מאמר שיטה

דם היקפי הדם נויטרופילים בידוד עבור חקירת פרקינסון הקשורים LRRK2 קינאז מסלול על ידי הערכת Rab10 זירחון

DOI:

10.3791/58956

⸱

21 במרץ 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1MRC Protein Phosphorylation and Ubiquitylation Unit, School of Life Sciences, University of Dundee, 2The Michael J. Fox Foundation for Parkinson's Research, 3Department of Medical and Molecular Genetics, Indiana University School of Medicine, 4Morton and Gloria Shulman Movement Disorders Centre and the Edmond J. Safra Program in Parkinson's Disease, Toronto Western Hospital, University of Toronto, 5Division of Cell Signalling and Immunology, School of Life Sciences, University of Dundee, 6Division of Molecular and Clinical Medicine, School of Medicine, Ninewells Hospital and Medical School, University of Dundee

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוטציות ב לאוצין העשיר חזרה לחזור 2 גנים (LRRK2) לגרום למחלת פרקינסון תורשתית. פיתחנו שיטה קלה ואיתנה להערכת זרחון LRRK2 נשלט של Rab10 בדם היקפי הדם נויטרופילים. הדבר עשוי לסייע בזיהוי אנשים עם פעילות מסלול מוגברת של LRRK2 קינאז.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הלוצין העשיר חוזר קינאז 2 (LRRK2) הוא הגן השכיח ביותר במחלת פרקינסון תורשתית (PD) וכל מוטציות LRRK2 פתוגניים התוצאה היפרהפעלה של הפונקציה קינאז שלה. כאן, אנו מתארים שיטת קל ויציב לכמת LRRK2 קינאז פעילות מסלול היקפי דם היקפיים על ידי מדידת LRRK2 זרחון מבוקר של אחד מצעים פיזיולוגיים שלה, Rab10 ב טראונין 73. הניתוח החיסוני המתואר מחייב מאוד בררני ופוספנטי הנוגדן כי מזהה את Rab10 Thr73 אפירופה זרחזיום על ידי LRRK2, כגון נוגדן MJFF-pRab10 הארנב מונובטיים. הוא משתמש דם היקפית אנושי נויטרופילים, כי דם היקפי נגיש בקלות נויטרופילים הם מרכיב שופע הומוגנית. חשוב מכך, נויטרופילים לבטא רמות גבוהות יחסית של LRRK2 ו Rab10. חיסרון פוטנציאלי של נויטרופילים הוא הפעילות הפנימית הגבוהה סרין פרוטאז שלהם, אשר מחייבת את השימוש של מעכבי פרוטאז חזק מאוד כגון diisopropylfluorophosphate הרעלן העצבי זרחן (DIFP) כחלק מאגר לפירוק. עם זאת, נויטרופילים הם משאב רב ערך עבור מחקר לתוך פעילות מסלול LRRK2 קינאז ב vivo וצריך להיחשב עבור הכללה לתוך משטרת ביוריאטורי אוספים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נסיונות להאט או להפסיק את מחלת פרקינסון (PD) נכשלו עד כה. הגילוי של מוטציות היפראותיים ב-לאוצין לחזור על קינאז 2 (LRRK2) הגורמות ו/או הגברת הסיכון למשטרה הובילה לפיתוח מעכבי LRRK2 קינאז1,2,3. אלה נכנסו עכשיו ניסויים קליניים4. הפונקציה המדויקת של LRRK2 אינו ברור, אבל התקדמות מרכזית כבר זיהוי של מערכת החלבונים של רב gtpase, כולל Rab10, כמו מצעים פיסיולוגיים בתום הראשון של הLRRK2 קינאז5,6,7. אתגרים מרכזיים בעידן של מחלות-שינוי therapeutics הם סמנים ביוכימיים של מצב הפעלה LRRK2 קינאז והתחייבות היעד של מעכבי LRRK2 קינאז.

