מאמר שיטה

שימוש במיקרו מערכים לחקור השפעה מיקרוסביבתית על פנוטיפים סלולריים בסרטן

DOI:

10.3791/58957

⸱

21 במאי 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Knight Cancer Institute, Oregon Health and Science University, 2Quantitative Imaging Systems LLC

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטרת השיטה המוצגת כאן היא להראות כיצד מיקרומערכים מיקרואקולוגיה (MEMA) ניתן לזייף ולהשתמש כדי לחקור את ההשפעה של אלפי קומבינטורית מיקרו סביבות פשוטות על הפנוטיפ של תאים מתורבתים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבנת ההשפעה של המיקרוסביבה על הפנוטיפ של התאים היא בעיה קשה בשל התערובת המורכבת של שני גורמי גדילה מסיסים וחלבונים הקשורים מטריקס ב מיקרוסביבה ב vivo. יתר על כן, ריאגנטים זמין עבור מידול של מיקרו סביבות בתוך החוץ בדרך כלל לנצל תערובות מורכבות של חלבונים כי הם מוגדרים לחלוטין וסובלים אצווה להשתנות אצווה. פלטפורמת המיקרו-מיקרו של הסביבה (MEMA) מאפשרת הערכה של אלפי שילובים פשוטים של חלבונים מיקרוסביבתיים להשפעה שלהם על הפנוטיפים הסלולריים בתוך שיטת יחיד. MEMAs מוכנים צלחות היטב, אשר מאפשר תוספת של ליגונים בודדים להפריד בארות המכילות מטריקס מוליכי הרכב (ECM) חלבונים. השילוב של הליטרים מסיסים עם כל ECM מודפס יוצר שילוב ייחודי. שיטת MEMA טיפוסית מכילה יותר מ-2,500 מיקרוסביבות קומבינטורית ייחודיות שתאים חשופים אליהם בתוך שיטת יחיד. כמקרה מבחן, סרטן השד התאים קו MCF7 היה מצופה על פלטפורמת MEMA. ניתוח זה מזוהה גורמים שניהם לשפר ולעכב את הצמיחה והתפשטות של תאים אלה. פלטפורמת MEMA היא גמישה מאוד והוא יכול להיות מורחב לשימוש עם שאלות ביולוגיות אחרות מעבר למחקר הסרטן.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Culturing של שורות תאים סרטניים על פלסטיק דו מימדי (2D) monolayers נשאר אחד הסוסים העיקריים עבודה עבור חוקרי סרטן. עם זאת, המיקרו-סביבה מוכרת יותר ויותר בשל יכולתה להשפיע על פנוטיפים סלולריים. בסרטן, מיקרוסביבה הגידול ידוע להשפיע על התנהגויות סלולר מרובות, כולל צמיחה, הישרדות, פלישה, ותגובה לטיפול1,2. תרביות תאים מסורתיים בדרך כלל חוסר השפעות מיקרו הסביבה, אשר הובילה לפיתוח של מורכב יותר תלת-מימדי (3d) בחני לגדול תאים, כולל מסחרית זמין מרתף מטוהרים מתחת תמציות קרום. עם זאת, אלה מטריצות מטוהרים הם בדרך כלל מורכבים להשתמש וסובלים מבעיות טכניות כגון השתנות אצווה3 וקומפוזיציות מורכבות3. כתוצאה מכך, זה יכול להיות קשה להקצות פונקציה חלבונים ספציפיים שעשויים להשפיע על פנוטיפים סלולריים3.

