לכימות ההתפלגות הטרוגנית של חלבון סינפטיים במוח העכבר בעזרת Immunofluorescence

Summary

כאן, אנו מתארים גישה כמותית לקביעת ההתפלגות של חלבון סינפטית יחסית חלבון סמן באמצעות צביעת immunofluorescence ', ' מיקרוסקופיה קונפוקלית, וניתוח מבוססת מחשב.

Abstract

נוכחות, היעדרות, או רמות של חלבונים סינפטיים מסוימים יכול להשפיע באופן חמור הסינאפסית. בנוסף שחקרתי את הפונקציה של חלבון, זה חיוני גם לקבוע תפוצתו. כאן, אנו מתארים נוהל העסקת immunofluorescence קונפוקלית, מבוססת מחשב ניתוח כדי לקבוע את ההתפלגות של החלבון סינפטית Mover (המכונה גם TPRGL או SVAP30). אנו משווים את חלוקת Mover לזה של synaptophysin חלבון שלפוחית סינפטית, ובכך לקבוע את חלוקת Mover בצורה כמותית יחסית השפע הסינפטיות. ראוי לציין, ניתן ליישום שיטה זו פוטנציאל כדי לאפשר השוואה של ההתפלגות של חלבונים באמצעות נוגדנים שונים או מיקרוסקופ או דרך מחקרים שונים. השיטה שלנו עוקף ההשתנות הטבועה של immunofluorescent stainings נכנע יחס מאשר רמות קרינה פלואורסצנטית מוחלטת. בנוסף, השיטה נתאר מאפשר לנתח את ההתפלגות של חלבון ברמות שונות: מן כל המוח פרוסות לאזורים במוח כדי לאזורי משנה שונים באזור מוח אחד, כגון שכבות שונות של ההיפוקמפוס או חושית cortices. Mover הוא חלבון ספציפי חוליות המשויך הסינפטיות. בשיטה זו, אנו מראים כי Mover heterogeneously מפוזרים על-פני אזורים במוח, עם רמות גבוהות של pallidum הגחון, גרעינים במחיצה הבין-פרוזדורית ו האמיגדלה, וגם בתוך אזורים במוח יחיד, כגון שכבות שונות של ההיפוקמפוס.

Introduction

התקשורת בין הנוירונים קורה באתרי קשר מיוחד שנקרא הסינפסות. הסינפסות להכיל מספר עצום של חלבונים שונים שננהל הסינאפסית. חלק אלה חלבונים להראות התפלגות הטרוגנית לאורך מערכת העצבים, אינם נוכחים בכל סינפסה¹. דוגמה אחת על חלבון כזה היא Munc13, שבה הוא מעורב בתהליך לקרקע של הסינפטיות. ישנם איזופורמים שונים של Munc13, אשר heterogeneously מופצים ברחבי המוח², נוכחות או היעדרות של איזופורמים ספציפי יכול להשפיע לטווח קצר פלסטיות סינפטית, שלפוחית סינפטית dynamics^{3, 4 , 5}. לפיכך, יש חשיבות חיונית כדי להיות מסוגל לזהות הנוכחות של חלבונים סינפטיים שונים על פני אזורים במוח.

השיטות של בחירה על כימות של חלבונים סינפטיים - כה - הן ספקטרומטר מסה המערבי סופג, במקום אימונוהיסטוכימיה^6,7,8,9. במקרים מסוימים, מספר שיטות משמשות משלימים אחד את השני כדי להעריך את הכמות וגם הלוקליזציה של חלבונים ספציפיים (קרי, וילהלם. et al. ¹⁰). שיטת נתאר כאן מאפשרת התאמה לשפות אחרות, כימות של חלבונים עניין ללא צורך באמצעות כל שיטה ביוכימית, פשוט העסקת immunofluorescent stainings. יתרון נוסף כאן הוא כימות יכול להיעשות על אזורים הרבה יותר קטן, לכן, ספציפיות יותר, מאשר אלה מושגת על ידי שיטות אחרות. עם זאת, יש לקחת בחשבון כי חלבון התייחסות אמין יש צורך להעריך את ההתפלגות של החלבון עניין.

