מוטציות ב לאוצין העשיר חזרה לחזור 2 גנים (LRRK2) לגרום למחלת פרקינסון תורשתית. פיתחנו שיטה קלה ואיתנה להערכת זרחון LRRK2 נשלט של Rab10 בדם היקפי הדם נויטרופילים. הדבר עשוי לסייע בזיהוי אנשים עם פעילות מסלול מוגברת של LRRK2 קינאז.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
דם היקפי הדם נויטרופילים בידוד עבור חקירת פרקינסון הקשורים LRRK2 קינאז מסלול על ידי הערכת Rab10 זירחון
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
הלוצין העשיר חוזר קינאז 2 (LRRK2) הוא הגן השכיח ביותר במחלת פרקינסון תורשתית (PD) וכל מוטציות LRRK2 פתוגניים התוצאה היפרהפעלה של הפונקציה קינאז שלה. כאן, אנו מתארים שיטת קל ויציב לכמת LRRK2 קינאז פעילות מסלול היקפי דם היקפיים על ידי מדידת LRRK2 זרחון מבוקר של אחד מצעים פיזיולוגיים שלה, Rab10 ב טראונין 73. הניתוח החיסוני המתואר מחייב מאוד בררני ופוספנטי הנוגדן כי מזהה את Rab10 Thr73 אפירופה זרחזיום על ידי LRRK2, כגון נוגדן MJFF-pRab10 הארנב מונובטיים. הוא משתמש דם היקפית אנושי נויטרופילים, כי דם היקפי נגיש בקלות נויטרופילים הם מרכיב שופע הומוגנית. חשוב מכך, נויטרופילים לבטא רמות גבוהות יחסית של LRRK2 ו Rab10. חיסרון פוטנציאלי של נויטרופילים הוא הפעילות הפנימית הגבוהה סרין פרוטאז שלהם, אשר מחייבת את השימוש של מעכבי פרוטאז חזק מאוד כגון diisopropylfluorophosphate הרעלן העצבי זרחן (DIFP) כחלק מאגר לפירוק. עם זאת, נויטרופילים הם משאב רב ערך עבור מחקר לתוך פעילות מסלול LRRK2 קינאז ב vivo וצריך להיחשב עבור הכללה לתוך משטרת ביוריאטורי אוספים.
מבוא
נסיונות להאט או להפסיק את מחלת פרקינסון (PD) נכשלו עד כה. הגילוי של מוטציות היפראותיים ב-לאוצין לחזור על קינאז 2 (LRRK2) הגורמות ו/או הגברת הסיכון למשטרה הובילה לפיתוח מעכבי LRRK2 קינאז1,2,3. אלה נכנסו עכשיו ניסויים קליניים4. הפונקציה המדויקת של LRRK2 אינו ברור, אבל התקדמות מרכזית כבר זיהוי של מערכת החלבונים של רב gtpase, כולל Rab10, כמו מצעים פיסיולוגיים בתום הראשון של הLRRK2 קינאז5,6,7. אתגרים מרכזיים בעידן של מחלות-שינוי therapeutics הם סמנים ביוכימיים של מ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
על פי רגולציה בבריטניה המקומית כל המניפולציות וליטוף של דם אנושי נעשים בארון בטיחות בקטגוריה 2. כל ההליכים בוצעו בהתאם לועדת האתיקה המקומית וכל המשתתפים סיפקו הסכמה מושכלת.
1. הכנה
- הכינו 0.1 mL של מניות EDTA פתרון 1 המכיל 100 mM EDTA ב-פוספט באגירה מלוחים (PBS).
- הכינו 60 mL של פתרון מניות EDTA 2 המכיל 1 מ"מ EDTA ב-PBS.