כדי לטפל במגבלות אלה, פיתחנו את הטכנולוגיה microenvironment מיקרו-הסביבה (mema), אשר מפחית את המיקרו-סביבה עד שילובים פשוטים של מטריקס מטריצה (ecm) ומסיס גורם צמיחה חלבונים4,5 . פלטפורמת MEMA מאפשרת זיהוי של גורמים מיקרוסביבתיים דומיננטי המשפיעים על התנהגות של תאים. באמצעות תבנית מערך, ניתן לקבל בניסוי אחד אלפי שילובים של גורמי מיקרו-סביבה. MEMA תיאר כאן חוקר שערים ~ 2,500 שונים בתנאים מיקרו סביבה ייחודית. חלבונים מסוג ECM המודפסים בלוחות הגידול של הטופס שעליהם יכולים להיות מתורבתים. ליגפות מסיסים מתווספים לבארות בודדות, ויוצרות קומבינטורית מיקרו-סביבות ייחודיות (ECM + ligands) בכל נקודה שונה אליה נחשפים התאים. תאים הם מתורבתים במשך מספר ימים, לאחר מכן קבוע, מוכתם, והתמונה כדי להעריך פנוטיפים הסלולר כתוצאה של חשיפה אלה שילובים ספציפיים מיקרו הסביבה. מאז המיקרוסביבות הם שילובים פשוטים, זה פשוט לזהות חלבונים כי כונן שינויים פנוטימית עיקריים בתאים. Memas השתמשו בהצלחה כדי לזהות גורמים המשפיעים על מספר פנוטיפים סלולריים, כולל אלה כי כונן החלטות הגורל תא תגובה לטיפול4,5,6,7. תגובות אלה ניתן לאמת בניסויים 2D פשוטים ולאחר מכן ניתן להעריך בתנאים כי יותר לכידה מלאה של המורכבות של מיקרוסביבה הגידול. פלטפורמת MEMA היא להתאים מאוד למגוון של סוגי תאים ונקודות קצה, בתנאי כי בסמנים פנוטיפים טובים זמינים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: מבט כולל על תהליך MEMA כולו, כולל זמן משוער, מתואר בדיאגרמת הזרימה המוצגת באיור 1. פרוטוקול זה מפרט את הייצור של MEMAs בצלחות בנות 8. הפרוטוקול עשוי להיות מותאם עבור לוחות אחרים או שקופיות.

1. הכנת מאגרי חלבונים, מדלל וכתמים

  1. מבחנות של ECMs, ליגניות, ו ציטוקינים לטמפרטורת החדר (RT) ובקצרה צנטריפוגה. הוסף את הנפח המתאים של מאגר ה-RT המתאים כפי שמצוין בגליון הנתונים של המוצר. בצע את המלצת היצרן עבור ריכוזי מניות.
    הערה: רשימה מלאה של ליגנדס ו ECMs עם המניות שלהם וריכוזי הסופי ניתנים בטבלה 1 ושולחן 2. הן ליגנדס והן ECMs משמשות בדרך כלל בריכוז הגבוה ביותר של הטווח המומלץ על ידי היצרן, אשר מעורר את ההשפעה הביולוגית שלו בתקן 2 יום התרבות. מטפלים בחלבונים בעדינות ובארונות ביו-בטיחות בזרימה שכבתית כדי למנוע זיהום.
  2. דגירה מבחנות עם נדנדה עדין ב-RT עבור 1 h. לא מערבולת חלבונים כמו זה יכול לגרום להם להספרות.
  3. מחלקים חלבונים עבור אחסון לטווח ארוך כך כל aliquot הם שימוש יחיד רק כדי למנוע השפלה עם חוזר הקפאה/הפשרה מחזורי. מאחסנים חלבונים ב-80 ° צ' (אלא אם צוין אחרת) עד לצורך. דאג לאסוף את כל המטא-נתונים לעיון עתידי, כגון: (i) שם חלבון, (ii) תאריך מוכן, (iii) הרבה/אצווה מספר, (iv) הספק, (v) מספר קטלוג, (vi) ריכוז, (vii) נפח, ו (viii) הכנה.
  4. הכנת מאגר דילול המכיל 20% (v/v) גליצרול, 10 מ"מ EDTA, 200 mM טריס-HCl, pH 7.2, ומסנן לעקר. שמור על מאגר זה סטרילי ואחסן ב-RT.
  5. הכנת מאגר כתמים המכיל 2% (w/v) BSA, 1 מ"מ MgCl2, ו 0.02% נאן3 בתמיסת מלח פוספט באגירה (PBS). לסנן ולאחסן ב-4 ° c.

