Method Article

לכימות ההתפלגות הטרוגנית של חלבון סינפטיים במוח העכבר בעזרת Immunofluorescence

DOI:

10.3791/58940

⸱

January 29th, 2019

 ,  , 
1Institute of Anatomy and Embryology, University Medical Center Göttingen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים גישה כמותית לקביעת ההתפלגות של חלבון סינפטית יחסית חלבון סמן באמצעות צביעת immunofluorescence ', ' מיקרוסקופיה קונפוקלית, וניתוח מבוססת מחשב.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נוכחות, היעדרות, או רמות של חלבונים סינפטיים מסוימים יכול להשפיע באופן חמור הסינאפסית. בנוסף שחקרתי את הפונקציה של חלבון, זה חיוני גם לקבוע תפוצתו. כאן, אנו מתארים נוהל העסקת immunofluorescence קונפוקלית, מבוססת מחשב ניתוח כדי לקבוע את ההתפלגות של החלבון סינפטית Mover (המכונה גם TPRGL או SVAP30). אנו משווים את חלוקת Mover לזה של synaptophysin חלבון שלפוחית סינפטית, ובכך לקבוע את חלוקת Mover בצורה כמותית יחסית השפע הסינפטיות. ראוי לציין, ניתן ליישום שיטה זו פוטנציאל כדי לאפשר השוואה של ההתפלגות של חלבונים באמצעות נוגדנים שונים או מיקרוסקופ או דרך מחקרים שונים. השיטה שלנו עוקף ההשתנות הטבועה של immunofluorescent stainings נכנע יחס מאשר רמות קרינה פלואורסצנטית מוחלטת. בנוסף, השיטה נתאר מאפשר לנתח את ההתפלגות של חלבון ברמות שונות: מן כל המוח פרוסות לאזורים במוח כדי לאזורי משנה שונים באזור מוח אחד, כגון שכבות שונות של ההיפוקמפוס או חושית cortices. Mover הוא חלבון ספציפי חוליות המשויך הסינפטיות. בשיטה זו, אנו מראים כי Mover heterogeneously מפוזרים על-פני אזורים במוח, עם רמות גבוהות של pallidum הגחון, גרעינים במחיצה הבין-פרוזדורית ו האמיגדלה, וגם בתוך אזורים במוח יחיד, כגון שכבות שונות של ההיפוקמפוס.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התקשורת בין הנוירונים קורה באתרי קשר מיוחד שנקרא הסינפסות. הסינפסות להכיל מספר עצום של חלבונים שונים שננהל הסינאפסית. חלק אלה חלבונים להראות התפלגות הטרוגנית לאורך מערכת העצבים, אינם נוכחים בכל סינפסה1. דוגמה אחת על חלבון כזה היא Munc13, שבה הוא מעורב בתהליך לקרקע של הסינפטיות. ישנם איזופורמים שונים של Munc13, אשר heterogeneously מופצים ברחבי המוח2, נוכחות או היעדרות של איזופורמים ספציפי יכול להשפיע לטווח קצר פלסטיות סינפטית, שלפוחית סינפטית dynamics3, 4 , 5. לפיכך, יש חשיבות חיונית כדי להיות מסוגל לזהות הנוכחות של חלבונים סינפט....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה אינו כרוך בניסויים בבעלי חיים. בניסויים המערבים המתות חסד של בעלי החיים כדי להשיג דגימות המוח אושרו על ידי רשויות מקומיות להגנת בעלי חיים (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin גטינגן) תחת מספר אישור T 10/30.

הערה: עבור פרוטוקול זה, 3 עכברים C57BL/6 מבוגרים זכר שימשו.

