מאמר שיטה

ליפוזום יחיד מדידות לצורך המחקר של משאבות פרוטונים אנזימים ממברנה בעזרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי אלקטרוכימיה

7.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/58896

⸱

21 בפברואר 2019

 ,  , 
1School of Biomedical Sciences & the Astbury Centre for Structural Molecular Biology, University of Leeds, 2Department of Chemistry and Nano-Science Center, University of Copenhagen

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללמוד את המנגנון המולקולרי של פרוטון רוברטסונית על פני הממברנות השומנים של ליפוזומים יחיד, ציטוכרום בו3 כדוגמא. שילוב אלקטרוכימיה, מיקרוסקופיה פלורסצנטיות, pH לשינויים לומן של שלפוחית אחת, המכילה יחיד או אנזים מרובים, ועוזרת שנותחו בנפרד.

תקציר

משאבות פרוטונים אנזימים של אלקטרון העברה שרשראות כמה תגובות חמצון-חיזור פרוטון רוברטסונית על פני הקרום, יצירת כוח המניע-פרוטון לייצור ATP. מהות קרום חלבונים amphiphilic דורש תשומת לב מיוחדת לטיפול שלהם, שיחזור לסביבה הטבעית השומנים היא הכרחית עבור לומדים תחבורה תהליכים קרום כמו טרנסלוקציה פרוטון. כאן, אנחנו פירוט שיטת שימש במשך החקירה של מנגנון משאבות פרוטונים של קרום אנזימים חמצון-חיזור, לוקח ציטוכרום בו3 Escherichia coli כדוגמה. שילוב של מיקרוסקופיית אלקטרוכימיה, קרינה פלואורסצנטית משמש כדי לקבוע את מצב חמצון-חיזור quinone בריכה וצג pH השינויים לומן. בגלל שהרזולוציה המרחבית של מיקרוסקופ פלואורסצנטי, מאות ליפוזומים ניתן למדוד בו זמנית בעוד התוכן האנזים וניתן לשנותם אנזים יחיד או טרנספורטר לכל ליפוזום. ניתוח האנזים יחיד המתאימים יכול לחשוף דפוסים הדינמיקה פונקציונלי של אנזים זה ייתכן אחרת מוסתר על ידי ההתנהגות של כלל האוכלוסייה. אנו כוללים תיאור של קובץ script עבור ניתוח תמונות אוטומטית.

מבוא

מידע על מנגנונים אנזים וקינטיקה מתקבלת בדרך כלל על אנסמבל macroscale הרמה או עם אנזים אוכלוסייה באלפים מיליוני מולקולות, כאשר מידות מייצגים ממוצע סטטיסטי. זה ידוע, עם זאת, כי מקרומולקולות מורכבים כמו אנזימים עשוי להדגים הטרוגניות בהתנהגות שלהם, המנגנונים המולקולריים נצפתה רמה אנסמבל אינם בהכרח חוקיים עבור כל מולקולה. כזה סטיות בסולם מולקולה בודדת בהרחבה אושרו על ידי מחקרים של אנזימים יחיד עם מגוון רחב של שיטות המתעוררים במהלך שני העשורים האחרונים1. ראוי לציין, קרינה פלואורסצנטית גילוי של פעילות אנזים בודדים שימש לחקור הטרוגניות של אנזימים-פעילות-2,-3 או לגלות את אפקט זיכרון כביכול (תקופות של פעילות אנזימים גבוהה על ידי תקופות של לחץ נמוך פעילות ו ולהיפך)4,5.

מחקרים אנזים יחיד רבים דורשים כי האנזימים הם ותשמרו על פני השטח או קבוע במרחב בדרך אחרת להישאר מספיק זמן שם שדה הראייה להשגחה מתמדת. אנזים אנקפסולציה בתוך ליפוזומים הוכח להפעלת האנזים הנייח תוך מניעת כל השפעה שלילית בשל פני השטח-אנזים או חלבון אינטראקציות6,7. בנוסף, ליפוזומים מציעים אפשרות ייחודית ללמוד חלבוני ממברנה אחת שלהם השומנים הטבעיים bilayer הסביבה8,9,10.

מחלקה של קרום חלבונים, מובילים, תרגילים התקה כיוונית של חומרים על פני קרום התא, התנהגות שניתן רק ללמוד כאשר חלבונים הם מחדש לתוך השומנים bilayers (למשל, ליפוזומים)11, 12,13. לדוגמה, רוברטסונית פרוטון, הוצגו על ידי מספר אנזימים רשתות תחבורה אלקטרון prokaryotic ו האיקריוטים, ממלא תפקיד חשוב בנשימה תאית על ידי יצירת כוח המניע-פרוטון המשמש סינתזת ATP. במקרה זה, פרוטונים שאיבה פעילות זה משולב כדי העברת אלקטרונים, למרות מנגנון מפורט של תהליך זה לעיתים קרובות נותרת חמקמקה.