2. הכנת לוח מקור ECM

  1. הסר מניות מצוטט של חלבונים ECM להיות מודפס ולהפשיר על הקרח. הקלט את כל המספרים הרבים עבור מעקב אחר מטא-נתונים.
  2. קפיצי צינורות של חלבונים המופשטים בעדינות כדי להבטיח resuspension נכונה ספין למטה בצנטריפוגה.
  3. הפוך תערובות ECM הדפסה (EPMs) ו פלורסנט fiducial לשמש על ידי רובוט טיפול נוזלי שתיצור את הצלחות אקראי 384-ובכן מקור.
    הערה:     לוחות המקור של 384-והטוב ישמשו מדפסת מערך של סיכת מגע כדי ליצור את המערכים המודפסים ב-8 לוחות הבאר.
    1. תווית 1.5 mL לצינורות מיקרוצנטריפוגה עבור כל EPM והfiducial.
    2. הכן כל EPM על ידי שילוב 125 μL של מאגר דילול (ראה שלב 1.4) עם הנפח המתאים של מלאי ECM ולהביא את התערובת עד נפח כולל של 250 μL עם PBS. הריכוזים הסופיים בכל צינור EPM יהיה 1 x ECM חלבון, 5 מ"מ EDTA, 10% גליצרול, ו 100 mM טריס.
    3. הכן fiducial פלורסנט על ידי המסת אותו במאגר המתאים שצוין על ידי היצרן והעבר 250 μL לשפופרת fiducial מתויג.

3. יצירת לוח המקור באמצעות מטפל נוזלי

  1. עיצוב לוח 384-ובכן, המתאר את המיקומים של ה-ECMs וממוטב לשימוש בראש סיכת המדפסת המשמש כמערך. עצב את מיקום הfiducial כך שהוא יודפס בשורה 1, עמודה 1 מיקום כל טוב כדי לסייע בכיוון מערך.
    הערה: סך של 14/15 שכפול של כל ECM משמשים להבטחת נתונים חזקים. כלול משכפל נוסף של קולגן או ECM אחרת התשואות חזקה להערכת אחידות של הכריכה. ייתכן שהפריסה תצטרך לנצל מספר 384-הצלחות מרובות בהתאם למספר ה-ECMs של הריבית.
  2. העבר צינורות EPM למטפל נוזלי, שמירה על צינורות ב -4 ° c או עם מתלה צינור מקורר או באמצעות רובוט טיפול נוזלי הממוקם בחדר קר.
  3. באמצעות התוכנה של המטפל נוזל, להפעיל תוכנית להעביר 15 μL של כל EPM ואת fiducial לבארות מראש בתוך לוחית מקור 384-היטב (s).
  4. Pipet PBS לתוך בארות לא מנוצל כדי להגביר את הלחות והשמירה מפני התייבשות במהלך תהליך ההדפסה.
    הערה: ראה איור 2 לדוגמה מערכת לוחית מקור 384-היטב הממוטב עבור 4 x 7 פינים הראש וכולל קולגן אני לחסום ו PBS.
  5. לסגור את הצלחות ולשמור ב 4 ° צ' עד מוכן להדפסה.

4. הדפסת MEMAs באמצעות רובוט מערך הדפסה

הערה: החלק הבא של הפרוטוקול מתאר במפורש את ההכנה והשימוש של MEMA כדי לחקור את ההשפעה של חלבונים מיקרוסביבתיים שונים על הצמיחה והתפשטות של תאים MCF7. עם זאת, ניתן להתאים את הפרוטוקול בקלות לשימוש בליפסים שונים, ECMs ותאים ללימוד קווי תאים אחרים ונקודות קצה של ריבית.

