מדידה של קיבולת בזרימת במבחנה כולסטרול סרום או פלזמה במודלים macrophage התא הוא כלי מבטיח כמו סמן עבור טרשת עורקים. במחקר הנוכחי, אנו לייעל לתקנן שיטה בזרימת להארכה-כולסטרול פלורסנט, לפתח ניתוח תפוקה גבוהה באמצעות לוחות 96-ובכן.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
תפוקה גבוהה התווית על-ידי Nitrobenzoxadiazole כולסטרול בזרימת Assay
במאמר זה
סיכום
תקציר
טרשת עורקים מובילה למחלות קרדיווסקולריות (CVD). לא ברור עדיין אם ריכוז כולסטרול-HDL (cHDL) ממלא תפקיד סיבתי בהתפתחות טרשת עורקים. עם זאת, גורם חשוב בשלבים המוקדמים של היווצרות הפלאק atheroma הוא היכולת בזרימת כולסטרול HDL (היכולת של חלקיקי ה-HDL כולסטרול מן מקרופאגים לקבל) על מנת למנוע היווצרות תאי קצף. זהו צעד המפתח הימנעות ההצטברות של כולסטרול של אנדותל, וחלק תעבורה כולסטרול הפוכה (RCT) כדי למנוע כולסטרול דרך הכבד. קיבולת בזרימת הכולסטרול בסרום או פלזמה במודלים macrophage התא הוא כלי מבטיח זה יכול לשמש סמן עבור טרשת עורקים. באופן מסורתי, [3H]-כולסטרול כבר בשימוש מבחני בזרימת כולסטרול. במחקר זה, אנו שואפים לפתח אסטרטגיה מהירה ובטוחה באמצעות פלורסנט מתויג כולסטרול (הכולסטרול-להארכה) ב וזמינותו הסלולר לאתר את ספיגת הכולסטרול ותהליכי בזרימת ב מקרופאגים THP 1-נגזר. לבסוף, אנו לייעל, לתקנן את שיטת בזרימת להארכה-כולסטרול ולפתח ניתוח תפוקה גבוהה באמצעות לוחות 96-ובכן.
מבוא
לפי ארגון הבריאות העולמי, הגורמים העיקריים הנוכחי למוות ברחבי העולם הם מחלת לב איסכמית וקו (חשבונאות עבור סכום כולל של 15.2 מיליון מקרי מוות)1. שניהם נמצאים מחלות לב וכלי דם (CVD) זה יכול להיות קדמו טרשת עורקים, שבר atheroma הפלאק של כלי הדם2,3.
טרשת עורקים היא כלי קיר דלקתיות מחלה שבה מקרופאגים, תאי T, תאי פיטום, תאים דנדריטים לחדור את אנדותל ולצבור מהדם, בסופו של דבר ויוצרים הפלאק טרשת עורקים. שלטי טרשת עורקים מציגים ליפופרוטאין קריסטלים הליבה וכולסטרול, שמעידים ברזולוציה גבוהה B-מצב בדיקת אולטרה סאונד מדידות של4,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
במחקר זה, אישור ועדה אתית (Comitè Ètic d'Investigació קליניקה, חולים במרפאה, ברצלונה; מספר אישור HCB/2014/0756), הודיע בכתב הסכמת כל הנושאים התקבלו.
1. כולסטרול להארכה הכנה
- להמיס את להארכה הכולסטרול (MW 494.63; ראה טבלה של חומרים) אתנול טהור כדי להשיג את המניה (2 מ מ). בשביל בקבוקון 10 מ ג, לפזר את תוכן כל בקבוקון באמצעי אחסון 10.1 מ"ל אתנול לרכוש מניה 2 מ מ.