עד כה, הסמן העיקרי של פרמקוטיק לLRRK2 מעכבי ב vivo הייתה מקבץ של שאריות סרין בצורה מצטברת של LRRK2, בפרט סרין 935, אשר הפכו להיות בתגובה למעכבי LRRK2 שונים8,9. עם זאת, סרין 935 זרחון אינו מתאם עם פעילות פנימית LRRK2 קינאז הפנימי משום שהוא אינו זרחי במישרין על-ידי LRRK2 והוא עדיין זרחבקינאז-לא פעיל LRRK210. LRRK2 קינאז פעילות מתאימה היטב עם הוספולציה של סרין 1292, אבל זה במונחים מעשיים לא מתאים לפעילות אנדודוגני LRRK2 קינאז על-ידי ניתוח חיסוני כתמי של תמציות תאים שלמות בשל היעדר הנוכחי של נוגדנים אמינים ופוספוסקיים עבור אתר זה10,11.

פיתחנו שיטת חזק וקל לכמת LRRK2 קינאז פעילות מסלול בתאי הדם היקפיים האדם המודד LRRK2 זרחון מבוקר של חלבון היעד הפיזיולוגי שלה Rab10 ב טראונין 7311. דם היקפי נגיש בקלות על ידי ונציה, שהוא סיכון נמוך והליך מהיר הגורם אי-נוחות מינימלית. אנו מתמקדים בגוף היקפי דם נויטרופילים כי הם מהווים שופע (37-80% של כל כדוריות הדם הלבנות) ואת האוכלוסייה תאים הומוגנית המבטא רמות גבוהות יחסית של שני LRRK2 ו Rab1011. יתר על כן, דם היקפי נויטרופילים יכול להיות מבודד במהירות וביעילות על ידי שימוש בגישה שלילית אימונוגנטית. כדי להבטיח כי הנצפים לאחר מכן Rab10 זילציה מתווכת על ידי LRRK2, כל אצווה של נויטרופילים הוא מודבטים עם או בלי חזק וסלקטיבי LRRK2 קינאז מעכבי (אנו משתמשים וממליצים mli-2)2,12. זה ואחריו לאחר מכן הפירוק התא במאגר המכיל את מעכב פרוטאז diisopropyl fluorophosphate (difp), אשר הכרחי לדיכוי פעילות סרין פרוטאז מהותי כי ידוע להיות גבוה נויטרופילים13. לניתוח הסופי של האנליזה הכמותית, אנו ממליצים על שימוש בנוגדן MJFF-pRab10 הארנב שמזהה במפורש את Rab10 Thr73-פוספופאפיפ ואינו מגיב באמצעות חלבונים אחרים זרחתיים מסוג14. סלקטיביות וספציפיות של נוגדן זה אומת במודלים overexpression של חלבונים שונים של ראב ו A549 Rab10 לנקוש קו תא14. כך, אנו למדוד את ההבדל Rab10 זרחון ב נויטרופילים lysates כי כבר טופלו עם וללא חזק וסלקטיבי LRRK2 קינאז מעכב2. לחילופין, ניתן לנתח דגימות גם בשיטות אחרות, כגון ספקטרומטר מסה כמותי.

לסיכום, LRRK2 שבשליטת Rab10 זרחון הוא סמן מעולה של פעילות LRRK2 קינאז LRRK2 זרחון ב סרין 935 ו-היקפי הדם נויטרופילים היקפיים הם משאב רב ערך עבור מחקר PD לתוך LRRK2. הפרוטוקול שלנו מספק מעשה יציב וקל לחקור פעילות מסלול LRRK2 דם היקפיים נויטרופילים ומאפשר ריבוד ביוכימיים של אנשים עם פעילות מוגברת LRRK2 קינאז15. חשוב מכך, אנשים כאלה עשויים להפיק תועלת מטיפול מעכב LRRK2 קינאז עתידיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

על פי רגולציה בבריטניה המקומית כל המניפולציות וליטוף של דם אנושי נעשים בארון בטיחות בקטגוריה 2. כל ההליכים בוצעו בהתאם לועדת האתיקה המקומית וכל המשתתפים סיפקו הסכמה מושכלת.