  1. באמצעות מדפסת סיכות מגע, הדפס EPMs ו fiducial כתמים לתוך 8 צלחות היטב. הדפס שכפול מרובים של כל תנאי ECM כדי להבטיח את התוכונות.
    הערה:     ניתן להשתמש בתבניות לוח או שקופיות אחרות להדפסה, אך ייתכן שיהיה צורך במיטוב מאגר כדי להשיג היווצרות ספוט אופטימלי.
    1. הדפס את ה-ecms עבור mema באמצעות פינים בקוטר 350 יקרומטר המסודרים בתצורת ראש הדפסה של 4 x 7. הדפס את המערכים בלוחות של 8-היטב כמו 20 עמודות על-ידי 35 שורות, עבור סך של ~ 700 נקודות. מערכים גדולים יותר אפשריים בצלחות אלה, אך באים עם הסחר-off של השפעות קצה מוגבר הן כריכת תאים וכתמים.
  2. לאחר הדפסה, לאחסן צלחות desiccator לפחות 3 ימים לפני השימוש.

5. יצירת צלחות ליגוטיפול

  1. עיצוב לוח 96-ובכן, כולל ליגניות של עניין. כדי להקל על הטיפול של צלחות MEMA רבים בבת אחת, לעצב את הצלחת הזאת עם מרווח המאפשר שימוש של מרובת ערוצים pipet עם 4 טיפים במרווחים כדי להעביר נוזלים בין הבארות של 8-טוב Mema וצלחת 96-באר.
    הערה: בפרוטוקול זה, משתמשים בערכה המלאה של ליגניות המפורטות בטבלה 2 .
  2. . להפשיר ליגנדס על קרח קפיצי בקצרה וסובב כל צינור.
  3. השתמש במאגר המומלץ של היצרן (בדרך כלל PBS) כדי לדלל מלאי של 200x.
  4. Pipet 10 μL של כל 200x ליטר ומלאי לתוך הטוב המתאים בתוך הצלחת 96-באר.
  5. הרכב לוחות החותם והחנות ב-20 ° c.
    הערה: להפוך לוחיות טיפול לחות בקבוצות, לכידת כל המטא-נתונים עבור ניתוח במורד הזרם.

6. תאים culturing על MEMAs

  1. לחסום MEMAs עבור 20 דקות עם 2 מ ל לכל היותר של מאגר חסימה ללא התפסות המכיל 1% שאינם מפוסות סוכן חסימה (טבלת חומרים) במים כפולים מזוקקים (ddh2O).
  2. ומשלש בארות שוטפים. עם הערוץ הPBS כדי למנוע התייבשות, השאר את הנפח הסופי של PBS בבארות עד שמוכן לציפוי תאים.
    הערה: זה מאוד מועיל יש שני עובדי ספסל עבור שלבי תרבות התא על MEMAs. אחד מעובדי הספסל יכול לבצע שלבי השאיפה, ואילו השני מבצע צעדים בתוספת. מומלץ להשתמש 1 מ"ל pipet רב-ערוצי עם טיפים במרווחים כדי להתאים את הצלחת 8-הבאר עבור ליטוף ו-מפצל Y עם שני פיפטות פסטר לפתי בארות מרובות בבת אחת.
  3. זרע 2 x 105 MCF7 תאים לכל טוב ב 2 מ ל של דולבקה שונה של הנשר הבינוני (dmem דיום) בינונית המכילה 10% סרום העוברי (fbs).
    הערה: לפני ניסוי MEMA מלא, לבצע ניסוי טיטור תא כדי למטב את מספרי התאים כגון מקומות MEMA יש מספרי תאים גבוהים (אבל הם לא שוטפת) בסוף המשך הניסיוני הרצוי.
  4. לאחר 2-18 שעות של הדבקה, מפחית בינונית ולהחליף עם 2 מ ל של בינונית צמיחה מופחתת (DMEM עם 0.1% FBS).
    הערה: סרום מופחת (למשל, 0.1% FBS) או גורם גדילה-תנאים מופחתים ניתן להשתמש בשלב זה כדי לבודד את ההשפעה מגירוי של ליגניות ספציפיות.
  5. . להפשיר צלחת ליגוטיפול בקרח צנטריפוגה הופלה את הצלחת ב 200 x g עבור 1 דקות.
  6. העברת 200 μL של בינוני מכל באר בלוח התרבות לבאר המתאים בצלחת הטיפול. Pipet למעלה ולמטה כדי לערבב נפח עם בינוני ולהעביר את התערובת בחזרה היטב המתאים בצלחת MEMA.
  7. להקל על הרוק ביד ולהחזיר את לוחיות MEMA לחממה. תרבות למשך הניסוי בנוכחות שילוב ligand/ECM ב 37 ° c ו-5% CO2.
    הערה: ניסוי MEMA טיפוסי פועל עבור 72 h; ניסויים משך זמן ארוך עשויים לדרוש החלפת בינונית וטיפול מחדש עם ligand.
  8. דופק MEMA וולס ב 71 h עם 100x 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) לריכוז הסופי של 10 μM. דגירה בתנאים ניסיוניים עם EdU עבור 1 h ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
    הערה: בשלב זה ניתן להשתמש גם בטיפולי תאים חיים אחרים.

