הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ניתוח של קיפול חלבונים, תחבורה, והשפלה בתאים חיים על ידי הדופק רדיואקטיבי צ'ייס

10.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/58952

⸱

12 בפברואר 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cellular Protein Chemistry, Utrecht University, 2Program in Cellular and Molecular Medicine, Boston Children's Hospital

במאמר זה

סיכום

כאן נתאר פרוטוקול עבור שיטה כללית. צ'ייס הדופק המאפשר ניתוח קינטי של קיפול, תחבורה, והשפלה של חלבונים להיות בעקבות בתאים חיים.

תקציר

תיוג רדיואקטיבי. צ'ייס הדופק הוא כלי רב עוצמה עבור הלומדים ההבשלה הסתגלותי, התעבורה מיקומם הסלולר פונקציונלי, ההשפלה של היעד חלבונים בתאים חיים. באמצעות לזמנים קצרים (פעימה) radiolabeling (< 30 דקות) ומבוקר בחוזקה פעמים צ'ייס, זה אפשרי תווית רק חלק קטן של הבריכה הכולל חלבון ולעקוב אחרי הקיפול שלה. בשילוב עם nonreducing/הפחתת מרחביות-לזיהוי בג'ל (מרחביות-עמוד), immunoprecipitation עם נוגדנים (קונפורמציה-ספציפי), קיפול תהליכים אפשר לבחון בפירוט רב. במערכת זו נעשה שימוש כדי לנתח את קיפול חלבונים עם וריאציה ענק מאפיינים כגון חלבונים מסיסים, חלבונים transmembrane יחיד, מרובה עוברים, בכבדות N O glycosylated חלבונים, חלבונים עם ובלי דיסולפידי נרחב מליטה. . צ'ייס הדופק שיטות הן הבסיס של לימודי קינטית לתוך מגוון של תכונות נוספות, לרבות co - שינויים posttranslational, oligomerization ואת פלמור, בעיקרו של דבר המאפשר הניתוח של חלבון מלידה למוות. . צ'ייס הדופק מחקרים על קיפול חלבונים הם משלימים עם שיטות אחרות הביוכימי, biophysical ללמוד חלבונים במבחנה על ידי מתן רזולוציה טמפורלית מוגברת אינפורמציה פיזיולוגית. השיטות כפי שמתואר בתוך הנייר הזה מותאמים בקלות ללמוד קיפול של כמעט כל חלבון זה יכול לבוא לידי ביטוי במערכות יונקים או חרק-cell.

מבוא

קיפול של אפילו יחסית פשוטה חלבונים כרוך השונות מתקפלים אנזימים רבים, מלווים מולקולרית ו שינויים קוולנטיות1. שיחזור מלא של אלה תהליכים במבחנה הוא בלתי אפשרי כמעט, בהתחשב ומספר עצום של מרכיבים שונים המעורבים. לכן, רצוי מאוד, ללמוד חלבון מתקפל ויוו, בתאים חיים. טכניקות רדיואקטיבי. צ'ייס הדופק להוכיח כלי רב עוצמה עבור הלומדים את סינתזה, קיפול, תחבורה, והשפלה של חלבונים בסביבתם הטבעית.

