Microvascular תאי אנדותל של שרירי השלד (MMEC) לעצב את הדופן הפנימית של שריר נימים ולווסת את שניהם, חילופי נוזלים/מולקולות והעברה של תאים (חיסוניים) בין רקמת שריר, דם. בידוד של MMEC מאתר ראשי, כפי שמתואר כאן, מאפשר מקיף חקירות במבחנה של יחידת"myovascular".
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד של תאי אנדותל Microvascular ראשי שריר השלד מאתר
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
תאי אנדותל של הנימים שרירי השלד (microvascular אנדותל תאי שריר, MMEC) לבנות את המכשול בין זרם הדם שרירי השלד ויסות חילופי נוזלים, חומרים מזינים, כמו גם את התגובה החיסונית נגד זיהומיות סוכנים על ידי שליטה נדידת תאים חיסוניים. עבור פונקציות אלה, MMEC יוצרים פונקציונלי "יחידה myovascular" (MVU), עם סוגי תאים נוספים, כגון fibroblasts, pericytes, תאי שריר השלד. כתוצאה מכך, תפקוד MMEC ולכן MVU את תורמת למגוון עצום של myopathies. אולם, מנגנוני הרגולציה של MMEC על בריאות ומחלה נותרו מספיק מובן, הבהרה שלהם מקדים טיפולים פרטניים יותר myopathies. בידוד של חקירה מעמיקה של פונקציות MMEC העיקרי בהקשר של MVU עשוי להקל על הבנה טובה יותר של תהליכים אלה.
מאמר זה מספק פרוטוקול כדי לבודד MMEC מאתר העיקרי של שריר השלד מאת דיסוציאציה מכני, אנזימטי כולל טיהור והשלבים תחזוקה תרבות.
מבוא
דרך מחזור הדם, תאים ואיברים, מסופקים עם חמצן, מצעים, מולקולות אחרות הדרושות. מחלף זה מתרחש בנימים, בכלי הדם הקטנים. נימים נוצרות על ידי שכבת תאי אנדותל הפנימי (EC) שלמות אשר נשאר תנאי לביצוע מוצלח ההסדרה של הומאוסטזיס שריר בין המרחב קרישה תוך-כלית, interstitial. כדי להבטיח מעבר סלקטיבי של גורמים מסיסים ותאים, EC מהוות של טפט מחוברים על ידי חזק צמתי adherens 1. מלבד תפקידה כמחסום חומרים מזינים או מוצרים מטבולית, EC לווסת את גיוס לויקוציטים בתהליכים דלקתיים. נזק דלקת או רקמה מוביל למעלה-רגולציה של מולקולות אדהזיה על פני EC ו ייצור של נוגדנים הקלת ליקוציט המצורף, גלגול לתוך רקמת המטרה 2. כתוצאה מכך, EC אנושות מעורב....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים שאושרו על-ידי הרשויות המקומיות, שנערכו על-פי חוק רווחת בעלי חיים גרמני (84-02.05.20.13.097).
1. כללי הערות על ניסויים בבעלי חיים
- לבצע כל עכבר ניסויים בהתאם לקווים המנחים של טיפול בבעלי חיים מוסדיים המתאימים ולהשתמש הוועדה.
- לשמור על עכברים בתנאים מתוקננים, בהתאם להנחיות בינלאומיות כגון הפדרציה עבור עמותות המדע חיות מעבדה (FELASA).
הערה: באופן כללי ניתן להשתמש בטכניקה זו בידוד עבור עכברים עצמאית של גיל, מין או הרקע הגנטי. כדי לקבל מספר מספיק של התא, שבוע 4 – 10 זכרים הם המועדפת, כי תכונות ביולוגיות יכול להשתנות עם הגיל והמין.