7. תיקון וצביעת MEMAs

  1. לאחר 72 h וכל טיפולי תאים חיים, מנושמים בארות. תקן MEMAs ב 2 מ ל לכל טוב של 2% פאראמפורמלדהיד (בתחתית) עבור 15 דקות at RT.
  2. . מתיף את הכדורגלן החדירות עם 2 מ ל לבאר של 0.1% nonionic החומרים עבור 15 דקות.
  3. ולשטוף עם 2 מ ל לכל טוב של PBS. . שמתי את הערוץ לשטוף עם 2 מ ל של PBS עם 0.05% polysorbate 20 (PBS-T).
    הערה: המשטח MEMA הוא הידרופובי, וכישלון לשטוף עם PBS-T לפני דגירה הכתם נוגדן יגרום להיווצרות חללים בבארות במהלך שלבי הדגירה ולתת היווצרות חפצי הצביעת.
  4. . מנושף את הPBS-טי הוסף את התגובה של EdU לגילוי ריאגנטים. הגנה מפני 1 h ב RT, נדנדה ומוגן מפני אור. אחרי 1 h הדגירה, תגובת כיבוי עם מאגר כיבוי מסחרי סיפק.
    הערה: EdU שלבים לזיהוי וכתמים/נוגדנים עשויים להתבצע ב-1.5 mL לכל טוב כדי להפחית את העלות.
  5. ולשטוף עם PBS-T לפני הדגירה עם כתמים או נוגדנים.
  6. מודדת mema בארות עם נוגדנים נגד היסטון H3K9me3 (1:1000) ו fibrillarin (1:400) במאגר מכתים המכיל 2% (w/v) סרום פרה אלבומין (bsa), 1 מ"מ mgcl2 ו 0.02% נאן3 לילה ב 4 ° c.
    הערה: ביצוע החדירות נוגדן כדי לקבוע ריכוזים אופטימליים לפני השימוש בהם על ערכת MEMA מלא.
  7. לאחר הנוגדן העיקרי או הדגירה כתם, לשטוף את הבארות 2x עם PBS ופעם עם PBS-T.
  8. הוסף נוגדנים משניים (חמור אנטי עכבר IgG וחמור אנטי ארנב IgG, שניהם 1:300) ו 0.5 μg/mL 4 ′ 6 ‐ diamidino ‐ 2 ‐ פניינילידול (DAPI). . בסדר.
  9. לשטוף את הבארות 2x עם 2 מ ל עבור כל טוב של PBS, להשאיר אותם בגמר 2 mL PBS.
  10. להמשיך להדמיה או לאחסן MEMAs מוכתם להדמיה מאוחר יותר ב-PBS ב-4 ° צ' מוגן מפני אור.