לאחרונה, להדגים את האפשרות זיהוי פלורסנט זוג עם אלקטרוכימיה ללמוד פרוטון שאיבה פעילות של אנזימים יחיד של מסוף ubiquinol אוקסידאז של Escherichia coli (ציטוכרום בו3) מחדש ליפוזומים14. . זה הושג על-ידי ומגעים צבע אטום-ממברנה רגיש pH פלורסנט לתוך לומן של ליפוזומים מקריסטלים של אי coli ליפידים קוטביים (איור 1 א'). כמות חלבון אופטימלי כך רוב ליפוזומים הכיל גם מולקולת אנזים משוקם אין או אחד בלבד (על פי התפלגות פואסון). שני מצעים של ציטוכרום בו3 נמסרו על-ידי הוספת ubiquinone לתערובת השומנים שיצרו ליפוזומים וחמצן (הסביבה) בתמיסה. ליפוזומים הם מכן בדלילות הספוחה על שקוף למחצה ultra-חלקה זהב אלקטרודה, מכוסה טפט שהורכב עצמית של 6-mercaptohexanol. לבסוף, האלקטרודה נטענה על החלק התחתון של תא spectroelectrochemical פשוטה (איור 1B). שליטה אלקטרוכימי של המדינה quinone בריכת חמצון-חיזור מאפשר אחד בגמישות להפעיל או להפסיק את התגובה אנזימטי בכל רגע, בעוד לצבוע רגיש pH משמשת כדי לעקוב אחר השינויים pH בתוך לומן של ליפוזומים כתוצאה פרוטון רוברטסונית מאת אנזימים. על-ידי שימוש ניתן לקבוע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית השני, השומנים מכורך הפלורסנט, גודל ונפח של ליפוזומים בודדים ובכך כימות של אנזים פרוטון שאיבה פעילות. בעזרת טכניקה זו, ובייחוד מצאנו כי ציטוכרום בו3 מולקולות מסוגלים להיכנס למצב הדליפה ספונטנית כי כלתה במהירות את הכוח המניע של פרוטון. המטרה של מאמר זה היא להציג את הטכניקה של ליפוזום יחיד מדידות בפירוט.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת תערובת ליפיד/UQ-10/FDLL

הערה: אי קולי ליפידים המשמש עבור ההכנה של ליפוזומים צריך להיות aliquoted ולערבב היטב עם ubiquinone-10 (סובסטרט) ושומנים ארוך באורך הגל פלורסנט התווית על-ידי צבע (לקביעת גודל ליפוזומים) לפני שיחזור.

  1. באמצעות מזרק זכוכית, µL 200 העברה של כלורופורם מלאי של ליפידים קוטביים לחלץ מ- Escherichia coli (25 מ"ג/מ"ל) לתוך מבחנות זכוכית לעשות 5 מ"ג aliquots.
  2. להוסיף 50 µL של 1 מ"ג/מ"ל ubiquinone-10 (UQ-10; ב כלורופורם) כדי ליפידים כדי להפוך את היחס הסופי של UQ-10: ליפידים בטחונות (1% w/w).
  3. הוסף 20 µL של 1 מ"ג/מ"ל (0.4% w/w) של זמן באורך הגל פלורסנט התווית על-ידי צבע ליפופרוטאין (FDLL) לתערובת ליפידים/UQ-10.
  4. Homogenize הפתרון כלורופורם מאת vortexing קצר, מתאדים רוב הכלורופורם תחת זרם עדין חנקן או ארגון. להסיר את עקבות כלורופורם לחלוטין על-ידי אידוי נוספות תחת ואקום במשך לפחות שעה.
    הערה: השומנים aliquots ניתן לאחסן תחת אווירה אינרטי ב-20 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים.

2. שיחזור של ציטוכרום בו3

הערה: עבור הטיהור של ציטוכרום בו3 מ- e. coli, בצע את הפרוטוקול מ Rumbley ואח. 15 כדי להבטיח טוהר גבוהה של האנזים מקופלת מקורי דגימות, הוסף גודל הוצאת גזים לאחר השלב טיהור זיקה מתוארת על ידי. Rumbley et al. 15