צביעת פלורסנט מאת אימונוהיסטוכימיה מאפשר לנו לזהות באופן שגרתי הלוקליזציה של חלבונים על פני אזורים במוח, כמו גם בתוך תאים עצביים שונים. כדי לזהות את מדורים שונים, משמשות סמני ספציפיים. בדרך כלל, נוגדנים נגד סינפסין ו synaptophysin¹¹ ניתן לתייג הסינפטיות, בעוד נוגדנים נגד בסון תווית האזור הפעיל של מסוף presynaptic¹². Vesicular מובילים, כגון שנאים גלוטמט vesicular (vGluT) או גאבא vesicular טרנספורטר (vGAT), משמשים להוספת תווית סינאפסות¹³ ו מעכבות¹⁴ מסופי presynaptic, בהתאמה. בצד postsynaptic, נוגדנים נגד החלבון הומר יכול להיות מועסק כדי לסמן מסופי postsynaptic ולאחר נוגדנים נגד צפיפות postsynaptic חלבון 95 (PSD95)^15,16,17 או gephyrin^{18 , 19 , 20} יכול תווית מסופי postsynaptic סינאפסות או מעכבות, בהתאמה. באמצעות נוגדנים נגד חלבון של עניין סמנים כגון אלה שתוארו לעיל, ניתן לקבוע הלוקליזציה של חלבון כזה. מחקרים רבים עד היום לעשות את זה באופן איכותי²¹ עם זאת, כדי לקבוע באופן אמין ההתפלגות דיפרנציאלית של חלבון ספציפי סינפטית, אחד חייב לא רק לקבוע נוכחותו או היעדרות אלא גם הריכוז היחסי שלו. את הטרוגניות בגדלים וצפיפות של הסינפסות הופך חשוב להקים יחס בין דה מרקר סינפטית החלבון עניין. אחרת, סינפסה-עשיר אזורים כגון שכבות שאינן פירמידה של ההיפוקמפוס, השכבה המולקולרית של הצרבלום יראה צפיפות גבוהה של חלבונים סינפטיים, רק בשל צפיפות גבוהה יותר של הסינפסות אך לא בשל נוכחות חזקה של חלבון זה כל סינפסה (למשל, Wallrafen, Dresbach¹). מצד שני, חלבונים ב- סומא עצביים (למשל, TGN38²²) בדרך כלל יראה נוכחות חזקה שכבת תאים כפירמידה בהיפוקמפוס או שכבת תאים בהיפוקמפוס או אסטרוציטומה גרגר בשל הריכוז הגבוה של גופי תאים עצביים באזורים אלו. לכן, התפלגות זו אי-הומוגניות של מבנים, במקרה זה synapses, יכול להוביל שערוך שווא של ההתפלגות של החלבון עניין עצמו. יתר על כן, יש השתנות מהותי צביעת עוצמות מדגמים ב- immunohistochemical stainings. הפרוטוקול המתואר כאן לוקח זאת בחשבון ומונעת הטיות כזה, כמו גם אזהרות אחרים הנובעים משימוש בשיטות immunohistochemical.

האחרונים שלנו לומדים, אנחנו השתמשו בשיטה זו כדי לתאר את הביטוי דיפרנציאלית של Mover (הנקרא גם TPRGL²³ או SVAP30²⁴) על פני אזורים שונים במוח¹16. Mover הוא חלבון ספציפי חוליות סינפטית זה ניתן למצוא האגודה כדי הסינפטיות ומשפיע על^2726,25,שחרור נוירוטרנסמיטר. לנו יש הקשורים לביטוי Mover שפע הסינפטיות, על ידי צביעת עבור synaptophysin כסמן הפניה שלפוחית סינפטית. מצאנו רמות גבוהות של Mover בפרט גרעינים במחיצה הבין-פרוזדורית pallidum על הגחון, האמיגדלה. בתוך ההיפוקמפוס, מצאנו בהתפלגות הטרוגנית של Mover, עם רמות גבוהות הרבדים הקשורים למחשוב אינטרה-בהיפוקמפוס, רמות נמוכות בשכבות הקלט והפלט.

