפשרים בו-זמניות פולשני הקלטה/גירוי של פעילות אלקטרופיזיולוגיות לתקופות ארוכות. עם זאת, המאפיין של חישה אותות מכל המקורות סביב כל microelectrode יכול להיות שלילי כאשר מנסים להבין תקשורת, אות התפשטות מעגלים עצביים. ברשת העצבית, מספר הנוירונים ניתן להפעיל בעת ובעונה אחת, ניתן ליצור פוטנציאל פעולה חופפים, ומקשה להפלות ולעקוב אחר התפשטות אות. בהתחשב מגבלה זו, הקמנו במבחנה התקנה התמקדו הערכת אלקטרופיזיולוגיות תקשורת, אשר מסוגל לבודד ומגבירים אותות עצב עם רזולוציה גבוהה של יכולות. מאת התממשקות והתקנים microfluidic אותי, אנחנו יכולים להפריד תרבויות עצביים עם יישור ומבוקרות היטב של אקסונים ו- microelectrodes. התקנה זו מאפשרת הקלטות של ספייק התפשטות עם יחס אות לרעש גבוה במשך מספר שבועות. בשילוב עם נתונים המתמחה באלגוריתמים לניתוח, הוא מספק נתונים היסטוריים כימות של תקשורת מספר הקשורים מאפיינים כגון הפצת מהירות הולכה כשל, קצב ירי, anterograde קוצים, וקידוד מנגנונים.
פרוטוקול זה מדגים כיצד ליצור מלכודת תרבות עצביים ממודר מעל המצע משולב אותי כיצד תרבות נוירונים בתוכנית התקנה זו, כיצד להקליט בהצלחה, לנתח ולפרש את התוצאות של ניסויים אלה. כאן, אנו מראים איך הגדרת הוקמה מפשט את ההבנה של תקשורת עצביים והתפשטות אות עצב. פלטפורמות אלה לסלול את הדרך עבור במבחנה דגמים חדשים עם topographies הנדסה ורשת עצביים לשליטה. הם יכולים לשמש בהקשר של תרבויות עצביים הומוגנית, או עם תצורות תרבות משותפת איפה, לדוגמה, התקשורת בין נוירונים סנסוריים סוגי תאים אחרים הנמצאים תחת פיקוח, העריך. תוכנית התקנה זו מספקת תנאים מאוד מעניין ללמוד, לדוגמה, neurodevelopment, מעגלים עצביים, מידע קידוד, גישות הקשורים ניוון מוחיים neuroregeneration.
מבוא
הבנת תקשורת חשמלית של מעגלים עצביים היא צעד מהותי כדי לחשוף את התיפקוד הרגיל, לתכנן אסטרטגיות טיפוליות כדי לטפל בתפקוד. נוירונים לשלב, לחשב, להעביר פוטנציאל פעולה (APs) אשר יפיץ לאורך אקסונים דק שלהם. טכניקות מסורתיות אלקטרופזיולוגים (למשל, מלחציים תיקון) טכניקות עוצמתיות ללמוד פעילות. עצבית אך מוגבלים המבנים התאיים גדולים יותר, כמו סומא או של דנדריטים לעיתים קרובות. טכניקות ההדמיה להציע חלופה ללמוד אותות עצב עם רזולוציה מרחבית גבוהה, אך הם קשים מבחינה טכנית לבצע ולא מאפשרים מדידות לטווח ארוך1. בהקשר זה, השילוב של מערכים microelectrode (אותי) מיקרופלואידיקה יכולה לתרום תרומה חזק ב לחשוף את המאפיינים הבסיסיים של neuron´s פעילות של אות ש....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
בכל ההליכים הכרוכים חיות בוצעו על פי האיחוד האירופי (EU) דירקטיבה 2010/63/האיחוד האירופי (משורבב פורטוגזית חקיקה על-ידי Decreto-Lei 113/2013). פרוטוקול נסיוני (0421/000 000 2017) אושרה על ידי ועדת האתיקה של שני פורטוגזית שהסמכות הרשמית על רווחת בעלי חיים וניסוי (Alimentação de Geral-מחפשת ה Veterinária - DGAV), של המוסד המארח.