8. הדמיה של MEMAs

  1. תמונה MEMA במערכת הדמיה אוטומטית עם ערוצים מתאימים לזיהוי פלורסנט.
  2. פלט נתוני תמונה שהתקבלו למערכת ניהול תמונות. פלח תאים וחשב רמות אינטנסיביות באמצעות CellProfiler8.

9. ניתוח נתונים

הערה: ניתוח נתונים מורכב מנורמליזציה, תיקון וריאציה וסיכום של הנתונים הנגזרים מחברת CellProfiler הגולמית. במקרה זה, הסביבה R עם קוד מותאם אישית משמשת לביצוע כל השלבים. עם זאת, כל סביבה או תוכנית תוכנה סטטיסטית יכולים להיות מנוצלים כדי לבצע את הפעולות המקבילות. דוגמה לקוד המותאם אישית של המקור הפתוח עבור הסביבה R לניתוח זמינה ב: https://www.synapse.org/#!Synapse:syn2862345/wiki/72486.

  1. לעבד מראש ולנרמל את נתוני התמונה מקוטע.
  2. קבע ספירת תאי ספוט תוך שימוש בגרעינים המוכתמים של DAPI.
  3. עוצמת שער אוטומטי EdU כדי לתייג תאים כ-EdU+. מדידת התפשטות באמצעות הפרופורציה של EdU+ תאים בכל נקודה.
  4. חציון מסכם כתמים cytoplasmic ומדידות המבנה הגרעיני ברמת ספוט.
  5. בצע הסרה של נורמליזציה לא רצויה (RUV) בנתונים כדי לשפר את איכות הנתונים9.
    הערה: גישה זו מוחלת על כל עוצמה ואות מורפולוגיה באופן עצמאי כמטריצה עם מערכים תוך שימוש בשורות ובנקודות כמו העמודות כמתואר בעבר9.
  6. החל נרמול מחלות bivariate ל-RUV מנורמלים מנורמל באמצעות שורת המערך ועמודת המערך כמשתנים עצמאיים כדי לתקן את ההשפעות הקשורות למרחב או לאינטנסיביות.
  7. לאחר השלמת הנורמליזציה, החציון מסכם את המשכפלת עבור כל תנאי של סביבת מיקרו עבור דיווח וניתוח נוסף.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לפשט השפעות מיקרוסביבתיות על צמיחת תאים והתפשטות ועל מנת לזהות תנאים שקידמו או מעכבות את צמיחת התאים וההפצה, התאים הסרטניים בסרטן השד MCF7 הופרה על סט של שמונה 8-טוב MEMAs כפי שמתואר בפרוטוקול. שיטת הפעולה חשפה את התאים ל-48 ECMs שונים ו57 ליגפות שונות, עבור סך של 2736 קומבינטורית מיקרו תנאים סביבתיים. לאחר 71 h בתרבות, תאים היו פעמו עם EdU, קבוע, חדירות, והכתים עם DAPI, התגובה של EdU זיהוי, נוגדן אנטי fibrillin, ו נוגדן anti-H3K9me3. התאים התהיו בתמונה במיקרוסקופ תוכן גבוה. התמונות הועלו לשרת Omero...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חשיבותה של "ממדי" והקשר היה גורם מניע בפיתוח במערכות תרבות מבחנה ככלים לאפיון תאים סרטניים באמצעות האינטראקציה שלהם עם המיקרו-סביבה11, והיכולת של מבחנה מערכות תרבות לחקות את הסביבה vivo הוא כוח המניע מאחורי החיפוש כדי לשפר את מערכות התרבות. אולם, במערכות חוץ גופית, נותרו כלים משמעותיים של מחקר הסרטן בדיוק בשל יכולתם לזקק את הקומפלקס במצב vivo למטה לדגם מפושט12.