Protocol

פרוטוקול זה אינו כרוך בניסויים בבעלי חיים. בניסויים המערבים המתות חסד של בעלי החיים כדי להשיג דגימות המוח אושרו על ידי רשויות מקומיות להגנת בעלי חיים (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin גטינגן) תחת מספר אישור T 10/30.

הערה: עבור פרוטוקול זה, 3 עכברים C57BL/6 מבוגרים זכר שימשו.

1. הכנת הדוגמא

1. להכין מקבע מאגר פוספט 0.1 M (PB; ראה טבלה 1).
2. לתקן את החיה על-ידי transcardial זלוף כפי שמתואר Gage. et al. ²⁸. קודם לשטוף את הדם עם 0.9% NaCl-פתרון, אז perfuse עם 30 מ של 4% paraformaldehyde (PFA).
3. לפתוח את הגולגולת עם מספריים ולבודד בזהירות בעזרת כפית עם קצוות קהים כדי למנוע נזק לרקמת המוח.
4. מלא צינור תגובה 50 מ עם מקבע, postfix המוח ב- 4% מחברים ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
5. הסר את מקבע, לשטוף את המוח ב- 50 מ של 0.1 M PB-מטרף למשך 30 דקות.
6. לאחר הרחצה, דגירה המוח בשפופרת תגובה 50 מ ב- 30% סוכרוז ב PB 0.1 M 48 שעות או עד שהיא שוקעת בצינור ב 4 ° C עבור cryoprotection.
7. לקצץ את המוח cryoprotected עם סכין חדה, מניחים אותה cryomold, תטביע אותו עם טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) במתחם. להימנע בועות. אוריינט המוח, להקפיא את cryomold במקפיא-80 ° C.
8. הר הרקמה קפוא על חלוקתה. Equilibrate את הרקמה כדי הטמפרטורה cryomicrotome למשך לפחות 15 דקות לפני חלוקתה.
9. בסעיף המוח 25 מיקרומטר הילתית פרוסות עבות. לגעת OCT בזהירות עם קרס זכוכית בלי לגעת על רקמת המוח. לאסוף 3 סמוך פרוסות לכל באר היטב צלחת 24 ואחסן אותם ב- 0.1 M PB ב 4 ° C עד מכתים.
   הערה: הפרוטוקול ניתן להשהות כאן עד שבועיים. עוד פעמים אחסון ניתן לשבש מאיכות רקמות, ובכך להשפיע על תוצאות הניסוי.