- לדלל את להארכה-כולסטרול מן המלאי ב- 1640 RPMI בתוספת 10% עוברית שור סרום ו-5% פניצילין/סטרפטומיצין (R10 בינוני) כדי להגיע ריכוז סופי של 5 μM (למשל, לקבל 10 מ של כולסטרול להארכה ב 5 הריכוז הסופי μM) על ידי דילול μL 25 מניות להארכה-כולסטרול (....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
המטרה של כולסטרול בזרימת וזמינותו היא לקבוע במבחנה את הקיבולת בזרימת כולסטרול סרום נתון, פלזמה, או תגובת שיקוע המכיל חלקיקי ה-HDL. השיטה מורכבת loading כולסטרול מתויג תרבות של קו תא מקרופאג סטנדרטי שייצור קשר עם הדגימה הבדיקה מדולל FBS ללא מדיה עם התאים. בסופו של דבר, רמות פלורסנט להארכה נמדדים תא lysate וכלי תקשורת. כדי למטב את המידות, רמת הכולסטרול effluxed מתאי למדיה מעורבב עם אמצעי אחסון אחד החומר הממיס המכיל אתנול. להארכה-הכולסטרול בתאי שנותרה היא resuspended לתוך הממס המכיל אתנול או דטרגנט לפני מדידות. לבסוף, נקבע .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מתויג פלורסנט כולסטרול היא אסטרטגיה מבטיח לנתח ולחקור את המאפיינים ואת חילוף החומרים של הפריה טבעי כולסטרול. היתרונות העיקריים שלה הם כי זה שאפשר לקחת על ידי תאים, מאפשר תאיים ולימודים ממברנה הפצה, ולא ניתן להחיל על כולסטרול בזרימת מבחני כגון פרוטוקול זה (איור 7). בתחום ה סטרולים מתויג פלורסנט מסוימים מאפשרים כולסטרול מעקב גופית כולל BODIPY-כולסטרול, כולסטרול dansyl, dehydroegrosterol ו- 22 ו- 25-להארכה-כולסטרול12. במיוחד, 22-להארכה-כולסטרול מתאים ללמוד dynamics כולסט.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים רוצה להצהיר כי הם הממציאים של הבקשה לרישום פטנט (EPO; 18382337.6-1118; 17 במאי 2018) זכאי "שיטה לקביעת בזרימת כולסטרול" המבוסס על שיטה זו.
תודות
עבודה זו היא נתמכה חלקית על ידי המחקר מעניקה FIS (PS12/00866) מ אינסטיטוטו דה סאלוד קרלוס השלישי, מדריד, ספרד; Fondo Europeo פארא el Desarrollo אזוריים (פדר); אדום de Investigación en סידה (RIS), ISCIII-RETIC (RD16 0025 0002) ותוכנית סרקא / Generalitat דה קטלוניה. המחברים תודה את Retrovirology ואת המעבדה Immunopathology ויראלי של d'Investigacions אינסטיטוט Biomèdiques אוגוסט Pi I Sunyer (IDIBAPS). אנו מודים Escribà ט Rovira ג, ג הורטדו סיוע, Cufí ס מ הידע ואת טכנולוגיית העברת המשרד להדרכה שלה בהגנה על ההמצאה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צלחת איסוף 96 בארות | Corning Inc | Costar 3912 | צלחת לבנה 96 בארות עם תחתית אטומה שקופה |
| 96 בארות צלחת | קורנינג בע"מ | Costar 3610 | צלחת לבנה 96 בארות עם תחתית שטוחה שקופה |
| ערכת בדיקת פליטת כולסטרול (מבוססת תאים) | Abcam | ab196985 | ערכת בדיקה מסחרית מבוססת תאים בתפוקה גבוהה שמטרתה לקבוע את כולסטרול אפלוקס |
| חסר צבע RPMI 1640 | סיגמא-אולדריץ' | R7509 | RPMI 1640 ללא פנול-אדום |
| Gen5 תוכנת ניתוח נתונים | BioTek | גרסה 2.0 | |
| גליצין | סיגמא-אולדריץ' | G8790-100G | גליצין, לשימוש שאינו בבעלי חיים |
| לומינומטר | Biotek | SYNERGY HT | Multi-Detection Microplate |
| Reader פתרון ליזה 1 | 50 מ"מ Tris Buffer, 150 מ"מ NaCl ו-H2O | ||
| תמיסת ליזה | בבית | אתנול טהור ותמיסת ליזה תאים 1:1 (v:v) | |
| NBD-כולסטרול | Thermo-Fisher | N1148 | 22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | חוצץ פוספט מי מלח |
| PEG 8000 | סיגמא-אולדריץ' | 202452-250 גרם | פוליאתילן גליקול |
| PMA | סיגמא-אולדריץ' | 79346 | פורבול 12-מריסטייט B-אצטט. |
| R10 | RPMI 1640 בתוספת 10% סרום בקר עוברי ו-5% פניצילין/סטרפטומיצין. | ||
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | RPMI 1640 עם 2 מ"מ L-גלוטמין המכיל 1.5 גרם/ליטר נתרן ביקרבונט ו-4.5 גרם/ליטר תאי |
| THP-1 | סיגמא-אולדריץ' | ATCC, | קו דמוי מונוציטים #TIB-202 שמקורו בלוקמיה מתינוק בן שנה |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 |
מקורות
- The top 10 causes of death. , Available from: http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death (2018).
- Hansson, G. K., Hermansson, A. The immune system in atherosclerosis. Nature Immunology. 12 (3), 204-212 (2011).
- Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