חילוף החומרים תיוג של חלבונים במהלך דופק קצר עם 35התווית על-ידי S מתיונין/ציסטאין, ואחריו מרדף בהיעדר תווית רדיואקטיבי, מאפשר מעקב מסוים של אוכלוסייה של חלבונים לאחרונה מסונתז ב חצרו הסלולר רחב יותר. לאחר מכן, חלבונים היעד יכול להיות מבודדים באמצעות immunoprecipitation, נותחו באמצעות מרחביות-עמוד או בטכניקות אחרות. חלבונים רבים, המסע שלהם דרך התא מסומן על-ידי שינויים הנראים לעין על ג'ל מרחביות-דף. לדוגמה, העברת מהחלבונים glycosylated תוך-פלזמית (ER) למתחם גולג'י לעיתים קרובות מלווה שינויים של glycans מקושרים-N או התוספת של2,O מקושרים glycans3. שינויים אלה גורמות גדול לעלייה המסה המולקולרית לכאורה, אשר ניתן לראות על ידי ניידות שינויים בדף-מרחביות. ההבשלה יכולים גם להיות מסומנים על ידי אדמירל הפרוטאוליטי, כגון אות-פפטיד מחשוף או ההסרה של pro-פפטידים, וכתוצאה מכך שינוי המסה המולקולרית לכאורה ניתן בעקבות בקלות על ג'ל מרחביות-דף4. רדיואקטיביות יש יתרונות ניכר על טכניקות דומות כגון cycloheximide רודף, איפה סינתזה של חלבון הרומן מנועה, כמו טיפולי ארוך רעילים לתאים, אינה שוללת את הרוב המכריע של מבוגר, מצב יציב מהחלבונים ניתוח, כמו כמה חלבונים יש מחצית החיים של ימים. ההשוואה של חלבונים תחת שניהם nonreducing הפחתת התנאים מאפשר הניתוח של היווצרות קשר דיסולפידי, צעד חשוב בקיפול של הרבה חלבונים הפרשה4,5,6, 7.

כאן אנו מתארים שיטה כללית לניתוח של קיפול חלבונים ותעבורה תאים שלמים, תוך שימוש בגישה רדיואקטיבי. צ'ייס דופק. בעוד אנחנו כיוונת לספק שיטת כמו מפורט ככל האפשר, הפרוטוקול פוטנציאלי כמעט בלתי מוגבלת של הסתגלות ויאפשר אופטימיזציה ללמוד חלבונים ספציפיים של כל קורא.

שני פרוטוקולים הדופק חלופי-צ'ייס, אחד עבור תאים חסיד (שלב 1.1 של פרוטוקול המובאת כאן) ואחד עבור השעיה תאים (שלב 1.2 של פרוטוקול המובאת כאן) הינם מסופקים. התנאים הניתנים כאן מספיקים להמחיש חלבון שבאה לידי ביטוי עם רמות בינונית-גבוהה הביטוי. אם הקורא הוא עובד עם חלבונים ביטוי לקוי או תנאים posttreatment שונים, כגון immunoprecipitations מרובות, זה הכרחי להגדיל את גודל המנה או הנייד שלי כראוי.

לצ'ייס הדופק ההשעיה, הדגימות צ'ייס שצולמו לכל נקודת זמן כל לקוחים מתוך שפופרת אחת של תאים. השלבים לשטוף אחרי הדופק מושמטים; במקום זאת, בהמשך תיאגוד 35S נמנעת באמצעות דילול עם עודף גבוה של מתיונין ללא תווית, ציסטאין.

הפרוטוקולים הציג להשתמש רדיואקטיבי 35התווית על-ידי S ציסטאין ומתיונין לעקוב אחר תהליכים קיפול חלבונים תאיים. כל הפעולות עם ריאגנטים רדיואקטיבי צריכה להתבצע באמצעות אמצעי הגנה מתאימים כדי למזער כל חשיפה של המפעיל לבין הסביבה לקרינה רדיואקטיבית, ניתן לבצע בתוך מעבדה ייעודית. . המרדף הדופק תיוג טכניקה הוא יעיל יחסית בזמנים קצרים הדופק (< 15 דקות), פחות מ 1% מהסכום ההתחלתי של רדיואקטיביות מעוגנת את החלבונים עתה מסונתז. לאחר העשרת של חלבון המטרה באמצעות immunoprecipitation, המדגם מרחביות-דף מכיל פחות מ- 0.05% מהסכום ההתחלתי של רדיואקטיביות.