2. immunofluorescence

1. להכין פתרונות כולל מאגר חסימה, מאגר נוגדן, שטיפת מאגר 1, ומאגר כביסה 2 (ראה טבלה 1).
2. לשטוף פרוסות פעם אחת עם חמאת בוטנים כדי להסיר עודפי OCT.
   1. הסר את הפתרון עם פיפטה פלסטיק ללא מכניסה את פרוסות המוח. להוסיף 250 µL של חמאת בוטנים טריים עם פיפטה µL 1000.
      התראה: פרוסות צריך לא יתייבש, אז להסיר ולהוסיף נוזלים טוב מאת טוב.
3. להסיר את חמאת בוטנים עם פיפטה פלסטיק ולהוסיף µL 250 מאגר חסימה לכל באר עם פיפטה 1000 µL. תקופת דגירה של 3 שעות בטמפרטורת החדר (RT) על ניעור.
4. במהלך זמן הדגירה, לדלל הנוגדנים העיקרית במאגר נוגדן בשפופרת התגובה. השתמש מאגר נוגדן µL 250 לכל טוב ולהוסיף את הכמות המתאימה של נוגדנים (ראה טבלה 2) מאת pipetting זה ישירות לתוך הפתרון באמצעות פיפטה 2 µL. מערבבים את הפתרון על-ידי pipetting בעדינות לאורך מספר פעמים. מערבולת זמן קצר לאחר מכן כדי להבטיח לערבב.
   הערה: כדי לקבוע את הרקע פלורסצנטיות, stainings יש גם לבצעו ללא הוספת נוגדן ראשוני. בשביל זה, דגירה הפרוסה ב נוגדן פתרון ללא נוגדנים העיקרי לפי הפרוטוקול.
5. לאחר זמן הדגירה, להסיר את המאגר חסימה עם פיפטה פלסטיק ולהוסיף µL 250 של נוגדן פתרון המכיל נוגדנים העיקרי לכל טוב. דגירה פרוסות עם נוגדן ראשוני בין לילה ב 4 ° C-מטרף.
6. ביום למחרת, לשטוף את הפרוסות עם שטיפה מאגר 1 3 x 10 דקות ב RT-מטרף.
   1. להסיר את המדיום עם פיפטה פלסטיק ולהוסיף 300 µL לרחוץ את מאגר 1 לכל טוב. תקופת דגירה-RT של 10 דקות חוזרת 3 פעמים.
7. במהלך השלבים כביסה, לדלל הנוגדנים משני מצמידים fluorophore במאגר נוגדן בשפופרת התגובה. השתמש מאגר נוגדן µL 250 לכל טוב ולהוסיף את הכמות המתאימה של נוגדנים (ראה טבלה 2) מאת pipetting זה ישירות לתוך הפתרון באמצעות פיפטה 2 µL. מערבבים את הפתרון על-ידי pipetting בעדינות לאורך מספר פעמים. מערבולת זמן קצר לאחר מכן כדי להבטיח לערבב.
   התראה: בגלל הנוגדנים הם רגישים לאור, כל הצעדים מנקודה זו ואילך יש לבצע בחושך.
8. אחרי הצעדים כביסה, הסר הכביסה מאגר עם פיפטה פלסטיק ולהוסיף µL 250 של נוגדן פתרון המכיל נוגדנים משניים לכל טוב. דגירה את הפרוסות עם נוגדנים משניים עבור 90 דקות ב RT בחושך.
9. לשטוף את הפרוסות עם שטיפה מאגר 2 3 x 10 דקות ב- RT.
10. במהלך השלבים כביסה, לדלל 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) ב PB 0.1 M בריכוז של 1:2000.
11. להסיר את המאגר כביסה 2 עם פיפטה פלסטיק ולהוסיף µL 250 של דאפי פתרון לכל טוב. תקופת דגירה של 5 דקות ב RT-ניעור.
12. להסיר את הפתרון דאפי עם פיפטה פלסטיק ולהוסיף 500 µL של 0.1 M PB לכל באר עם פיפטה 1000 µL.
13. הר פרוסות על שקופיות מיקרוסקופ.
    1. בשקופית מיקרוסקופ תחת סטריאוסקופ המקום. עם מברשת בסדר, להוסיף 3 טיפות נפרדים של 0.1 M PB אותן לשקופית. מניחים פרוסה אחת לכל טיפה על גבי השקופית מיקרוסקופ.
    2. השתמש בכלי מברשת בסדר כדי לרדד, אוריינט את הפרוסות על השקופית מיקרוסקופ.
    3. כאשר כל הפרוסות ממוקמות כהלכה, להסיר את עודף חמאת בוטנים עם טישו ויבש השקופית בקפידה.
       זהירות: הימנעו ייבוש את פרוסות המוח לגמרי.
    4. הוסף µL 80 הטבעה בינוני אותן לשקופית. בזהירות הנמך את coverslip על גבי השקופית, ובכך להטביע את פרוסות המוח.
    5. להשאיר את השקופיות להתייבש בשכונה fume במשך 1-2 h (לכסות אותם כדי למנוע חשיפה קלה) ולאחסן אותם בקופסה שקופיות מיקרוסקופ ב 4 º C.
       הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.