  1. הוסף µL 312.5 של 40 מ מ מגבים-קו/60 מ מ K2כדי4, pH 7.4, כדי aliquot אחד של ליפידים/UQ-10/FDLL יבשים לערבב (5 מ"ג, שלב 1.4) ומערבבים עם מערבולת עד הסרט השומנים מלא resuspended, ואחריו 2 דקות של טיפול באמבט אולטראסוני.
  2. הוסף µL 125 של 25 מ מ 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic חומצה (HPTS), רגיש pH הפלורסנט שצריך להיות אנקפסולציה בתוך ליפוזומים.
  3. להוסיף 137.5 µL של n-אוקטיל-250 מ מ β-D-glucopyranoside (בווידאו) חומרים פעילי שטח, לערבב בעזרת מערבולת, sonicate באמבט אולטראסוני מים למשך 10 דקות להבטיח שכל ליפידים הם solubilized לתוך חומרים פעילי שטח הקזאין. להעביר את הפיזור לתוך צינור פלסטיק 1.5 מ.
    הערה: מעונן השעיית שומנים צריך להיות שקוף לאחר solubilization עם חומרים פעילי שטח.
  4. להוסיף את הכמות הנדרשת של ציטוכרום בו3 (ראה להלן בהערה) ומוסיפים מים הנדסה גנטית כדי להפוך את הנפח הכולל של 50 µL (ציטוכרום בו3 פתרון בתוספת מים). דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות על מערבל רולר.
    הערה: טיפוסי כמות אנזים אחד התנאים הוא 0.1-0.2% (w/w חלבון-כדי-השומנים, כלומר-5 – 10 µg של חלבון), למרות זאת ניתן להגדיל עד 1-2% (50 – 100 µg של חלבון) אם המטרה היא לבחון רק הפעילות אלקטרוכימי (ראו להלן). כפקד שלילית, ניתן להכין ליפוזומים ללא ציטוכרום בו3 .
  5. שוקל 2 x 50 מ"ג ו 2 x 100 מ"ג של גרגרי פוליסטירן לתוך ארבע 1.5 mL-שפופרת כמוסות וסגור עם פרפין סרט כדי למנוע התייבשות.
    שים לב: לפני השימוש, גרגרי פוליסטירן יש לחפוף מתנול, מים ומאוחסנים מים לפי הוראות היצרן.
    הערה: אם תערובת מים/microbead, גרגרי פוליסטירן בנוחות ניתן להעביר את הכובע עם micropipette עם טיפ רחב. מים ואז ניתן להסיר את גרגרי באמצעות micropipette עם טיפ דק.
  6. הוסף אתst150 מ"ג של גרגרי פוליסטירן לתערובת הכינון (שלב 2.4) על-ידי חבישת הכיפה עם גרגרי פוליסטירן ברכבת התחתית 1.5 mL-פלסטיק עם פיזור וביצוע סיבוב קצר לכמה שניות. דגירה-4 מעלות צלזיוס על מערבל רולר עבור גרגרי פוליסטירן לספוח את חומרים פעילי שטח למשך 30 דקות.
    1. חזור על תחילתה של גרגרי פוליסטירן ו incubations כדלקמן: להוסיף 50 מ"ג של גרגרי למשך 60 דקות של דגירה; להוסיף 100 מ ג של גרגרי למשך 60 דקות של דגירה; ולהוסיף 100 מ ג של גרגרי במשך 120 דקות של דגירה.
      הערה: הפתרון מעל גרגרי שיוחסו יהפוך שקוף במהלך שלב 2.6 כפי proteoliposomes נוצרות.
  7. להפריד את הפתרון proteoliposome גרגרי פוליסטירן באמצעות micropipette עם טיפ דק. לדלל את הפיזור של 90 מ של 20 מ מ מגבים-קו/30 מ מ K2אז4, pH 7.4 (מאגר MOPS) להעביר צינור ultracentrifuge Ti45.
  8. Ultracentrifuge הפיזור באמצעות סוג 45 Ti הרוטור-125,000 g x (ב- rמקסימום) עבור h 1 כדי הצניפה את proteoliposomes.
    הערה: צינורות צנטריפוגה קטנים יותר ניתן להשתמש למרות הדילול בכרך מאגר גדול מסייעת להפחית את ריכוז HPTS שאינו כמוס ההשעיה הסופי.
  9. למחוק את תגובת שיקוע, לשטוף את כדורי עם 20 מ מ מגבים-קו/30 מ מ K2כדי4, pH 7.4 מאגר (ללא resuspending בגדר). לאחר השמטת המאגר השטיפה, מחדש להשעות את proteoliposomes ב µL 500 MOPS מאגר מאת pipetting זה הלוך ושוב עם קצה דק micropipette. ואז להעביר צינור פלסטיק 1.5 מ.
  10. Centrifuge המתלה למשך 5 דקות ב g x 12,000 לפנות את הפסולת. להעביר את תגובת שיקוע (proteoliposomes משוקם) לתוך בקבוקון חדש.
  11. פיזור proteoliposomes משוקם ב 4 ° C בלילה לאחסן ולהשתמש תוך יומיים.

3. ייצור של אלקטרודות זהב שקוף למחצה

הערה: חלק משטח זהב מתקבל על ידי שיטה הפשטת תבנית 30 ננומטר בעובי שכבה של זהב 99.99% פרוסות סיליקון מאגרי חלקה. עובי השכבה זהב קטנים חשוב מכיוון שזה חייב להיות שקופה למחצה כדי לאפשר הבחנה קרינה פלואורסצנטית. הפרטים של זהב אידוי (בתצהיר אדים הפיזי, PVD) ניתן למצוא במקום אחר16 , והוא היחיד תבנית-בנוכחות אחר מכוסה כאן. לחלופין, שבבי זהב ultra-חלקה ניתן לרכוש במקום אחר (ראה טבלה של חומרים).

  1. דבק עד 9 תלושי כיסוי זכוכית (0.17 מ מ עובי) על גבי משטח זהב המתאיידים באמצעות נמוך-זריחה דו קומפוננט. לרפא את הדבק ב 80 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות.
  2. לפני השינוי עם עצמי שהורכב חד שכבתי (שלב 4), לנתק את פתקי כיסוי זכוכית מ סיליקון עם להב. עקב דלילות שער גולשת, להיזהר בעת ניתוק של שער גולשת לא סדק או לשבור את השקופיות זכוכית.

4. שינוי פני השטח זהב עם עצמי שהורכב חד שכבתי (SAM)

  1. להכין 5 מ של תמיסת מים 1 מ 6-mercaptohexanol (6MH).
  2. טבלו מנותקת טרי מצופה זהב שער גולשת (שלב 3.1) 6MH פתרון ולהשאיר 20 – 25 ° C בלילה (> 16 h) כדי ליצור את סאם.
    הערה: פתרונות תיול יש ריח לא נעים, כך לכלי סגור אמור לשמש כאשר המקננת בתגית מכסה מצופה זהב.
  3. למחרת, הסר תגית מכסה מצופה זהב הפתרון 6MH, לשטוף בקצרה עם מים או מתנול ולאחר מכן עם אלכוהול איזופרופיל. יבש תחת זרם הגז עדינה.