1. הכנת הדוגמא

  1. להכין מקבע מאגר פוספט 0.1 M (PB; ראה טבלה 1).
  2. לתקן את החיה על-ידי transcardial זלוף כפי שמתואר Gage. et al. 28. קודם לשטוף את הדם עם 0.9% NaCl-פתרון, אז perfuse עם 30 מ של 4% paraformaldehyde (PFA).
  3. לפתוח את הגולגולת עם מספריים ולבודד בז....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נציג מכתים דפוסים של סמנים שונים ניתן לראות באיור1. התבנית משתנה בהתאם להתפלגות של החלבון. דוגמאות של חמש רמות rostro-סימטרית מוצגים בעמודות (א)-(E). צביעת דאפי נציג מוצג בשורה הראשונה: דאפי לאנאפוליס ה-DNA של התא, ובכך גרעינים מוכתמים. התוצאה היא דפוס punctate. אזורים עם צפיפות גבוהה תא בהירים יותר אזורים עם צפיפות נמוכה התא. ניתן לראות דוגמא לכל חלבון heterogeneously מבוזרת בשורה השניה. מצביע התזוזה מכתים מגלה התפלגות דיפרנ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה המוצגת כאן מטרות ב לכימות ההתפלגות של חלבון עניין יחסית השפע של חלבון מרקר עם התפלגות ידוע. Immunofluorescence מכתים יכול להראות השתנות גבוהה של צביעת עוצמות בין הפרוסות שונים. הגישה כימות המתוארים כאן עוקף את הבעיה על-ידי קביעת היחס של החלבון לעניין הממוצע על פני הכדור. לכן, עוצמות מכתימים שונים על פני פרוסות מבוטלות ומאפשרים לקבלת תיאור כמותי.

כמו עם כל פרוטוקול immunofluorescence, איכותי או כמותי, מספר גורמים יכולים להשפיע על ההצלחה, ובכך וחיסול הניתוח. לכן, תשומת לב מיוחדת צריכה להיו.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים אירמגרד וייס לסיוע טכני מעולה. המחברים להכיר תמיכה על ידי הרמס Pofantis ו Andoniya Petkova. המחברים גם תודה מכון מדעי המוח האירופית השימוש של LSM800, סיוע טכני, במיוחד על ידי ד ר נילס Halbsgut. עבודה זו מומן על ידי גטינגן במרכז הרפואי אוניברסיטת. JSV מאשר תמיכה על ידי המרכז עבור ננו מיקרוסקופ ופיזיולוגיה מולקולרית של המוח (CNMPB).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
צינורות תגובה של 1.5 מ"לEppendorf30120094
צינורות תגובה של 50 מ"לGreiner Bio-One227261
multiwell 24 wellFisher Scientific                                                                                                                                                                                              087721H
פיפטה מפלסטיק (חד פעמי)Sarstedt861,176
1000 מ"ל פיפטהRainin 
פיפטה 2 מ"לEppendorf3123000012
Vortex Genius 3 שקופיות מיקרוסקופ IKA3340001
Menzelפישר סיינטיפיק                                                                                                                                                                                  10144633CF
סטריאוסקופLeica
LSM800Zeissמיקרוסקופ קונפוקלי
מקפיא מיקרוטוםLeica
PBS (10X)Roche                                                                                                                                                                           
PFASigma                                                                                                                                                                                      P6148-1 ק"ג
NaClBioFroxx1394KG001
סוכרוזneoFroxx1104KG001
רקמות טקסאקורה 4583OCT
Na2HPO4BioFroxx5155KG001
NaH2PO4Merck1,063,460,500
סרום עיזים רגילMerck MilliporeS26-100ML
סרום חמור רגילMerckS30-100ML
Triton X-100Merck1,086,031,000
ארנב Anti-MoverSynaptic SystemsRRID: AB_10804285
שרקנים אנטי-סינפטופיזיןמערכות סינפטיותRRID: AB_1210382
חמור נגד ארנב AF647Jackson ImmunoResearchRRID: AB_2492288
עז אנטי-עכבר AF488Jackson ImmunoResearchRRID: AB_2337438
Mowiol4-88Calbiochem                                                                                                                                                                                                   
ZEN2 כחול תוכנהZeissMicroscopy תוכנה
FIJIImageJAnalysis תוכנה
מיקרוסופט אקסלמיקרוסופט
1701438211666789001475904

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wallrafen, R., Dresbach, T. The Presynaptic Protein Mover Is Differentially Expressed Across Brain Areas and Synapse Types. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 58(2018).
  2. Augustin, I., Betz, A., Herrmann, C., Jo, T., Brose, N. Differential expr....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Synaptic Protein DistributionImmunofluorescence ProtocolConfocal MicroscopyComputer Based AnalysisMover ProteinSynaptophysin ComparisonBrain Slice AnalysisFluorescence Intensity RatioHeterogeneous DistributionHippocampal Layers

Related Articles