1. הכנה

  1. הכינו 0.1 mL של מניות EDTA פתרון 1 המכיל 100 mM EDTA ב-פוספט באגירה מלוחים (PBS).
  2. הכינו 60 mL של פתרון מניות EDTA 2 המכיל 1 מ"מ EDTA ב-PBS.
  3. הכנת מאגר לפירוק המכיל 50 mM טריס-HCl (pH = 7.5), 1% (v/v) טריטון X-100, 1 מ"מ EGTA, 1 מ"מ Na3VO4, 50 mm naf, 10 מ"מ β-Glycerophosphate, 5 מילימטר נתרן פירופוספט, 0.27 M סוכות, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1 X מעכב פרוטאז קוקטייל, אחד μg/mL MICROCYSTIN-LR, ו 0.5 מילימטר diisopropyl fluorophosphate (difp).
    הערה: המחברים משתמשים באופן שגרתי במוצר EDTA-free, אך קוקטייל מעכב פרוטאז המכיל EDTA צריך גם לעבוד. מאגר הליזה ניתן לעשות מראש ללא β-mercaptoethanol, מעכבי פרוטאז, microcystin-LR, ו DIFP, ומאוחסן 4 ° צ' עד השימוש. ודא כי β-mercaptoethanol, מעכבי פרוטאז, microcystin-LR, ו DIFP הוא הוסיף רק מיד לפני השימוש.
    התראה: DIFP הוא רעיל ויש לטפל בזהירות בתוך מכסה המנוע בעקבות בריאות מקומית והערכת סיכונים בטיחות. ניתן להוסיף DIFP למאגר הליזה ולהשתמש בו באופן מיידי. לחילופין, מאגר הפירוק המלא המכיל את כל הרכיבים האחרים, כולל DIFP, ניתן לצוטט ולאחסן ב-80 ° c לשימוש הבאים במשך 4 שבועות לפחות.

2. בידוד נויטרופילים מכל דם

  1. לאסוף 10 מ ל של דם לתוך צינור איסוף דם. מערבבים בעדינות על ידי היפוך צינורות 7-8x.
  2. העברה 10 מ ל של דם לתוך צינורית חרוט 50 mL.
  3. הוסף 100 μL של פתרון מלאי EDTA 1 לדם. מערבבים בעדינות.
  4. הוסף 500 μL של קוקטייל הבידוד (50 μL/mL) מערכת הבידוד נויטרופילים (טבלת חומרים) לדגימת הדם כולה.
  5. מערבולת את החרוזים מגנטי של ערכת הבידוד נויטרופילים עבור 30 s לפני השימוש כדי להשהות מחדש את החרוזים מגנטי עדין מאוד.
  6. הוסף 500 μL של החרוזים המגנטיים לדגימת הדם וערבבו בעדינות על ידי היפוך הצינורית מספר פעמים.
  7. דגירה בטמפרטורת החדר (RT) עבור 5 דקות.
  8. מלאו את הצינור ל 50 mL עם פתרון מניות EDTA 2. מערבבים על ידי בעדינות מאוד ללטף למעלה ולמטה 2 – 3x.