5. אלקטרוכימי בדיקה של פעילות Proteoliposomes

הערה: הפעילות אלקטרוכימי של האנזים קודם מאומתים בשכבה ליפוזומים צפופים (שלב 5), הכיסויים שלפוחית התחתון נמצאים בשימוש שלפוחית אחת ניסוי למדידת pH לשינויים לומן של ליפוזומים (שלב 6).

  1. להרכיב בתגית מכסה מצופה זהב בתא אלקטרוכימי-ספקטרו (ראה איור 1). ליצור קשר למדליית הזהב עם חוט שטוחה מחוץ לאזור המוגדר על-ידי קונדום o-ring.
  2. להוסיף 2 מ"ל של הפתרון מאגר אלקטרוליט, הצב את הפניה ואלקטרודות עזר בתא.
    הערה: כל עוד דנו במקטע דיון, הפניות אלקטרודות ללא כלוריד המועדפות כדי למנוע היווצרות Au (I) לקלרנית במהלך אלקטרוכימיה. הנה, כספית/Hg2אז4 (ישב. K2אז4) אלקטרודה הפניה משמשת ניתנת פוטנציאל לעומת אלקטרודת מימן סטנדרטי (היא) באמצעות V 0.658 vs היא כספית/Hg2אז4 (לווייני. K2אז4).
  3. להפעיל עכבה אלקטרוכימי ספקטרוסקופיה (0.1 הרץ – 100 kHz)-תאים פתוח פוטנציאליים את הפוטנציאל (מכ) כדי להעריך את האיכות של סאם. להמיר ערכי עכבה בקבלה, לחלק ב- 2πω כדי לתכנן מזימה קול-קול, איפה ω התדירות (ראה להלן הפניות16,17,18 לקבלת פרטים אודות המרת ופרשנות עכבה ספקטרה).
    הערה: סאמס דחוס וצפוף של 6MH צריך לתת קרוב לחלקה קול-קול חצי עיגול, לתת קיבוליות ערכים בטווח 2.5 – 3.0 µF/cm2 (איור 2 א). אם סטייה משמעותית צורת חצי עיגול או קיבול מחוץ לטווח הערכים מתקבלים, לשנות את האלקטרודה.
  4. לרוץ voltammograms מחזורית ריק (CVs) עם סריקה המחירים 100 ו- 10 mV/s באזור פוטנציאליים-0.3 – 0.8 V. קורות חיים אופייני מוצג על (איור 2B, קו מקווקו).
    הערה: זה צריך להפגין התנהגות קיבולי כמעט טהור, היעדרות של זרם faradaic משמעותית, אפילו בתנאים חמצן סביבתי משמש כאן.
  5. להוסיף סוללת proteoliposomes (ריכוז ליפידים סופי 0.5 מ"ג/מ"ל, 1-2% (w/w) יחס ציטוכרום בו3 השומנים) ומערבבים מעט עם פיפטה. המתן עד ספיחה של proteoliposomes על פני האלקטרודה סיים (30-60 דקות בטמפרטורת החדר).
    הערה: ניתן להפעיל voltammograms מחזורית (CVs) ב mV 10/s במהלך ספיחה proteoliposomes לעקוב אחר התהליך. ספיחה מסתיים כאשר CVs רצופים תפסיקי להחליף. מידע על טכניקות קורות חיים ניתן למצוא בספרי הלימוד הבאות. 19 , 20
  6. לשטוף את התא על-ידי שינוי את בופר לפחות 10 פעמים אך להימנע מלהשאיר את השטח אלקטרודה יבש לחלוטין.
  7. הפעל את ספקטרוסקופיית עכבה אלקטרוכימי ג'ונס (איור 2 א, קו כחול) כדי לאשר שסאם על האלקטרודה זהב נותרת ללא שינוי ולסרוק CVs עם המחירים 10 ו- 100 mV/s להתבונן חמצון הקטליטי ubiquinol (וצמצום חמצן) על ידי ציטוכרום בו 3 -תחילת פוטנציאל של הפחתת quinone אלקטרוכימי על V 0 לעומת היא) (איור 2B).

6. זיהוי של פרוטון אנזימטי שאיבה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ

  1. לשנות את האלקטרודה זהב כמו שלב 5 אבל באמצעות 100 x פחות proteoliposomes לעומת שלב 5.5 (קרי, µg 5/mL). ללימודים אנזים יחיד, להפחית את לבושל ציטוכרום3 יחס השומנים 0.1-0.2% (w/w).
    הערה: ליפוזומים דלילי לספוח על פני האלקטרודה הפעלת שלפוחית אחת פיקוח על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. בתנאים אלה יחיד-אנזים, כמות האנזים ותשמרו על פני האלקטרודה אינה מספיקה עבור הצפיה זרם קטליטי.
  2. מניחים את סוללת על המטרה שמן (60 X) של מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוך עם טיפת שמן טבילה. באמצעות המסננים המתאימים עבור FDLL פלורסצנטיות, מתמקדים פני האלקטרודה. ליפוזומים יחיד צריך להופיע כתמים בהירים על גבול עקיפה המטרה/המיקרוסקופ. קח תמונה של זריחה FDLL.
  3. לעבור אחת מערכות סינון קרינה פלואורסצנטית HPTS על מיקרוסקופ כדי לוודא כי HPTS הוא ברור לעין, שקירב הרקע (זמן חשיפה שבחרת, ראה שלב 6.4). להגביר את עוצמת האור, אם זה לא המקרה.
  4. לתכנת את התוכנה מיקרוסקופ כדי לבצע ייבוא תמונות מתוזמן של לסירוגין שתי מערכות סינון HPTS (תפריט יישומים | Define/Run רכישת ND). הגדרת ההשהיה בין התמונה רכישות לכל הפחות. בניסוי זה, השתמש חשיפה של 1 ו- 0.3 s עיכוב (עקב תנועת צריח).
    הערה: היחס בין עוצמות קרינה פלואורסצנטית-אלה שני ערוצים מאוחר יותר יומרו ל pH בתוך ליפוזומים בכל נקודה בזמן. משך הזמן של הרכישה יכולה להשתנות לפי שער שינוי pH הצפוי; 5 דקות משמשת במאמר זה.
  5. התאם את ההגדרות של potentiostat כדי לשנות את הפוטנציאל במהלך רכישת התמונה. לדוגמה, בניסוי זה, להשתמש ברצף הבא: 0 – 60 s: אין פוטנציאל חלה (דהיינו עיקרון פתיחות/סגירות); 60 – s: 180-0.2 V (לעומת היא); 180-s: 300 0.4 V (לעומת היא). במקרה זה, רק פוטנציאל יישומי בשלב השני (-0.2 V vs היא) מספיקה ביעילות להפחית לבריכה quinone.
  6. להפעיל בו זמנית את רכישת תמונות מתוזמן (מיקרוסקופ) ואת הרצף פוטנציאליים (potentiostat) מאת באופן ידני החל שתי מדידות באותו זמן.
    הערה: הניסוי שיכול לחזור על האלקטרודה באותו הזמן מספר על-ידי הזזת השלב מיקרוסקופ לאזור אחר על פני השטח. ההשהיה בין הרכישות צריך להיות לפחות 5-10 דקות כדי להבטיח equilibration pH מלאה של ליפוזומים על פני השטח. ניתן להחיל משכים שונים ודפוסי פוטנציאליים בהתאם הצורך, למרות הדמיה זמן מוגבל בשל photobleaching של HPTS במהלך הרכישה.

7. ניתוח של תמונות קרינה פלואורסצנטית

הערה: ניסוי טיפוסי מייצרת קבוצת תמונות בצעד זמן (למשל, 2.6 s) עבור כל אחד בין שני הערוצים, קרי, (משך * 2 / 2.6) תמונות. דוגמה כזו תמונה להגדיר שהוקלט במהלך ניסוי אנזים יחיד ניתן לגשת דרך מאגר מחקר נתונים לידס21. טיפול תמונה כוללת מספר שלבים באמצעות פיג'י (ImageJ) של אנליזה מתמטית ברמה גבוהה תכנות תוכנה לעברית (מעתה ואילך המכונה כמו scripting תוכנה, לפרטים, ראה טבלה של חומרים ).