1. הכנת תרבות תקשורת, פתרונות אחרים
הערה: להכין טרי פתרונות ציפוי ביום של השימוש בו. ניתן לאחסן את פתרונות ציפוי שאינם בשימוש ומדיה תרבות ב-20 ° C או 4 ° C כמפורט להלן.
- הכינו 10 מיליליטר 0.05% (v/v) הפתרון עובד Poly(ethylene imine) (פיי).
- להכין 20 מ של 0.25% (w/v)....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
באמצעות פרוטוקול המתואר כאן, E-18 החולדה הנוירונים קורטיקלית נזרע על µEF מסוגלים לפתח ולהישאר בריאים בתנאים אלו תרבות עבור מעל חודש. ברגע 3 עד 5 ימים בתרבות, נוירונים בקליפת המוח לגדול אקסונים שלהם דרך microgrooves לכיוון תא עצב של µEF (איור 1). לאחר 15 ימים בתרבות, נוירונים בקליפת המוח תרבותי על µEF צפויים להפגין רמות קבועה של פעילות וצפויה התפשטות של פוטנציאל פעולה לאורך microgrooves. בתרבויות עבר (> 14 DIV) נוטים להיות נשלט על ידי מתפוצץ פעילות כמו קונב.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול המוצגת כאן מראה כיצד להרכיב את µEF, המורכב מכשיר microfluidic, לי עם עיצובים זמין מסחרית רגילה, וכיצד לנתח את הנתונים המוקלט.
בעת תכנון ניסוי, חוקרים יש לקחת בחשבון כי המודל במבחנה הוא מוגבל על ידי הרשת MEA קבוע, אשר מאלץ את הסדרי microgroove. השימוש של microfluidic מסוים או עיצוב MEA תיקבע בהתאם לצרכים הספציפיים ניסיוני אבל, באופן כללי, הפעולות בהליך צריך להחיל על תצורות שונות µEF.
החלטה קריטית להתבצע לפני הרכבה µEF היא בכוונת המשתמש לשימוש חוזר ב.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
עבודה זו מומנה פדר - פונדו Europeu דה Desenvolvimento האזורית כספים באמצעות 2020 להתחרות - Operacional תוכנית תחרותיות בינאום (POCI), פורטוגל 2020, וכן על ידי הפורטוגזים קרנות דרך FCT - Fundação פארא e Ciência Tecnologia / Ministério דה Ciência, Tecnologia e Ensino מעולה, במסגרת הפרויקט PTDC/CTM-נאן/3146/2014 (POCI-01-0145-פדר-016623). חוסה C מתאוס נתמכה על ידי FCT (PD/BD/135491/2018). פאולו הלומדים נתמכה על ידי פרוגרמה Ciência - פרוגרמה Operacional Potencial Humano (POPH) - קידום של מדעי תעסוקה, ESF, MCTES, תוכנית Investigador FCT, POPH ופונדו Europeu חברתית. המכשירים microfluidic היו מפוברק-INESC - מיקרוסיסטמס, ננוטכנולוגיה, פורטוגל, ת....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| B-27 Suplement (50X) | Thermo Fisher Scientific | LTI17504-044 | |
| פולי מסועף (אתילן אימין) (PEI), 25 kDa | Sigma-Aldrich | 408727 | טיהור PEI מסועף על ידי דיאליזה באמצעות ממברנה חתוכה של 2.5 kDa למשך 3 ימים ב-4° C כנגד תמיסת HCl של 5 מ"מ (מתחדשת מדי יום). יש לייבש בהקפאה את ה-PEI המטוהר. |
| מסננת תאים (40 ומיקרו; m) | Falcon | 352340 | |
| מיקרו-צינורות חרוטיים (1.5 מ"ל) | VWR | 211-0015 | |
| חיתול חד פעמי, 60x40 ס"מ | Bastos Viegas SA | 455-019 | |
| מלקחיים Dumont #5, ישר | כלי מדע עדינים | 91150-20 | |