- הכנת מאגר לפירוק המכיל 50 mM טריס-HCl (pH = 7.5), 1% (v/v) טריטון X-100, 1 מ"מ EGTA, 1 מ"מ Na3VO4, 50 mm naf, 10 מ"מ β-Glycerophosphate, 5 מילימטר נתרן פירופוספט, 0.27 M סוכות, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1 X מעכב פרוטאז קוקטייל, אחד μg/mL MICROCYSTIN-LR, ו 0.5 מילימטר dii....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הבדיקה שלנו מאפשרת לחקור את ההפעלה של LRRK2 קינאז PD-הקשורים המשטרה הקשורה בדם היקפי דם נויטרופילים עם LRRK2 תלוי Rab10 זרחון כמו בדיקה. נויטרופילים הם היקפיים ושופע היקפי דם לבנים האוכלוסייה המבטא רמות גבוהות של LRRK2 ו Rab10 חלבונים (איור 1). אוכלוסיית התאים היחידה היחידה בקרב תאי הדם ההיקפיים הנותרים (PBMCs) עם מספרי עותקים גבוהים של שני החלבונים הם מונוציטים, אבל אלה מפצות רק 2 – 12% של כדוריות הדם הלבנות. זה מציין כי דם היקפי נויטרופילים הם ביומטריקס מתאים יותר עבור לימוד LRRK2 שבשליטת .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הוכחה משכנעת קלינית, גנטית, וביוכימית מצביע על תפקיד חשוב עבור LRRK2 ובמיוחד הפונקציה קינאז שלה במחלת פרקינסון7. מעכבי LRRK2 קינאז פותחו והם נכנסים ניסויים קליניים2,4,12. ככזה יש צורך לנצל LRRK2 כסמן עבור מעורבות היעד, כמו גם המטופל ריבוד. הפרוטוקול שלנו מתאר שיטת יציב וקלה לניתוח הפעלת מסלול LRRK2 קינאז כפי שמשתקף על ידי זירחון של המצע הפיזיולוגי שלה Rab10 במאגר הומוגנית של האדם ההיקפי דם נויטרופילים
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
אנו מודים למתנדבים הבריאים שתרמו באדיבות דם למחקר הנוכחי. אנו מודים לקרן מייקל ג'יי פוקס לחקר פרקינסון (MJFF) ולמנהיגות המחקר פוקס ביונט (FBN) לתמיכה ולכניסה לפרוטוקול הכתוב ולווידאו. אנו מודים לפרופסור אלכסנדר זיפריץ ' מאוניברסיטת וינה באוסטריה על בחינת הפרוטוקול ושיתוף הפעולה שלנו. אנו מעריכים את התרומות של פול דייוויס לפרויקט (מנהל כללי של MRC PPU). אנו מכירים גם את התמיכה הטכנית המצוינת של זרחון חלבון MRC והיחידה אוביקווילציה (PPU) כלומר סינתזה כימית (נטליה שפירו MLi-2), MRC PPU ריאגנטים ושירותים נוגדנים לטיהור צוותים (מתואם על ידי הילארי McLauchlan וג Hastie). אנו מודים מולר מטאולר ו פרייזר מרדוק מ Vivomotion עבור עזרתם עם עשיית קטעי וידאו ואנימציות. אנו מודים לס....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1 מ"ל קצות פיפטה | Sarstedt | 70.762 | או שווה ערך |
| 1.5 מ"ל מיקרו צינורות | Sarstedt | 72.690.001 | או שווה ערך |
| 10 מ"ל קצות פיפטה | סרסטדט | 86.1254.025 | או שווה ערך |
| 10 μ L קצות פיפטה | Sarstedt | 70.113 | או שווה ערך |
| 15 מ"ל צינור בז | Cellstar | 188 271 | או שווה ערך |
| 200 μ L קצות פיפטה | Sarstedt | 70.760.002 | או שווה ערך |
| 25 מ"ל טיפים לפיפטה | Sarstedt | 86.1685.001 | או שווה ערך |
| ל-50 מ"ל צינור בז | Cellstar | 227 261 | או שווה ערך |
| BD Vacutainer Hemogard סגירת פלסטיק K2-EDTA צינור | BD | BD 367525 | או שווה ערך |
| בקמן קולטר אלגרה X-15R צנטריפוגה | בקמן | או צנטריפוגה מקבילה עם מסובב דלי שחייה לצינורות בז של 15 מ"ל ו-50 מ"ל במהירות 1000-1200 x | |