  1. השתמש פיג'י להפריד זמן לשגות קובץ, ליישר תמונות ולשמור ערוצים נפרדים, מסגרת זמן.
    1. פתוח זמן לשגות קובץ באמצעות היבואנית Bioformats שרשמת פיג'י (פקודת מאקרו: לרוץ ("יבואן ביו-תבניות")).
    2. להשתמש את התוסף StackReg כדי ליישר כל מסגרת הראשונה על הבמה אפשרי תנועות או להיסחף תרמי אירעה במהלך רכישת (פקודת מאקרו: לרוץ ("StackReg", "שינוי = תרגום")).
    3. לשמור קבצי תמונה לא דחוסה נפרד עבור כל ערוץ, כל שלב זמן בתבנית TIFF בתוך תיקייה אחת.
    4. לחלץ את חותמות הזמן המדויק לכל אחת מהמסגרות המטא זמן לשגות קובץ ולשמור אותם כקובץ CSV באותה תיקיה כשל התמונות. לחלופין, חלץ חותמות זמן באמצעות רכישת תוכנה ולשמור ידנית לתוך קובץ CSV באמצעות תוכנת הגיליון האלקטרוני.
      הערה: התיקייה עם תמונות וחותמות זמן עכשיו הוא מוכן להיות מנותח על ידי תוכנת ה-scripting. צעדים 7.1.1. – 7.1.4. יכול להיות automatized באמצעות סקריפט פיג'י (קובץ script שנכתב ב פיתון עבור עיבוד אצווה של זמן לשגות קבצים ניתנת, להשתמש "Ctrl-Shift-N" (ב- Windows), אז קובץ | פתוח כדי לטעון את קובץ ה-script).
  2. השתמש בתוכנת ה-scripting עבור עיבוד automatized של התמונות. לטעון את קוד שסופק על התוכנה ולחצו על רוץ עד הסוף. כאשר תתבקש, בחר את התיקיה המכילה את התמונות מ שלב 7.1.
    הערה: קובץ script עבור ניתוח מסופק בתבנית mlx התסריט בשידור חי, עם הערות נרחבות, כדי לזהות ליפוזומים יחיד, להתאים אותם לתפקד 2D-Gaussian, לסנן אותן ולכמת את ערכי ה-pH בכל נקודה של זמן. תת השלבים הבאים מתבצעות באופן אוטומטי על-ידי קובץ ה-script.
    1. לטעון כל הזמן מסגרות תמונות עבור ניסוי יחיד לתוך הזיכרון.
    2. ממוצע של כל התמונות עבור ערוץ אחד (בחר הערוץ עם עוצמת קרינה פלואורסצנטית הגבוהה ביותר), להשתמש בתמונה בממוצע כדי לזהות ערכים מרביים כל זה עשויה להתאים ליפוזומים יחיד.
    3. התאם ערכים מרביים שזוהה על התמונה בממוצע כדי 2D-Gaussian לתפקד ולהציל את הביא מתאים פרמטרים עבור כל ליפוזום (ראה איור 4A לדוגמה ליפוזום מצויד).
    4. לסנן את ערכים מרביים על פי הקריטריונים הצפוי ליפוזומים יחיד, כגון גודל, מעגליות ועוצמה. דחה ליפוזומים זה הינם מצוידים היטב בשל אות נמוכה לרעש, מקרוב השכנה ליפוזום או גם להיות קרוב לקצה התמונה.
    5. לטעון את חותמות הזמן של הקובץ החיצוני ובכושר כל ליפוזום המסונן לפונקציה 2D-gaussian על כל תמונה מסגרת זמן בנפרד.
      הערה: השימוש תכנות מקבילי בריבוי ליבות CPU יכול לשפר באופן משמעותי את מהירות החישוב בשלב זה.
    6. לסנן ליפוזומים שוב על פי הקריטריונים דומים כמו שלב 7.2.4 אבל שימושית לכל מסגרת זמן.
    7. על כל צעד הזמן, להגדיר יחס עוצמת קרינה פלואורסצנטית ליפוזום כיחס של כרכים המוקפים פונקציית 2D-Gaussian מצויד בשני ערוצים. לחשב את ערכי ה-pH של היחס בין עוצמות מחילופי בין שני הערוצים HPTS ושימוש עקומת כיול (שלב 8). מגרש עקומות זמן-pH שהתקבל עבור ליפוזומים ולצפות pH שלהם לשנות הפוטנציאל מוחל.

8. ביצוע עקומת כיול של זריחה HPTS

הערה: כדי להמיר HPTS קרינה פלואורסצנטית יחס pH intravesicular, עקומת כיול תחילה יש ליצור, זה ייקח בחשבון מסוים התנאים של ניסויים כגון זהב להדמיה, מסנני איכות, וכו '. שלב זה חייב להתבצע רק פעם או פעמיים, נתוני הכיול יכול לשמש כל עוד הפרמטרים המדידות וההתקנה נשארים זהים בשלב 6.

  1. להכין אלקטרודה עם בדלילות הספוחה ליפוזומים (ללא ציטוכרום בו3 כפי שמתואר שלבים 5 ו- 6.1).
  2. להוסיף 2 µL של פתרון gramicidin 0.1 מ"ג/מ"ל אתנול 2 מ"ל המאגר כדי ליצור את ריכוז 100 ננוגרם למ"ל.
  3. לכידת שתי תמונות פלורסצנטיות עבור הערוצים HPTS שני.
  4. לשנות את ה-pH של התא על-ידי תוספת של aliquots קטן של 1 מ' HCl או 1 מ' H2אז4. למדוד את רמת החומציות של המאגר עם מד pH הרגיל, ללכוד שתי תמונות פלורסצנטיות עבור הערוצים HPTS שני.
  5. חזור על שלבים 8.4 עבור טווח pH 6-9.
  6. בעזרת האלגוריתם מ- 7.2, להתאים, לסנן, לחשב את היחס הממוצע של זריחה HPTS של ליפוזומים בודדים ב- pH בכל. להשתלט על יחס HPTS הממוצע על כל ליפוזומים.
  7. מתאים את התלות יחס pH-וכתוצאה מכך את המשוואה הבאה:
    figure-protocol-1, איפה pK, R ו- Rbרבות פרמטרים.
  8. השתמש pK, R ו- Rbכדי להמיר את היחס HPTS של ליפוזומים בודדים בשלב 7.2.7. ערכי ה-pH.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

האיכות של תגית כיסוי זהב-לאחרונה (האלקטרודה) עם סאם של 6MH נבדק לפני כל ניסוי עם עכבה אלקטרוכימי ספקטרוסקופיה. איור 2A מראה נציג קול-קול חלקות שנמדדו בשימוש עכבה אלקטרוכימי ספקטרוסקופיה לפני ואחרי ליפוזומים הם הספוחה. אם האיכות של סאם מספיקה, ספקטרוסקופיה עכבה צריך להפגין התנהגות קיבולי כמעט טהור וכתוצאה מכך מגרש קול-קול חצי עיגול. הקוטר של מעגל חצי מגרש קול-קול שווה את קיבול שכבה כפולה של המשטח אלקטרודה, אשר צריכה להיות בטווח2 µF/ס מ 2.5-3.0. שימו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השיטה המתוארת מתאימה ללמוד פרוטון שאיבה על ידי חלבונים ממברנה הנשימה יכולה להיות מחדש לתוך ליפוזומים והם מסוגלים להחליף אלקטרונים עם הבריכה quinone. פרוטון שאיבה פעילות ניתן לנטר ברמת אנזים יחיד באמצעות צבעי רגיש pH (רציומטרי) במארז ליפוזום לומן (איור 1 א').