למרות מתיונין 35S של ציסטאין תיוג מיקס מתייצב, כמה ריקבון, מניב רדיואקטיבי תרכובות נדיפות, תתרחש. כדי להגן על החוקר, את המנגנון, כמה אמצעי זהירות יש לנקוט. החוקר תמיד צריך לציית? לחוקים בטיחות קרינה מקומית, ניתן ללבוש של פחם סיעוד מסכה, מלבד חלוק מעבדה וכפפות (זוגי). מניות צלוחיות עם 35S מתיונין, ציסטאין תמיד אמור להיפתח בשכונה fume, או תחת נקודת שאיפה מקומיים. מעבדה ידוע זיהום שהנקודות צנטריפוגות, פיפטות, מרחצאות מים, חממות, ומנענעים. הזיהום של אזורים אלה מצטמצם באמצעות פיפטה טיפים עם מסנן פחם, צינורות microcentrifuge חיובי-חותם (ראה טבלה של חומרים), אקווריום פחם ספוגים מים אמבטיות, פחם מסנן עיתונים מודבקים את הכלים. צ'ייס דופק, פחם משמר מערכת השאיפה, ואת המיקום של מאכלים המכילים גרגרים פחם חממות, מיכלי אחסון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ריאגנטים רדיואקטיבי והתהליכים שטופלו בהתאם המקומי אוניברסיטת אוטרכט קרינה חוקים ותקנות.