  9. מניחים את הצינור לתוך המגנט ולהסיר את המכסה כדי למנוע עצבנות הבאים של הצינור.
  10. דגירה עבור 10 דקות ב RT.
  11. פיפטה בזהירות ההשעיה התא מועשר המכיל את נויטרופילים לתוך צינור 50 mL החדש.
    הערה: אין לגעת בצד של הצינורית הנמצאת במגע עם המגנט ולהימנע מאיסוף והפרטורציה של תאי הדם האדומים בתחתית הצינורית. השאירו כ 10 מ ל של ההשעיה של תא דם אדום מאחורי בתחתית הצינור.
  12. מערבולת החרוזים מגנטי עבור 30 s לפני השימוש ולהוסיף 0.5 mL של חרוזים מגנטיים הצינור המכיל נויטרופילים מועשר. מערבבים בעדינות על ידי היפוך השפופרת.
  13. דגירה ב RT עבור 5 דקות.
  14. מניחים את הצינור לתוך המגנט ולהסיר את המכסה כדי למנוע עצבנות הבאים.
  15. דגירה ב RT עבור 5 דקות.
  16. פיפטה בזהירות ההשעיה התא מועשר המכיל את נויטרופילים לתוך צינור 50 mL החדש.
    הערה: אל תגעו בצד של הצינור כי הוא במגע עם המגנט. השאירו כ-5 מ ל של ההשעיה בתחתית השפופרת.
  17. כדי להבטיח את ההסרה המלאה של חרוזים מגנטיים מן התערובת התא, למקם את הצינור המכיל את התאים מועשר לתוך המגנט.
  18. דגירה עבור 10 דקות ב RT.
  19. פיפטה בזהירות את ההשעיה התא מועשר כי כעת מכילה נויטרופילים טהור לתוך צינור 50 mL החדש.
    הערה: אל תגעו בצד של הצינור כי הוא במגע עם המגנט. השאירו כ-5 מ ל של ההשעיה בתחתית השפופרת.
  20. לערבב את התאים מבודדים עם 1 מ"מ מניות EDTA פתרון 2 לכרך הסופי של כ 41 mL. . פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב
  21. לחלק את הפתרון באופן שווה לשתי שפופרות עם כ 20 מ ל בכל צינור.
  22. צנטריפוגה את שני הצינורות ב 335 x g עבור 5 דקות.
  23. במהלך צנטריפוגה זה לקחת מלאי מעכב MLi-2 (200 μM/1, 000x ריכוז) מתוך-80 ° c מקפיא ולעזוב ב RT לשימוש הבאים.
  24. מיד לאחר הצעד הצנטריפוגה וללא עצבנות של צינורות, לשפוך את supernatant בלי להפריע את כדורי נויטרופילים. השהה מחדש כל גלולה ב-10 מ ל של מדיית תרבות התא (טבלת חומרים) ב-RT על-ידי ליטוף בעדינות של תאים למעלה ולמטה 4x.