השיטה מתבססת על היכולת של ubiquinone (או קווינונס אחרים), שולבו על שכבה ליפידית, להחליף אלקטרונים עם אלקטרודות שופרת סאם18. המאפיינים של האלקטרודה זהב, שונה עם סאם, הן מאוד ספציפיות. לי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

המחברים להכיר את BBSRC (BB/P005454/1) עבור תמיכה כספית. מלון NH מומן על-ידי התוכנית חוקר צעיר קרן VILLUM.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
6-Mercapto-1-hexanol (6MH)Sigma 45108897%
8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid (HPTS)BioChemika56360
מחזיק אלומיניום (תא אלקטרוכימי)בהתאמה30x30x7 מ"מ; קוטר פנימי: 26 מ"מ; קוטר חור: 15 מ"מ
חוט פלטינהאלקטרודה
כלורופורםVWR כימיקלים83627
E.coli ליפידים קוטבייםAvanti100600C25 מ"ג/מ"ל בכלורופורם
אפוקסיEPO-TEK301-2FLאפוקסי פלואורסצנטי נמוך
פיג'י (ImageJ 1.52d)תוספים נדרשים: StackReg ו-TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)
קוביית מסנן ("ATTO633")Chroma Technology Corporationלדוגמה: 620/60 ננומטר; DM: 660 ננומטר; Em: קוביית סינון 700/75 ננומטר
("HPTS1")Chroma Technology CorporationEx: 470/20 ננומטר; DM: 500 ננומטר; Em: 535/48 ננומטר
קוביית סינון ("HPTS2")Chroma Technology CorporationEx: 410/300 ננומטר; DM: 500 ננומטר; Em: 535/48 ננומטר
קוביית סינון ("טקסס אדום")Chroma Technology CorporationEx: 560/55 ננומטר; DM: 595 ננומטר; Em: 645/75 ננומטר
שומנים עם תווית צבע פלואורסצנטי (FDLL)ThermoFisher ScientificT1395MPTexasRed-DHPC שימש בעבודה זו (λ exc 595 ננומטר; &למבדה; em 615 ננומטר)
ליפידים פלואורסצנטיים עם תווית צבע (FDLL) (אלטרנטיבה)ATTO-TECAD 633-161ATTO633-DOPE יכול לשמש כחלופה (λ exc 630 ננומטר; &למבדה; em 651 ננומטר)
עמוד סינון ג'לGE Healthcare28-9893-33HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, לטיהור חלבון נוסף
כיסויי זכוכיתVWR International631-0172No 1.5
מזרק זכוכיתהמילטון1725 RNR250 ומיקרו; L
בקבוקוני זכוכית מעבדותזכוכית מדעית בע"מT101/V1קיבולת 1.75 מ"ל
GoldGoodFellow99.99%
גרמאצידיןסיגמאG5002
כספית סולפט אלקטרודהייחוס רדיומטר (Hash)E21M012
מיקרוצנטריפוגהEppendorfMinispin NL040
מיקרוסקופNikonEclipse Ti
מיקרוסקופ מצלמהAndorZyla 5.5 sCMOS
מיקרוסקופ מנורתניקוןIntensilight C-HGFI
NIS-Elements AR 5.0.2ניקוןמיקרוסקופ רכישת תוכנה
n-Octyl β-D-glucopyranosideMelford LaboratoriesB2007
Nova 1.10Metrohmתוכנת בקרת פוטנציוסטט
מטרהNikonPlan Apo λ 60x/1.4 שמן
OriginPro 2017OriginLabתוכנת תכנון
אורינג (תא אלקטרוכימי)אורינוקוקוטר פנימי: 16 מ"מ; חתך רוחב: 1.5 מ"מ
צינורות פלסטיקEppendorf3810X1.5 מ"ל
מיקרו-חרוזי פוליסטירןBio-RAD152-3920Biobeads, 20-50 mesh
PotentiostatMetrohm AutolabPGSTAT 128N
PotentiostatCH InstrumentsCHI604C
תוכנת סקריפטיםMatlabR2017aארגזי כלים נדרשים: 'ארגז כלים לעיבוד תמונה', 'ארגז כלים למחשוב מקביל', 'ארגז כלים להתאמת עקומה', 'ארגז כלים לזיהוי מערכת', 'ארגז כלים לאופטימיזציה'פרוסות
סיליקוןIDB טכנולוגיות בע"מSi-C2 (N< 100>P)ואוסלאש; 25 מ"מ, תא טפלון בעובי 525 אום
(תא אלקטרוכימי)בהתאמהקוטר חיצוני: 26 מ"מ; קוטר פנימי: 13.5 מ"מ
משטחי זהב שטוחים במיוחד מופשטים במקדשPlatypus TechnologiesAU.1000.SWTSGמשטחי זהב שטוחים במיוחד מוכנים לשימוש חלופיים (עובי מתחת ל-100 ננומטר לפי דרישה)
קצות מיקרופיפטה דקיםSarstedt70.1190.100או טיפים דומים של Gelloader 200 ומיקרו; L
Ubiquinone-10SigmaC-9538
אולטרה-צנטריפוגהבקמן-קולטרL-80XPעם רוטור Ti 45
אמבט אולטרסאונדFisher ScientificFB15063
אישית עזר אישית