| מלקחיים Dumont #5/45 | כלי מדע עדינים | 11251-35 | |
| מלקחיים Dumont #7, | כלים מדעיים עדינים מעוקלים | 91197-00 | |
| סרום בקר עוברי מומת בחום פרימיום | Biowest | S181BH-500ML | |
| למינין מבית Engelbreth-Holm-Swarm | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | הכן תמיסת מלאי למינין ב-1 מ"ג/מ"ל על ידי המסת האבקה בנפח המתאים של מדיום ללא תוסף. אחסן תמיסת למינין בטמפרטורה של -20 מעלות; C בכמויות קטנות (20 ומיקרו; L) כדי למנוע מחזורי הקפאה/הפשרה חוזרים ונשנים. |
| L-גלוטמין 200mM | Thermo Fisher Scientific | LTID25030-024 | |
| Neubauer תא ספירה משופר (המוציטומטר) | Marienfeld | 630010 | |
| מדיום נוירובזאלי (1X) | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | מדיום בסיסי המשמש לתרביות עצביות |
| PDMS מכשירים מיקרופלואידיים | לא ישים | לא ישים | מורכב משני תאי זריעה של תאים המחוברים ביניהם על ידי 20 מיקרו-חריצים עם 450 μ אורך וזמנים; 10 μ גובה וזמנים; 14 μ מידות רוחב M ומופרדות על ידי 86 ומיקרו; m (סה"כ מרווח של 100 μ m). |
| תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין (P/S) (100X) | Biowest | L0022-100 | |
| יחידת מסנן מזרק PES (Ø 30 מ"מ), 0.22 ומיקרו; מ | מפוליפרופילן 1730012 | ||
| , 15 מ"ל | Thermo Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| צינורות חרוטיים מפוליפרופילן, 50 מ"ל | Thermo Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| צינורות סרולוגיים מפוליסטירן דיספוזבל, 10 מ"ל | תרמו פישר סיינטיפיק | 1367811D | |
| צנרת סרולוגית פוליסטירן דיספוזבל, 5 מ"ל | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| סטנדרטי קרום תאית מחודש (2 kDa) | מעבדות ספקטרום | 132107 | |
| מספריים כירורגיים סטנדרטיים | כלים מדעיים עדינים | 91401-14 | |
| MEAs מישוריים משולבי מצע (256 מיקרואלקטרודות) | מערכות רב-ערוציות | 256MEA100/30iR-ITO | 252 אלקטרודות הקלטה טיטניום ניטריד (TiN) ו-4 אלקטרודות ייחוס פנימיות המאורגנות ברשת מרובעת של 16 על 16. כל אלקטרודת הקלטה היא 30 ומיקרו; m בקוטר ובמרווח של 100 &m. |
| קצה מזרק, 10 מ"ל | Terumo Europe | 5100-X00V0 | |
| קצה מזרק נעילה, 50 מ"ל | Terumo Europe | 8300006682 | |
| Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | חומר ניקוי אבקתי פעיל אנזימים המשמש לניקוי MEAs |
| לוחות תרבית רקמה, 35 מ"מ | StemCell Technologies | 27150 | |
| צלחות תרבית רקמה, 90 מ"מ | תמיסת פרילאבו | 900095 | |
| טריפן כחול (0.4%) | סיגמא-אולדריץ' | T8154 | |
| טריפסין (1:250) | תרמו פישר מדעי | 27250018 | |
| סרט ויניל 471 | 3M | B40071909 |
מקורות
- Scanziani, M., Hausser, M. Electrophysiology in the age of light. Nature. 461 (7266), 930-939 (2009).
- Nam, Y., Wheeler, B. C. In vitro microelectrode array technology and neural recordings. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