1. דופק צ'ייס

  1. הדופק צ'ייס על תאים חסיד
    הערה: אמצעי האחסון שניתנו כאן מבוססים על 60 מ מ תא תרבות מנות. 35 מ מ או מנות 100 מ מ, הכפילו את אמצעי האחסון ב- 1/2 או 2, בהתאמה. פרוטוקול זה משתמש זמן הדופק של פי 10 דקות וצ'ייס של 0, 15, 30, 60, 120 ו- 240 דקות. אלה יכולים להיות מגוונים בהתאם חלבונים ספציפיים הנלמדים (נדונה להלן).
    1. זרע תאים חסיד (למשל, HEK 293, הלה, צ'ו) במנות תרבות תא 60 מ מ 6, כך הם יהיו subconfluent (80% - 90%) ביום של המרדף דופק. השתמש צלחת לפחות אחת לכל נקודת זמן ו/או תנאי.
    2. אם נדרש, transfect את התאים עם ריאגנטים זמינים מסחרית תקנים בהתאם להוראות היצרן; לחלופין, לשווק מגלי8 התאים יום אחד לפני. צ'ייס הדופק הניסוי עם הבונה המתאים לביטוי.
    3. לשטוף את הכלים עם 2 מ של מאגר לשטוף (של האנק מאוזנת תמיסת מלח [HBSS]), להוסיף 2 מ של רעב בינוני (נורמלי תרבות בינוני חסר מתיונין, ציסטאין, סרום שור בעובר [FBS], כגון בינוני חיוני מינימלי [מ] ללא מתיונין, ציסטאין אבל עם 10 מ מ HEPES, pH 7.4), למקם את הכלים 37 ° C humidified חממה עם 5% CO2 למשך 15 דקות.
    4. להעביר את הכלים המדפים באמבט מים prewarmed-37 ° C כך הם במגע עם מים אך לא לצוף. להפעיל טיימר.
    5. בגיל 40 s, תשאף המדיום הרעבה, ולהורות על 600 µL של פתרון הדופק (רעב מדיה + צלחת µCi/35 מ מ 55 תווית, לראות את הפתק הקודם שלב 1.1.1) אל הפיפטה ולהוסיף אותו בעדינות במרכז המנה-בדיוק 1 דק. חזור על שלב זה במרווחים 1 דקות ב- t הוא מנות הנותרים. להתחיל עם הדגימה צ'ייס הארוך כדי לחסוך זמן במהלך הניסוי שלך.
      הערה: בעת טיפול חומר רדיואקטיבי, זה חיוני לעקוב אחר הזהירות המתאימה ואת מקומי חוקים ותקנות למניעת חשיפה מקרית ו/או זיהום.
    6. -בדיוק 11 דקות ועבור כל המנות הבאות, חוץ המדגם צ'ייס 0 דקות, להוסיף 2 מ של צ'ייס בינוני ישירות לצלחת תשאף את זה, שוב, להוסיף 2 מ של צ'ייס בינוני. חזור על שלב זה במרווחים 1 דקות עבור מנות הנותרים. העברת כל המנות חממה 37 ° C.
    7. בדיוק 16 דקות, להוסיף 2 מ של צ'ייס בינוני (נורמלי תרבות בינוני + 10 מ מ HEPES [pH 7.4], 5 מ מ ציסטאין ומתיונין 5 מ מ) ישירות אל המנה מדגם 0 דקות על המדיום הדופק להפסיק תיוג; לאחר מכן, תשאף מיד, להעביר את הצלחת צלחת אלומיניום מקורר ולהוסיף 2 מ של מאגר עצירה כקרח (HBSS + 20 מ מ N- ethylmaleimide [NEM]).
      הערה: זהו המדגם צ'ייס דקות 0. עבור דוגמה זו, להמשיך היישר לשלב 1.1.9.
    8. העברת כל מנה צ'ייס בחזרה אל המים הרותחים 2 דקות לפני כל הזמן צ'ייס (למשל, מין 24 על מרדף 15 דקות), בזמן המדויק צ'ייס (למשל, 26 דקות עבור מרדף 15 דקות), תשאף התקשורת צ'ייס (או להעביר אותו צינור microcentrifuge אם בעקבות יחסי ציבור הפרשת otein) ולהעביר את הצלחת צלחת אלומיניום מקורר. להוסיף 2 מ של מאגר עצירה קר כקרח.
    9. דגירה כל המנות על הקרח במאגר עצירה ≥5 דקות; לאחר מכן, תשאף הפתרון להפסיק, לשטוף אותו עם 2 מיליליטר כקרח להפסיק פתרון. האחות לשטוף את ואת lyse מנות עם 600 µL של פירוק מאגר (באגירה פוספט תמיסת מלח [PBS] + אבקת nondenaturing [ראה טבלה של חומרים] מעכבי פרוטאז + 20 מ מ NEM). להשתמש במגרדת התא כדי להבטיח כי הכלים הם lysed באופן כמותי.
    10. להעביר את lysate 1.5 mL microcentrifuge ובשעות צנטריפוגה עבור 10 דקות ב 15,000-20,000 x g ו- 4 ° C עד הצניפה הגרעינים.
  2. הדופק צ'ייס עבור תאים השעיה
    הערה: כדי להבטיח תיוג יעיל, תאים צריך להיות פעמו-ריכוז של 3 x 106 5 x 106 תאים למ"ל, כרכים צ'ייס צריך להיות 4 x האחסון דופק. בדוגמה הבאה, אנחנו פעמו 5 x 106 תאים נפח של 1 מ ל 10 דקות, להניב חמש צ'ייס זמן נקודות (0, 15, 30, 60 ו- 120 דקות) של 1 מ"ל, המכיל תאים6 עונה 1 פרק 10 לכל נקודת זמן. כל הפתרונות יהיו זהים לאלה בסעיף 1.1.
    1. התרבות התאים ההשעיה (למשל, 3T3, Jurkat) על פי פרוטוקול שפורסמו בעבר9 כך יש מספר מספיק של תאים בזמנו של הניסוי, לפחות עונה 1 פרק 106 תאים בכל פעם הצבע ו/או תנאי.
    2. אם נדרש, transfect תאים עם ריאגנטים זמינים מסחרית תקנים על פי הוראות היצרן, או לשווק מגלי8 התאים יום אחד לפני. צ'ייס הדופק הניסוי עם הבונה המתאים לביטוי.
    3. גלולה 5 x 106 תאים לכל תנאי בשפופרת 50 מל במשך 5 דקות ב 250 x g בטמפרטורת החדר, ותוא וקינ 1 x 5 מ של רעב מדיה, גלולה אותם שוב, ואני resuspend אותם ב 1 מ"ל של רעב מדיה.
    4. להעביר את התאים באמבט מים 37 ° C, דגירה אותם עבור 10-25 מינימלית להתסיס הצינורות כל 10-15 דקות כדי למנוע את התאים ליישוב בתחתית.
    5. התחל את הטיימר. ב בדיוק 1 דקה, להוסיף µCi 275 (55 µCi/1 x 106 תאים) של תווית מדולל ישירות אל הצינור המכיל תאים ו מערבולת לערבב.
      הערה: בעת טיפול חומר רדיואקטיבי, זה חיוני לעקוב אחר הזהירות המתאימה ואת מקומי חוקים ותקנות למניעת חשיפה מקרית ו/או זיהום.
    6. בדיוק 11 דקות, הפסיק תיוג על-ידי הוספת 4 מ"ל של צ'ייס מדיה. לערבב המדגם ולהעביר מיד 1 מ"ל ל צינור 15 מ"ל בקרח, המכיל 9 מיליליטר כקרח להפסיק פתרון.
      הערה: זהו המדגם צ'ייס דקות 0.
    7. חזור על שלבים אלה עבור כל נקודת זמן רצופים. לאחר כל הזמן נקודות נאספים, גלולה את התאים עבור 5 דקות ב x 250 g ב- 4 מעלות צלזיוס. האחות המדיום (או להעביר אותו צינור 15 מ"ל אם בעקבות הפרשת חלבון). לשטוף את התאים עם 5 מיליליטר להפסיק פתרון, גלולה את התאים עבור 5 דקות ב x 250 g ב- 4 מעלות צלזיוס.
    8. האחות הפתרון להפסיק, לחלוטין lyse התאים עם 300 µL מאגר פירוק קר כקרח, דגירה אותם במשך 20 דקות על קרח כדי להבטיח פירוק מוחלט. להעביר את lysate 1.5 mL microcentrifuge ובשעות צנטריפוגה 10 דקות ב 15,000-20,000 x g ב- 4 ° C עד הצניפה הגרעינים.