3. הדמיה

1. לאחר המדיום ההטבעה לחלוטין מוקשה, במקום השקופית מיקרוסקופ תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.
   הערה: מיקרוסקופ Epifluorescence בשילוב עם תוכנת deconvolution אמור להניב איכות תמונה דומה.
2. התאם את הגדרות לייזר על-ידי הגדלת או הקטנת עוצמת לייזר עבור כל ערוץ כך כמה פיקסלים הם חשיפת כדי להבטיח הפצה המרבי של ערכי אפור.
3. רוכשים את רקמות וירטואלי של הפרוסה כל המוח עבור הערוצים השונים.
   1. בתוכנת הדמיה (ראה טבלה של חומרים), בחרו באפשרות ' אריחים ', ניסחו באופן ידני על הפרוסה המוח בעזרת הגדרת אזור אריח.
   2. להפיץ נקודות תמיכה ברחבי אזור אריח ולהתאים את המוקד על הנקודות התמיכה השונים על-ידי הקשת לוודא אריח אזורים/תפקידים.
   3. התאם את ההגדרות במצב רכישה בהתאם לגודל הרצוי הרזולוציה ואת הקובץ של התמונה שתיווצר ולהתחיל את הסריקה.
4. עם סיום הסריקה, השתמש בפונקציה Stitching לעבד את הרקמה וירטואלי. לייצא את הקובץ. tif עם הפונקציה לייצא את התמונה.

4. המחשב המבוסס על ניתוח

1. לטעון כל הערוצים יחיד עבור תמונה אחת לתוך פיג'י²⁹ על ידי לחיצה על קובץ | פתוח.
2. בעזרת הכלי בחירה ביד חופשית , ניסחו אחד בחצי הכדור דאפי-הערוץ. ליצירת מסיכה של הבחירה על ידי לחיצה עריכה | בחירה | יצירת מסיכת.
3. לקבוע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רעה עבור הערוצים יחיד (Mover ו- synaptophysin) על ידי לחיצה נתח | מדד.
   הערה: הקפד לבחור את הערוצים השונים כדי לקבוע את ערכי העוצמה של זריחה מתכוון לכל ערוץ.
4. העתק את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רעה עבור הערוצים יחיד לתוך גיליון אלקטרוני.
5. לקבוע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע עבור הערוצים יחיד באזור עניין על ידי בהתוויית האזור גם בעזרת הכלי בחירה ביד חופשית . השתמש אטלס מוח של עכבר כהפניה.
6. חזור על הצעדים 4.1-4.5 כל האונות ואת כל תחומי עניין.
   הערה: לקבוע את הערכים עבור האונה כל בנפרד על מנת מאוחר יותר להשוות את הערכים באזור לעניין זה בחצי הכדור הצפוני (ראה שלב 5.2).

5. נתונים טיפול

1. במקרה הרקע הוא גבוה (ראה דיון), ייתכן שיש צורך חיסור רקע. בשביל זה, לקבוע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע על הפרוסה ללא ראשי נוגדן כנגד החלבון הפניה (כאן: synaptophysin) החסר ערך זה מ כל הערכים שהתקבלו עבור אזורים במוח והאונות.
2. מתי נקבע עוצמות קרינה פלואורסצנטית רעה עבור הערוצים יחיד עבור כל חצי הכדור ואזור בכל עניין (ראו טבלה 3), לחשב את היחס שבין Mover כדי synaptophysin על-ידי חלוקת הערך עבור Mover לפי הערך עבור synaptophysin ( צהוב בטבלה3). בצע פעולה זו עבור כל חצי הכדור ואזור בכל עניין בנפרד.
3. לחלק של היחס שהתקבל עבור אזור אחד של עניין על-ידי היחס שהתקבל עבור הכדור המתאים (כתום בטבלה3) כדי לקבוע את היחס של האזור בעל עניין הכדור.
4. כדי לקבוע את השפע Mover היחסי, לתרגם את היחס שהתקבל ב- 5.2 באחוזים על-ידי קביעת שלו סטייה 1 (אדום בטבלה3). יחס של 1.25 ייתן לכן שפע Mover היחסי של 25% מעל הממוצע, יחס של 0.75 יניב שפע Mover היחסי של 25% מתחת לממוצע.