3. LRRK2 קינאז טיפול מעכבי של נויטרופילים טהור

  1. תווית צינור אחד "DMSO" ואת הצינור השני "MLi-2".
  2. כדי "DMSO" התווית צינור, להוסיף 10 μL של DMSO ולערבב בעדינות על ידי ליטוף למעלה ולמטה 2x עם צינור 10 מ"ל. כדי "MLi-2" שכותרתו הצינור, להוסיף 10 μL של 200 μM MLi-2 מניות פתרון (ריכוז סופי 200 nM) ולערבב בעדינות על ידי ליטוף למעלה ולמטה 2x עם צינור 10 מ"ל.
  3. מודקון את הדגימות עבור 30 דקות ב RT. לערבב בעדינות על ידי היפוך כל 10 דקות במהלך הדגירה.
  4. במהלך תקופת הדגירה, להסיר 0.5 מניות M DIFP מ-80 ° c מקפיא ומקום בתוך המקפיא על הקרח. הסרת 1 מ"ג/mL מיקרו-LR פתרון מניות מ-80 ° c מקפיא ולעזוב ב RT כדי להפשיר. לקחת סדרת מחלקים (0.25 mL) של מאגר הליזה מתוך המקפיא, לאפשר לו להפשיר ב RT, ולאחר מכן למקם אותו על הקרח לשימוש הבאים.
  5. הכן 1 mL של התרבות התא בינונית המכילה 1 μL של DMSO ולקרוא זה מאגר מחדש DMSO ההשעיה. הכן 1 mL של מדיה RPMI המכיל 1 μL של 200 μM MLi-2 ולקרוא זה מאגר מחדש MLi-2 ההשעיה.
  6. אחרי 30 דקות דגירה התקופה, צנטריפוגה הן צינורות ב 335 x g עבור 5 דקות.
  7. בזהירות להשליך את supernatant בכל צינור מבלי להפריע את הגלולה נויטרופילים.
  8. עבור המדגם DMSO התווית בעדינות להשעות את הגלולה ב 1 מ ל של מאגר הבולם החוזר DMSO ו עבור MLi-2 שכותרתו הצינור, להשעות את הגלולה ב 1 mL של מאגר מחדש MLi-2 ההשעיה.
  9. להעביר את כדורי תא מושעה מחדש לצינורות צנטריפוגה מסומנים המסומנים "DMSO" ו "MLi-2" ו צנטריפוגה שתי הצינורות ב 335 x g עבור 3 דקות.
  10. במהלך השלב הצנטריפוגה, הכן את מאגר הליזה. בתוך מכסה המנוע בזהירות להוסיף 0.25 μL של 0.5 M פתרון DIFP, כמו גם 0.25 μL של 1 מ"ג/מ"ל microcystin-LR למאגר הליזה 0.25 mL. לערבב ולהשאיר על הקרח עד השימוש.
    הערה: הוסף DIFP למאגר הליזה בתוך 15 דקות של פירוק התא, כי DIFP הוא לא יציב יחסית בתמיסה מימית.
  11. מיד לאחר צנטריפוגה, בזהירות לחלוטין להסיר את כל supernatant עם פיפטה מבלי להפריע את הגלולה נויטרופילים ולמקם את הצינורות על הקרח.
  12. מיד להוסיף 100 μL של מאגר הליזה המכיל DIFP ו-microcystine-LR לכל צינור. שימוש 100-200 μL הפיפטה, להשעות מחדש את כדורי התא על ידי ליטוף למעלה ולמטה על 5 – 10x.
  13. ליאוס את התאים בקרח במשך 10 דקות.
  14. צינורות צנטריפוגה ב 20,000 x g עבור 15 דקות ב 4 ° צ' כדי להסיר פסולת תא.
  15. העבר את "DMSO" ו "MLi-2" סופרנטנים המכילים את נויטרופילים לייטים לתוך צינורות צנטריפוגה חדשים. . התעלם מגלולה הפסולת
    הערה: נויטרופילים lysates מוכנים כעת לשימוש או יכול להיות מוקפא בחנקן נוזלי ומאוחסן ב-80 ° c לניתוח עתידי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבדיקה שלנו מאפשרת לחקור את ההפעלה של LRRK2 קינאז PD-הקשורים המשטרה הקשורה בדם היקפי דם נויטרופילים עם LRRK2 תלוי Rab10 זרחון כמו בדיקה. נויטרופילים הם היקפיים ושופע היקפי דם לבנים האוכלוסייה המבטא רמות גבוהות של LRRK2 ו Rab10 חלבונים (איור 1). אוכלוסיית התאים היחידה היחידה בקרב תאי הדם ההיקפיים הנותרים (PBMCs) עם מספרי עותקים גבוהים של שני החלבונים הם מונוציטים, אבל אלה מפצות רק 2 – 12% של כדוריות הדם הלבנות. זה מציין כי דם היקפי נויטרופילים הם ביומטריקס מתאים יותר עבור לימוד LRRK2 שבשליטת ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הוכחה משכנעת קלינית, גנטית, וביוכימית מצביע על תפקיד חשוב עבור LRRK2 ובמיוחד הפונקציה קינאז שלה במחלת פרקינסון7. מעכבי LRRK2 קינאז פותחו והם נכנסים ניסויים קליניים2,4,12. ככזה יש צורך לנצל LRRK2 כסמן עבור מעורבות היעד, כמו גם המטופל ריבוד. הפרוטוקול שלנו מתאר שיטת יציב וקלה לניתוח הפעלת מסלול LRRK2 קינאז כפי שמשתקף על ידי זירחון של המצע הפיזיולוגי שלה Rab10 במאגר הומוגנית של האדם ההיקפי דם נויטרופילים