2. Immunoprecipitation

  1. לשלב נוגדנים (ראה את הדיון) ו- 50 µL של immunoprecipitation חרוזים (למשל, חלבון A-Sepharose) (10% השעיה [וי/v] מאגר פירוק + 0.25% אלבומין שור [BSA]) ב- microcentrifuge צינור, דגירה אותם ב 4 ° C ~ 30 דקות ב שייקר.
  2. גלולה של חרוזי 1 דקות ב x 12,000 g בטמפרטורת החדר, וארוקן את תגובת שיקוע. להוסיף 200 µL של lysate התערובת נוגדן-חרוז, דגירה ב 4 ° C ב שייקר 1 h או ראש-ראש-נגמר אם דורש immunoprecipitation > 1 h.
  3. גלולה של חרוזי 1 דקות ב x 12,000 g בטמפרטורת החדר. וארוקן את תגובת שיקוע והוסף 1 מ"ל immunoprecipitation שטיפת המאגר. מקם את הדגימה ב שייקר בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
  4. גלולה החרוזים כפי שמתואר בשלב 2.3 וחזור לשטוף את 1 x. לאחר מכן, וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend את החרוזים ב 20 µL טה מאגר, pH 6.8 (10 מ"מ טריס-HCl, 1 מ מ EDTA). מערבולת המדגם.
  5. להוסיף 20 µL של 2 x דוגמת המאגר ללא הסוכן של צמצום, מערבולת, אחמם את זה למשך 5 דקות ב 95 ° C, ו מערבולת שוב.
    הערה: אם רק הכנת דוגמאות תוך צמצום, 2 µL של 500 מ מ DTT להוסיף בשלב זה. לאחר מכן, המשך לשלב 2.7.
  6. גלולה החרוזים כפי שמתואר בשלב 2.3. להעביר µL 19 של תגובת שיקוע nonreduced צינור microcentrifuge טריים המכילים µL 1 של 500 מ מ DTT, centrifuge את הדגימה, ואת מערבולת בעבר חימום זה עבור 5 דקות ב 95 ° C שוב.
  7. בדוגמה עבור 1 דקות ב x 12,000 g; זוהי הדוגמה מופחת. תירגע עד לטמפרטורת החדר ומוסיפים µL 1.1 של 1 מ' NEM את מופחת והן את הדגימה nonreduced. מערבולת, ספין למטה הדגימות.