מקורות

  1. Claessen, V. I., et al. Single-Biomolecule Kinetics: The Art of Studying a Single Enzyme. Annual Review of Analytical Chemistry. 3 (1), 319-340 (2010).
  2. Rojek, M. J., Walt, D. R. Observing Single Enzyme Molecules Interconvert between Activity States upon Heating. PLoS ONE. 9 (1), e86224(2014).
  3. Velonia, K., et al. Single-Enzyme Kinetics of CALB-Catalyzed Hydrolysis. Angewandte Chemie International Edition. 44 (4), 560-564 (2005).
  4. Lu, H. P., Xun, L., Xie, X. S. Single-molecule enzymatic dynamics. 282 (5395), Science. New York, N.Y. 1877-1882 (1998).
  5. Engelkamp, H., Hatzakis, N. S., Hofkens, J., De Schryver, F. C., Nolte, R. J. M., Rowan, A. E. Do enzymes sleep and work? Chemical Communications. 9 (9), 935-940 (2006).
  6. Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 105 (48), 12165-12170 (2001).
  7. Hsin, T. -M., Yeung, E. S. Single-Molecule Reactions in Liposomes. Angewandte Chemie International Edition. 46 (42), 8032-8035 (2007).
  8. García-Sáez, A. J., Schwille, P. Single molecule techniques for the study of membrane proteins. Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (2), 257-266 (2007).
  9. Onoue, Y., et al. A giant liposome for single-molecule observation of conformational changes in membrane proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (6), 1332-1340 (2009).
  10. Jefferson, R. E., Min, D., Corin, K., Wang, J. Y., Bowie, J. U. Applications of Single-Molecule Methods to Membrane Protein Folding Studies. Journal of Molecular Biology. 430 (4), 424-437 (2018).
  11. Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. BBA - Bioenergetics. 1231 (3), 223-246 (1995).
  12. Jesorka, A., Orwar, O. Liposomes: Technologies and Analytical Applications. Annual Review of Analytical Chemistry. 1 (1), 801-832 (2008).
  13. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  14. Li, M., et al. Single Enzyme Experiments Reveal a Long-Lifetime Proton Leak State in a Heme-Copper Oxidase. Journal of the American Chemical Society. 137 (51), 16055-16063 (2015).
  15. Rumbley, J. N., Furlong Nickels, E., Gennis, R. B. One-step purification of histidine-tagged cytochrome bo3 from Escherichia coli and demonstration that associated quinone is not required for the structural integrity of the oxidase. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology. 1340 (1), 131-142 (1997).
  16. Jeuken, L. J. C., et al. Phase separation in mixed self-assembled monolayers and its effect on biomimetic membranes. Sensors and Actuators, B: Chemical. 124 (2), 501-509 (2007).
  17. Barsoukov, E., Macdonald, J. R. Impedance Spectroscopy Theory, Experiment, and Applications. , John Wiley & Sons. Chapters 1-2 (2005).
  18. Jeuken, L. J. C., Connell, S. D., Henderson, P. J. F., Gennis, R. B., Evans, S. D., Bushby, R. J. Redox Enzymes in Tethered Membranes. Journal of the American Chemical Society. 128 (5), 1711-1716 (2006).
  19. Compton, R. G., Banks, C. E. Chapter 4. Understanding voltammetry. , World Scientific Publishing Europe Ltd. Singapore. (2018).
  20. Girault, H. H. Chapter 10. Analytical and Physical Electrochemistry. , EPFL Press. Lausanne. (2004).
  21. Mazurenko, I., Jeuken, L. J. C. Timelapse (movie) of single vesicles fluorescence change upon potential application. , (2018).
  22. Li, M., Khan, S., Rong, H., Tuma, R., Hatzakis, N. S., Jeuken, L. J. C. Effects of membrane curvature and pH on proton pumping activity of single cytochrome bo3enzymes. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1858 (9), 763-770 (2017).
  23. Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. MATLAB code for the analysis of proton transport activity in single liposomes. , (2017).
  24. Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. Time-resolved fluorescence microscopic data (traces) of individual lipid vesicles with proton transport activity. , (2017).
  25. Paula, S., Volkov, A. G., Van Hoek, A. N., Haines, T. H., Deamer, D. W. Permeation of protons, potassium ions, and small polar molecules through phospholipid bilayers as a function of membrane thickness. Biophysical Journal. 70 (1), 339-348 (1996).
  26. Brookes, P. S., Hulbert, A. J., Brand, M. D. The proton permeability of liposomes made from mitochondria) inner membrane phospholipids: No effect of fatty acid composition. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1330 (2), 157-164 (1997).
  27. Eriksson, E. K., Agmo Hernández, V., Edwards, K. Effect of ubiquinone-10 on the stability of biomimetic membranes of relevance for the inner mitochondrial membrane. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1860 (5), 1205-1215 (2018).
  28. Seneviratne, R., et al. A reconstitution method for integral membrane proteins in hybrid lipid-polymer vesicles for enhanced functional durability. Methods. , 1-8 (2018).
  29. Veshaguri, S., et al. Direct observation of proton pumping by a eukaryote P-type ATPase. Science. 351 (6280), 1-6 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Cytochrome bo3pH HPTS

מאמרים קשורים