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למתנדבים הבריאים שתרמו באדיבות דם למחקר הנוכחי. אנו מודים לקרן מייקל ג'יי פוקס לחקר פרקינסון (MJFF) ולמנהיגות המחקר פוקס ביונט (FBN) לתמיכה ולכניסה לפרוטוקול הכתוב ולווידאו. אנו מודים לפרופסור אלכסנדר זיפריץ ' מאוניברסיטת וינה באוסטריה על בחינת הפרוטוקול ושיתוף הפעולה שלנו. אנו מעריכים את התרומות של פול דייוויס לפרויקט (מנהל כללי של MRC PPU). אנו מכירים גם את התמיכה הטכנית המצוינת של זרחון חלבון MRC והיחידה אוביקווילציה (PPU) כלומר סינתזה כימית (נטליה שפירו MLi-2), MRC PPU ריאגנטים ושירותים נוגדנים לטיהור צוותים (מתואם על ידי הילארי McLauchlan וג Hastie). אנו מודים מולר מטאולר ו פרייזר מרדוק מ Vivomotion עבור עזרתם עם עשיית קטעי וידאו ואנימציות. אנו מודים לסטיב סואב מ 81 סרטים לסיוע בעריכות הסופיות. אסתר סממלר נתמכת על ידי מלגת לימודים אקדמית בכירה סקוטית וקיבלה מימון של פרקינסון בבריטניה (K-1706).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1 מ"ל קצות פיפטהSarstedt70.762או שווה ערך
1.5 מ"ל מיקרו צינורותSarstedt72.690.001או שווה ערך
10 מ"ל קצות פיפטה סרסטדט86.1254.025 או שווה ערך
10 μ L קצות פיפטהSarstedt70.113או שווה ערך
15 מ"ל צינור בז Cellstar188 271או שווה ערך
200 μ L קצות פיפטהSarstedt70.760.002או שווה ערך
25 מ"ל טיפים לפיפטה Sarstedt86.1685.001או שווה ערך
ל-50 מ"ל צינור בז Cellstar227 261או שווה ערך
BD Vacutainer Hemogard סגירת פלסטיק K2-EDTA צינורBD BD 367525או שווה ערך
בקמן קולטר אלגרה X-15R צנטריפוגהבקמןאו צנטריפוגה מקבילה עם מסובב דלי שחייה לצינורות בז של 15 מ"ל ו-50 מ"ל במהירות 1000-1200 x
גרם קטגוריה 2 ארון בטיחות ביולוגי
קוקטייל מעכב פרוטאז cOmplete (ללא EDTA) Roche11836170001
DIFP (Diisopropylfluorophosphate) SigmaD0879הכן תמיסת מלאי 0.5M באיזופרופנול תוך שימוש באמצעי זהירות מיוחדים 
דימתיל סולפוקסיד Sigma6250
קרח יבש או חנקן
נוזלי תמיסת מלח חוצצת פוספט של Dulbecco ThermoFisher14190094או שווה ערך
Easy 50 EasySep Magnet Stemcell18002להחזקת 1 x 50 מ"ל צינור חרוטי
EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit Stemcell19666זה מכיל פתרונות הנקראים " קוקטייל בידוד" ו- " חרוזים מגנטיים RapidSpheres
EGTASigmaE3889
צנטריפוגה אפנדורף 5417R צנטריפוגהאפנדורף
אתנול, בבקבוק
חומצה אתילנדיאמינטטראצטית SigmaE6758
איזופרופנול קרח
(דרגה נטולת מים) Sigma278475
Lysis buffer (50 מ"מ Tris-HCl pH 7.5, 1% (v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 מ"מ NaF, 10 מ"מ & בטא;-גליצרופוספט, 5 מ"מ נתרן פירופוספט, 0.27 M סוכרוז, 0.1% (v/v) & בטא;-מרקפטואתנול, 1x cOmplete (ללא EDTA) קוקטייל מעכב פרוטאז (Roche), 1 μ גרם/מ"ל מיקרוציסטין-LR, 0.5 מ"מ דיאיזופרופילפלואורופוספט (DIFP). לחלופין, מאגר ליזה קפוא בכמויות ללא Microcystin-LR, DIFP זמין מ-MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/)
מעכב Merck LRRK2 II (MLi-2)Merck438194-10MGאו שווה ערך (אינהיטור LRRK2 חזק וסלקטיבי)
מיקרוציסטין-LREnzo Life SciencesALX-350-012-M0011 מ"ג/מ"ל מלאי ב-DMSO ואחסן ב-80 מעלות צלזיוס. 
Na3VO4Aldrich450243
NaFSigmaS7920
Odyssey CLx סריקת מערכת הדמיה Western BlotOdyssey
עט
ציוד
RPMI 1640 בינוני ThermoFisher21875034או שווה ערך
נתרן פירופוספטSigmaS22
סוכרוזSigmaS0389
β-גליצרופוספטSigma50020
β-מרקפטואתנולSigmaM3148
<חזק>נוגדנים מומלצים לכתמים מערביים
נוגדן נגד RAB10 (phospho T73) [MJF-R21]abcamab230261
anti-α-tubulinCell Signaling Technologies5174בשימוש ב-1:2000 דילול
עז נגד עכבר IRDye 680LTLI-COR926-68020בשימוש ב-1:10,000 דילול
עז נגד עכבר IRDye 800CWLI-COR926-32210בשימוש ב-1:10,000 דילול
עיזים נגד ארנב IRDye 800CWLI-COR926-32211בשימוש בדילול 1:10,000