3. מרחביות-דף

  1. ראשית, קובעים את המתאים מרחביות-דף פתרון ג'ל אחוז עבור החלבון עניין. לדוגמה, HIV-1 gp120, כאשר deglycosylated, פועל במהירות ~ 60 kDa ומנותח ב- 7.5% ג'ל.
  2. להכין לתערובת ג'ל פתרון ללא TEMED על פי הוראות היצרן (x % אקרילאמיד, 375 מ"מ טריס-HCl [pH 8.8,] מרחביות 0.1% [w/v], ו 0.05% קירור [APS] [w/v]), דגה תחת ואקום עבור > 15 דקות. בעוד התערובת ג'ל הוא degassing, ביסודיות לנקות צלחות זכוכית ג'ל עם 70% אתנול ורקמות נטולת ולמקם אותם לתוך מנגנון הליהוק.
  3. הוסף TEMED לתערובת ג'ל פתרון (ב ריכוז סופי של 0.005% [וי/v]), לערבב ביסודיות, פיפטה בין לוחות זכוכית, עוזב ~1.5 ס מ מרחב הג'ל הערימה. כיסוי את הג'ל עם יונים H2O או אלכוהול איזופרופיל ובזהירות אנו נותנים פולימריזציה.
  4. ברגע הג'ל פתרון כולל polymerized, להכין לתערובת ג'ל הערימה (אקרילאמיד 4%, מ מ 125 [pH 6.8], טריס-HCl 0.1% מרחביות [w/v], 0.025% APS [w/v]).
  5. ריקון העליון של הג'ל פתרון עם יונים H2O ולהסיר, אז כל המים.
    הערה: השתמש נייר סינון כדי להסיר את הטיפות האחרונות.
  6. להוסיף TEMED לתערובת ג'ל הערימה (0.005% [וי/v]), לערבב ביסודיות, ואת כיסוי הג'ל פתרון עם ג'ל הערימה והכנס מסרק 15-. טוב. ברגע הג'ל הערמה יש polymerized, להעביר אותו התא פועל ולמלא התאים העליונים והתחתונים עם הפעלת מאגר (25 מ מ טריס-HCl, גליצין 192 מ"מ [pH 8.3] ו- 0.1% מרחביות [w/v]).
  7. לטעון µL 10 מדגם לכל ליין minigel 15-ליין. להימנע מטעינה את הדגימות הראשון ולא את הסמטה האחרונה הג'ל וטען המאגר מדגם nonreducing ב כל מסלולים ריקים כדי למנוע החיוכים של להקות. לפעול ג'לים-קבוע mA/ג'ל 25 עד החזית צבע היא בחלק התחתון של הג'ל.
  8. הסר את ג'לים הזכוכיות, כתם של ג'לים עם פתרון מכתים חלבון (חומצה אצטית 10%-30% מתנול H2O + 0.25% מבריק הכחול R250 [w/v]) עבור חמש דקות עם עצבנות, ולא לאחר מכן, destain במשך 30 דקות עם destaining פתרון (צביעת פתרון ללא R250 כחול מבריק).
  9. לארגן ג'ל פנים כלפי מטה על פלסטיק לעטוף, אז, במקום נייר כרומטוגרפיה 0.4 מ מ מעליהם. מניחים ג'ל כריך כרומטוגרפיה הנייר-הצד למטה על גבי ג'ל מייבש. עקבתי אחרי ההוראות של היצרן, לייבש את ג'לים עבור 2 h ב- 80 מעלות צלזיוס.
  10. להעביר את ג'לים מיובשים קסטה, כיסוי אותם עם מסך קולנוע או זרחן autoradiography. אם משתמש autoradiography סרט, שלב זה חייב להתבצע בחדר חשוך.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