2. אופן ההכנה של פתרונות, מדיה, צי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
יום אחד לאחר בידוד, MMEC מאתר ראשי, ממסר תאים אחרים טופס וקונצרנים, לדבוק התחתון של תרבות מנות (איור 1A יום 1). יום 7 ואילך ניתן לצפות תאים שטוח וארוך. זיהום של אחרים, בעיקר ספרואיד תאים, עם זאת, עדיין גלויים (איור 1A יום 7). לכן, עוד מחזור של CD31 חיובי בחירת דרך MCS נדרש. בעתיד, MMEC מאתר הראשי להתרבות על צפיפות של-80-90%. על הנהרות הם יוצרים בדרך כלל חד שכבתי שאינם חופפים של תאים longitudinally מיושר (
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
Microvascular תאי אנדותל לספק פונקציות מכשול ברקמות כל התוצאות שלהם לקוי במחלה של האיברים הקשורים 3. יתר על כן, מחקרים ייחודיים של microvascular EC יכול לסלול את הדרך עבור אסטרטגיות טיפוליות חדשות. לכן, הבנה עמוקה יותר של microvascular EC תפקוד בתנאים פיזיולוגיים, הקשורים pathophysiological הוא עניין מדעי רב. אפנון של אינטראקציה ליקוציט/אנדותל משמש בהצלחה לטיפול בחולי טרשת נפוצה עם natalizumab, נוגדנים אשר מונע הידבקות לימפוציט וע י גלגול 6. עם זאת, myopathies שונות כולל את.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי "אחר Kröner-Fresenius-Stiftung" (2018_A03 ל יח), "חדשני Medizinische Forschung (קרן המטבע) מינסטר" (I-RU211811 כדי TR) וקרן מחקר גרמני (DFG, מוסד 2105/27-1, לי 3283/5-1 ולי 3283/6-1 כדי SGM). תמונות מאויר שסופקו על-ידי האיקה בלום.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | 25200-056 | מוכן לשימוש |
| מאגר | 150 מ"מ NH4Cl, 10 מ"מ KHCO3, 0.1 mM EDTA במים ב-pH של 7.3 | ||
| Anti-Mouse CD31-FITC (clone MEC13.3) | Biolegend | 102506 | בקרת איזוטיפ: FITC Rat IgG2a, κ איזוטייפ Ctrl |
| נגד עכבר CD45-PE (שיבוט 30-F11) | Biolegend | 103106 | בקרת איזוטיפ: PE חולדה IgG2b, κ איזוטיפ Ctrl |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| CD31 עכבר MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| CD45 עכבר MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Collagenase-Dispase | Roche | 10269638001 | קולגנאז מ-V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa |
| Corning Costar TC-Treated TC-Multiple 6-Well Plates | Corning | 3516 | |
| Cy3-Conjugated Anti-RG IgG anti-rat | dianova | 712-166-153 | |
| DAPI (ProLong Gold antifade Reagent with DAPI) | Thermo Fisher | P36935 | |
| Desoxyribonuclease | Sigma Aldrich | D4513 | Deoxyribonuclease I מלבלב בקר |
| Diethylpyrocarbonat מים מטופלים | Thermo Fisher | AM9916 | |
| DMEM, המכיל תוסף גלוטמין ופירובט | Thermo Fisher | 31966-021 | מתחמם עד 37 מעלות; C לפני השימוש |
| dNTP Mix (10 מ"מ) | Thermo Fisher | R0192 | 1 מ"ל |
| EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
| צינורות FACS | Sarstedt | 551,579 | |
| Falcon 70 μ m מסננת תאים | Corning | 352350 | |
| FC מאגר | 0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA | ||
| סרום עגל עוברי | Sigma Aldrich | F6178 | סרום עגל עוברי |
| כדאיות לתיקון eFluor780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| מלקחיים (משוננים, ישרים, 12 ס"מ) | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| מלקחיים (משוננים, ישרים, 12 ס"מ) | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| מזרק אינסולין 100 סולו 1 מ"ל (אומניפיקס) | בראון | 9161708V | |
| עמודות מגנטיות גדולות (עמודות LS) | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | עבור CD45-MACS-step |
| MCS buffer | 0.5% BSA, 2 mM EDTA ב-PBS ב-pH של 7.2 | ||
| עמודה מגנטית בינונית (עמודת MS) | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | עבור CD31-MACS-step |
| מים ללא נוקלאז | תרמו פישר | R0581 | |
| PBS | סיגמא אולדריץ' | פוספט חוצץ מלח, מוכן לשימוש | |
| מאגר PCR (5x) | Thermo Fisher | EP0742 | בערכה עם הטרנסקריפטאז ההפוך |
| Pecam1 חולדה α-עכבר | SantaCruz | Sc-52713 | 100 µ g/mL |
| פניצילין-סטרפטומיצין | סיגמא אולדריץ' | P4333 | |
| תאי שריר עכברים ראשוניים | celprogen | 66066-01 | |
| פריימר Cdh15 (M-Cadherin) | Thermo Fisher | Mm00483191_m1 | FAM עם תווית |
| פריימר Cldn5 (קלודין-5) | Thermo Fisher | Mm00727012_s1 | FAM עם התווית |
| Primer Ocln (occludin) | Thermo Fisher | Mm00500912_m1 | FAM שכותרתו |
| Primer Pax-7 | Thermo Fisher | Mm01354484_m1 | FAM שכותרתו |
| Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1) | Thermo Fisher | Mm00493699_m1 | FAM שכותרתו |
| Primer 18s rRNA (בקרה אנדוגנית Eukaryotic) | Thermo Fisher | 4310893E | VIC עם תווית |
| qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X) | Thermo Fisher | K0231 | 2 x 1,25 מ"ל; עבור 200 תגובות כל אחת |
| תערובת אקראית של פריימר חד-גדילי | Thermo Fisher | SO142 | Random Hexamer Primer |
| Reverse Transcriptase (200 U/μ L) + מאגר PCR (5x) | Thermo Fisher | EP0742 | |
| (40 U/μ L) | Thermo Fisher | EO0381 | |
| מספריים (קצה חיתוך 23 מ"מ, חד / חד) | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| מספריים (קצה חיתוך 42 מ"מ, חד / קהה) | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| פתרון ציפוי מהיר | PeloBiotech | PB-LU-000-0002-00 |
מקורות
- Rodrigues, S. F., Granger, D. N. Blood cells and endothelial barrier function. Tissue Barriers. 3 (1-2), e978720(2015).
- Michiels, C. Endothelial cell functions. Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).
- Pierce, R. W., Giuliano, J. S. Jr, Pober, J. S.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