Results

נציג מכתים דפוסים של סמנים שונים ניתן לראות באיור1. התבנית משתנה בהתאם להתפלגות של החלבון. דוגמאות של חמש רמות rostro-סימטרית מוצגים בעמודות (א)-(E). צביעת דאפי נציג מוצג בשורה הראשונה: דאפי לאנאפוליס ה-DNA של התא, ובכך גרעינים מוכתמים. התוצאה היא דפוס punctate. אזורים עם צפיפות גבוהה תא בהירים יותר אזורים עם צפיפות נמוכה התא. ניתן לראות דוגמא לכל חלבון heterogeneously מבוזרת בשורה השניה. מצביע התזוזה מכתים מגלה התפלגות דיפרנ...

Discussion

השיטה המוצגת כאן מטרות ב לכימות ההתפלגות של חלבון עניין יחסית השפע של חלבון מרקר עם התפלגות ידוע. Immunofluorescence מכתים יכול להראות השתנות גבוהה של צביעת עוצמות בין הפרוסות שונים. הגישה כימות המתוארים כאן עוקף את הבעיה על-ידי קביעת היחס של החלבון לעניין הממוצע על פני הכדור. לכן, עוצמות מכתימים שונים על פני פרוסות מבוטלות ומאפשרים לקבלת תיאור כמותי.

כמו עם כל פרוטוקול immunofluorescence, איכותי או כמותי, מספר גורמים יכולים להשפיע על ההצלחה, ובכך וחיסול הניתוח. לכן, תשומת לב מיוחדת צריכה להיו...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
צינורות תגובה של 1.5 מ"ל	Eppendorf	30120094
צינורות תגובה של 50 מ"ל	Greiner Bio-One	227261
multiwell 24 well	Fisher Scientific	087721H
פיפטה מפלסטיק (חד פעמי)	Sarstedt	861,176
1000 מ"ל פיפטה	Rainin
פיפטה 2 מ"ל	Eppendorf	3123000012
Vortex Genius 3	שקופיות מיקרוסקופ IKA	3340001
Menzel	פישר סיינטיפיק	10144633CF
סטריאוסקופ	Leica
LSM800	Zeiss		מיקרוסקופ קונפוקלי
מקפיא מיקרוטום	Leica
PBS (10X)	Roche
PFA	Sigma	P6148-1 ק"ג
NaCl	BioFroxx	1394KG001
סוכרוז	neoFroxx	1104KG001
רקמות טק	סאקורה	4583	OCT
Na2HPO4	BioFroxx	5155KG001
NaH2PO4	Merck	1,063,460,500
סרום עיזים רגיל	Merck Millipore	S26-100ML
סרום חמור רגיל	Merck	S30-100ML
Triton X-100	Merck	1,086,031,000
ארנב Anti-Mover	Synaptic Systems	RRID: AB_10804285
שרקנים אנטי-סינפטופיזין	מערכות סינפטיות	RRID: AB_1210382
חמור נגד ארנב AF647	Jackson ImmunoResearch	RRID: AB_2492288
עז אנטי-עכבר AF488	Jackson ImmunoResearch	RRID: AB_2337438
Mowiol4-88	Calbiochem
ZEN2 כחול תוכנה	Zeiss		Microscopy תוכנה
FIJI	ImageJ		Analysis תוכנה
מיקרוסופט אקסל	מיקרוסופט