קיפול ואת הפרשת HIV-1 gp120 לצ'ייס הדופק חסיד מוצג באיור2. הג'ל nonreducing (תאים NR באיור) מציגה קיפול חמצוני של gp120. מיד אחרי הדופק תיוג של 5 דקות (מינימום 0 צ'ייס) gp120 שמופיע בתור להקת ' מאטום לשקוף ' גבוה יותר בג'ל ולאחר בהמשך צ'ייס, הלהקה נודד למטה הג'ל דרך אפילו יותר תופס קיפול intermediates (IT) עד הוא מצטבר בלהקה חזק (NT) זה מייצג gp120 מקופל באופן מקורי. מצב זה מתרחש כפי היווצרות חוב דיסולפידי מגביר את הקומפקטיות של החלבון, גורם לו להעביר מהר יות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

. צ'ייס הדופק שיטות היו חיוניים לפיתוח הבנה המדענים של חלבון מתקפל לתוך תאים שלמים. ניסינו לספק שיטה זה כמו כללי ככל האפשר, גישה זו יש הפוטנציאל של וריאציות כמעט בלתי מוגבלת ללמוד תהליכים שונים המתרחשים בזמן קיפול, את התחבורה ואת החיים של חלבונים בתוך התא.

בעת ביצוע מרדף הדופק באמצעות תאים חסיד במנות, זה חיוני לטיפול כל מנה זהה ככל האפשר, צלחת נפרדת משמש עבור כל נקודת זמן ו/או תנאי בניסוי. במיוחד עבור הדופק קצר וזמני צ'ייס (< 5 דקות), זה חיוני כדי לשמור על שליטה הדוקה על הפעמים הדופק וצ'ייס (ע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

המחברים תודה לכל החברים של המעבדה Braakman, מעבר, להציג, דיונים פוריים שלהם ולעזור בפיתוח שיטות שהוצגו במאמר זה. הפרויקט קיבל מימון של המועצה האירופית למחקר תחת של האיחוד האירופי תכנית המסגרת השביעית (האיחוד FP7/2007-2013) N ° 235649 והן הולנד הארגון של מדעי למחקר (בתחרות) תחת אקו-תוכנית N ° 711.012.008.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה בטוחיםSarstedt72.706.400
חומצה אצטיתSigmaA6283חומצה אצטית קרחונית
BAS אחסון מסך זרחן 20x25 ס"מGE מדעי החיים28956475
ברומופנול כחולסיגמאB8026ביולוגיה מולקולרית כיתה
Carestream Biomax MR סרטיםקודאקZ350370-50EA
אמצעי תרבית תאיםשוניםN / Aמדיה של תרבית תאים רגילה עבור קווי תאים ספציפיים בשימוש
מדיה של תרבית תאים, ללא מתיונין/ציסטאיןN/Aניסוח מדיה זהה לאמצעי תרבית רגילים למשל DMEM / MEM / RPMI, חסר
נייר סינון פחםWhatman1872047
קצות פיפטה מסוננים פחםמולקולרי מוצרים ביולוגיים5069B
פחם ואקו-מגןWhatman67221001
Coomassie Brilliant Blue R250Sigma112,553לאלקטרופורזה
ציסטאיןסיגמאC7352כיתה ביולוגיה מולקולרית, הכינו מלאי של 500 מ"מ, אחסן ב -20 
Dithiothreitol (DTT)Sigma10197777001ביולוגיה מולקולרית כיתה
EasyTag Express35S תערובת תיוג חלבוןPerkin ElmerNEG772014MCבגודל אחר של תווית זמינות בהתאם לשימוש,
EDTASigmaE1644ביולוגיה מולקולרית כיתה
ציוד לייבוש ג'לשוניםN/A
גליצרולסיגמאG5516ביולוגיה מולקולרית
כיתה 3 נייר כרומטוגרפיהGE Life Sciences3003-917
תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS)Gibco24020117
Kimwipes VWR21905-026
MESSigma M3671ביולוגיה מולקולרית כיתה
מתנולסיגמאMX0490 
MethionineSigmaM5308כיתה ביולוגיה מולקולרית, הכינו מלאי של 250 מ"מ, אחסן ב-20
ציוד יציקה/ריצה מיניג'לשוניםN/A
NaClSigmaS7653ביולוגיה מולקולרית בדרגה
N-ethylmaleimideSigmaE3876ביולוגיה מולקולרית, הכינו מלאי 1M ב-100% אתנול, אחסן ב-20
PBSSigmaP5368ביולוגיה מולקולרית כיתה
חלבון-A חרוזי זרימה מהירהספרוז GE בריאות-טיפול17-5280-04
נתרן דודציל סולפט (SDS)SigmaL3771ביולוגיה מולקולרית כיתה
טריטון X-100סיגמאT8787ביולוגיה מולקולרית כיתה
בסיס טריזמה (Tris)SigmaT6066ביולוגיה מולקולרית כיתה
טייפון IP הדמיה ביו-מולקולריתAmersham29187194
Unwire מתלה מבחנה 20 מ"מ לאמבטיית מיםNalgene5970-0320PK
שונים מתיונין וציסטאין קבוצות מגבונים עדינים של