MJFF-סה"כ נוגדן עכבר Rab10שנוצר על ידי nanoTools (nanotools.de)לא ישים*בשימוש ב-2 μ ריכוז סופי של גרם/מ"ל; * נוגדן Rab10 הכולל MJFF שנוצר על ידי nanoTools (www.nanotools.de) [11] ימוסחר על ידי קרן מייקל ג'יי פוקס ב-2018
נוגדניםנגד LRRK2 C-terminus  75-253בשימוש ב-1 μ גרם/מ"ל ריכוז סופי
pS935-LRRK2MRC PPU ריאגנטים ושירותיםUDD2בשימוש ב-1 μ ריכוז סופי של גרם/מ"ל
.ריסוסטוש קבועהגנה אישי משולבים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Paisan-Ruiz, C., et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).
  2. Fell, M. J., et al. MLi-2, a Potent, Selective, and Centrally Active Compound for Exploring the Therapeutic Potential and Safety of LRRK2 Kinase Inhibition. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 397-409 (2015).
  3. Zimprich, A., et al. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).
  4. Sardi, S. P., Cedarbaum, J. M., Brundin, P. Targeted Therapies for Parkinson's Disease: From Genetics to the Clinic. Journal of Movement Disorders. 33 (5), 684-696 (2018).
  5. Steger, M., et al. Phosphoproteomics reveals that Parkinson's disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases. Elife. 5, (2016).
  6. Ito, G., et al. Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors. Biochemical Journal. 473 (17), 2671-2685 (2016).
  7. Alessi, D. R., SammLer, E. LRRK2 kinase in Parkinson's disease. Science. 360 (6384), 36-37 (2018).
  8. Yue, M., et al. Progressive dopaminergic alterations and mitochondrial abnormalities in LRRK2 G2019S knock-in mice. Neurobiology of Disease. 78, 172-195 (2015).
  9. Doggett, E. A., Zhao, J., Mork, C. N., Hu, D., Nichols, R. J. Phosphorylation of LRRK2 serines 955 and 973 is disrupted by Parkinson's disease mutations and LRRK2 pharmacological inhibition. Journal of Neurochemistry. 120 (1), 37-45 (2012).
  10. Sheng, Z., et al. Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations. Science Translational Medicine. 4 (164), (2012).
  11. Fan, Y., et al. Interrogating Parkinson's disease LRRK2 kinase pathway activity by assessing Rab10 phosphorylation in human neutrophils. Biochemical Journal. 475 (1), 23-44 (2018).
  12. Scott, J. D., et al. Discovery of a 3-(4-Pyrimidinyl) Indazole (MLi-2), an Orally Available and Selective Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Inhibitor that Reduces Brain Kinase Activity. Journal of Medicinal Chemistry. 60 (7), 2983-2992 (2017).
  13. Pham, C. T. Neutrophil serine proteases: specific regulators of inflammation. Nature Reviews Immunology. 6 (7), 541-550 (2006).
  14. Lis, P., et al. Development of phospho-specific Rab protein antibodies to monitor in vivo activity of the LRRK2 Parkinson's disease kinase. Biochemical Journal. 475 (1), 1-22 (2018).
  15. Mir, R., et al. The Parkinson's disease VPS35[D620N] mutation enhances LRRK2-mediated Rab protein phosphorylation in mouse and human. Biochemical Journal. 475 (11), 1861-1883 (2018).
  16. Rieckmann, J. C., et al. Social network architecture of human immune cells unveiled by quantitative proteomics. Nature Immunology. 18 (5), 583-593 (2017).
  17. Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
  18. Bain, B., Dean, A., Broom, G. The estimation of the lymphocyte percentage by the Coulter Counter Model S Plus III. Clinical & Laboratory Haematology. 6 (3), 273-285 (1984).
  19. Tomazella, G. G., et al. Proteomic analysis of total cellular proteins of human neutrophils. Proteome Science. 7, 32(2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DIFPMLi 2Rab10 Thr73

מאמרים קשורים