| גרם קטגוריה 2 ארון בטיחות ביולוגי | |||
| קוקטייל מעכב פרוטאז cOmplete (ללא EDTA) Roche | 11836170001 | ||
| DIFP (Diisopropylfluorophosphate) | Sigma | D0879 | הכן תמיסת מלאי 0.5M באיזופרופנול תוך שימוש באמצעי זהירות מיוחדים |
| דימתיל סולפוקסיד | Sigma | 6250 | |
| קרח יבש או חנקן | |||
| נוזלי תמיסת מלח חוצצת פוספט של Dulbecco | ThermoFisher | 14190094 | או שווה ערך |
| Easy 50 EasySep Magnet | Stemcell | 18002 | להחזקת 1 x 50 מ"ל צינור חרוטי |
| EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit | Stemcell | 19666 | זה מכיל פתרונות הנקראים " קוקטייל בידוד" ו- " חרוזים מגנטיים RapidSpheres |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| צנטריפוגה אפנדורף 5417R צנטריפוגה | אפנדורף | ||
| אתנול, בבקבוק | |||
| חומצה אתילנדיאמינטטראצטית | Sigma | E6758 | |
| איזופרופנול קרח | |||
| (דרגה נטולת מים) | Sigma | 278475 | |
| Lysis buffer (50 מ"מ Tris-HCl pH 7.5, 1% (v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 מ"מ NaF, 10 מ"מ & בטא;-גליצרופוספט, 5 מ"מ נתרן פירופוספט, 0.27 M סוכרוז, 0.1% (v/v) & בטא;-מרקפטואתנול, 1x cOmplete (ללא EDTA) קוקטייל מעכב פרוטאז (Roche), 1 μ גרם/מ"ל מיקרוציסטין-LR, 0.5 מ"מ דיאיזופרופילפלואורופוספט (DIFP). | לחלופין, מאגר ליזה קפוא בכמויות ללא Microcystin-LR, DIFP זמין מ-MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/) | ||
| מעכב Merck LRRK2 II (MLi-2) | Merck | 438194-10MG | או שווה ערך (אינהיטור LRRK2 חזק וסלקטיבי) |
| מיקרוציסטין-LR | Enzo Life Sciences | ALX-350-012-M001 | 1 מ"ג/מ"ל מלאי ב-DMSO ואחסן ב-80 מעלות צלזיוס. |
| Na3VO4 | Aldrich | 450243 | |
| NaF | Sigma | S7920 | |
| Odyssey CLx סריקת מערכת הדמיה Western Blot | Odyssey | ||
| עט | |||
| ציוד | |||
| RPMI 1640 בינוני | ThermoFisher | 21875034 | או שווה ערך |
| נתרן פירופוספט | Sigma | S22 | |
| סוכרוז | Sigma | S0389 | |
| β-גליצרופוספט | Sigma | 50020 | |
| β-מרקפטואתנול | Sigma | M3148 | |
| <חזק>נוגדנים מומלצים לכתמים מערביים | |||
| נוגדן נגד RAB10 (phospho T73) [MJF-R21] | abcam | ab230261 | |
| anti-α-tubulin | Cell Signaling Technologies | 5174 | בשימוש ב-1:2000 דילול |
| עז נגד עכבר IRDye 680LT | LI-COR | 926-68020 | בשימוש ב-1:10,000 דילול |
| עז נגד עכבר IRDye 800CW | LI-COR | 926-32210 | בשימוש ב-1:10,000 דילול |
| עיזים נגד ארנב IRDye 800CW | LI-COR | 926-32211 | בשימוש בדילול 1:10,000 |
| MJFF-סה"כ נוגדן עכבר Rab10 | שנוצר על ידי nanoTools (nanotools.de) | לא ישים* | בשימוש ב-2 μ ריכוז סופי של גרם/מ"ל; * נוגדן Rab10 הכולל MJFF שנוצר על ידי nanoTools (www.nanotools.de) [11] ימוסחר על ידי קרן מייקל ג'יי פוקס ב-2018 |
| נוגדנים | נגד LRRK2 C-terminus | 75-253 | בשימוש ב-1 μ גרם/מ"ל ריכוז סופי |
| pS935-LRRK2 | MRC PPU ריאגנטים ושירותים | UDD2 | בשימוש ב-1 μ ריכוז סופי של גרם/מ"ל |
מקורות
- Paisan-Ruiz, C., et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).
- Fell, M. J., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