מקורות

  1. Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER. Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).
  2. Pisoni, G. B., Molinari, M. Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation. Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).
  3. Lamriben, L., Graham, J. B., Adams, B. M., Hebert, D. N. N-Glycan-based ER Molecular Chaperone and Protein Quality Control System: The Calnexin Binding Cycle. Traffic. 17 (4), 308-326 (2016).
  4. Snapp, E. L., et al. Structure and topology around the cleavage site regulate post-translational cleavage of the HIV-1 gp160 signal peptide. Elife. 6, 26067(2017).
  5. Braakman, I., Hoover-Litty, H., Wagner, K. R., Helenius, A. Folding of influenza hemagglutinin in the endoplasmic reticulum. Journal of Cell Biology. 114 (3), 401-411 (1991).
  6. Jansens, A., van Duijn, E., Braakman, I. Coordinated nonvectorial folding in a newly synthesized multidomain protein. Science. 298 (5602), 2401-2403 (2002).
  7. Land, A., Braakman, I. Folding of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein in the endoplasmic reticulum. Biochimie. 83 (8), 783-790 (2001).
  8. Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function. Journal of Visualized Experiments. (117), e54698(2016).
  9. Das, A. T., Land, A., Braakman, I., Klaver, B., Berkhout, B. HIV-1 evolves into a nonsyncytium-inducing virus upon prolonged culture in vitro. Virology. 263 (1), 55-69 (1999).
  10. Chen, W., Helenius, J., Braakman, I., Helenius, A. Cotranslational folding and calnexin binding during glycoprotein synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (14), 6229-6233 (1995).
  11. Daniels, R., Kurowski, B., Johnson, A. E., Hebert, D. N. N-linked glycans direct the cotranslational folding pathway of influenza hemagglutinin. Molecular Cell. 11 (1), 79-90 (2003).
  12. Ferreira, L. R., Norris, K., Smith, T., Hebert, C., Sauk, J. J. Association of Hsp47, Grp78, and Grp94 with procollagen supports the successive or coupled action of molecular chaperones. Journal of Cellular Biochemistry. 56 (4), 518-526 (1994).
  13. Hoelen, H., et al. The primary folding defect and rescue of DeltaF508 CFTR emerge during translation of the mutant domain. PLoS One. 5 (11), 15458(2010).
  14. Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. Folding of CFTR is predominantly cotranslational. Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).
  15. Hagiwara, M., Ling, J., Koenig, P. A., Ploegh, H. L. Posttranscriptional Regulation of Glycoprotein Quality Control in the Endoplasmic Reticulum Is Controlled by the E2 Ub-Conjugating Enzyme UBC6e. Molecular Cell. 63 (5), 753-767 (2016).
  16. Copeland, C. S., Doms, R. W., Bolzau, E. M., Webster, R. G., Helenius, A. Assembly of influenza hemagglutinin trimers and its role in intracellular transport. Journal of Cell Biology. 103 (4), 1179-1191 (1986).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

SDS PAGEImmunoprecipitation
ניתוח של קיפול חלבונים, תחבורה, והשפלה בתאים חיים על ידי הדופק רדיואקטיבי צ'ייס
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.