למרות שמערכות דו-ממדיות יכולות לכלול ECMs וליגנדס, הן היו חסרה באופן מסורתי בקיבולות ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכת על ידי ספריית הקרן המשותפת של NIH של הרשת חתימות סלולריות (LINCS) גרנט HG008100 (J.W.G., L.M.H., ו-J. E. K).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Aushon 2470Aushon BioSystemsArrayer המשמשת בפרוטוקול
Nikon HCAמערכתהדמיה בתוכן גבוה של Nikon שתוכננה סביב Nikon Eclipse Ti מיקרוסקופ הפוך
EDTAInvitrogen15575-038
גליצרולSigmaG5516
Triton X100SigmaT9284
Tween 20SigmaP7949
Kolliphor P338BASF50424591
צלחת מיקרו-מערך 384 בארות, באר גליליתThermo Fisherab1055
Nunc 8 צלחת היטבתרמו פישר267062
Paraformaldehyde 16% תמיסהאלקטרונים מיקרוסקופיה מדע15710
BSAFisherBP-1600
נתרן אזידסיגמאS2002
מסכת תאיםבדיקות מולקולריותH32713
Click-iTEdU Alexa Fluorבדיקות מולקולריותC10357
DAPIפרומו קיןPK-CA70740043
ALCAMR & D Systems656-ALECM
Cadherin-20 (CDH20)R & D Systems5604-CAECM
Cadherin-6 (CDH6)R & D Systems2715-CAECM
Cadherin-8 (CDH8)R & D Systems188-C8ECM
CD44R & D Systems3660-CDECM
CEACAM6מו"פ D Systems3934-CMECM
קולגן ICultrex3442-050-01ECM
קולגן סוג IIMilliporeCC052ECM
קולגן סוג IIIMilliporeCC054ECM
קולגן סוג IVסיגמאC5533ECM
קולגן סוג VMilliporeCC077ECM
COL23A1R & D Systems4165-CLECM
Desmoglein 2R & D Systems947-DMECM
E-cadherin (CDH1)R & D Systems648-ECM
ECM1מו"פ & D Systems3937-ECECM
פיברונקטיןמו"פ & D Systems1918-FNECM
GAP43Abcamab114188ECM
HyA-500KR & D SystemsGLR002ECM
HyA-50KR & D SystemsGLR001ECM
ICAM-1R& D Systems720-ICECM
LamininSigmaL6274ECM
Laminin-5Abcamab42326ECM
LumicanR& D Systems2846-LUECM
M-CAD (CDH15)R & D Systems4096-MCECM
Nidogen-1מו"פ & D Systems2570-NDECM
Osteoadherin/OSADR& D Systems2884-ADECM
אוסטאופונטין (SPP)מו"פ D Systems1433-OPECM
P-Cadherin (CDH3)R & D Systems861-PCECM
PECAM1R& D SystemsADP6ECM
Tenascin CR & D Systems3358-TCECM
VCAM1מו"פ & D SystemsADP5ECM
ויטרונקטיןמו"פ & D Systems2308-VNECM
BiglycanR& D Systems2667-CMECM
DecorinR& D Systems143-DEECM
PeriostinR& D Systems3548-F2ECM
SPARC/אוסטאונקטיןמו"פ & D Systems941-SPECM
טרומבוספונדין-1/2מו"פ & D Systems3074-THECM
Brevicanמו"פ & D Systems4009-BCECM
אלסטיןBioMatrix5052ECM
פיבריליןלין סאקאי מעבדה OHSUN/AECM
ANGPT2RnD_Systems_Own623-AN-025Ligand
IL1BRnD_Systems_Own201-LB-005Ligand
CXCL8RnD_Systems_Own208-IL-010Ligand
IGF1RnD_Systems_Own291-G1-200ליגנד
TNFRSF11BRnD_Systems_Own185-OSLigand
BMP6RnD_Systems_Own 507-BP-020Ligand
FLT3LGRnD_Systems_Own 308-FK-005Ligand
CXCL1RnD_Systems_Own 275-GR-010Ligand
DLL4RnD_Systems_Own1506-D4-050ליגנד
HGFRnD_Systems_Own294-HGN-005Ligand
Wnt5aRnD_Systems_Own645-WN-010Ligand
CTGFLife_Technologies_OwnPHG0286Ligand
LEPRnD_Systems_Own 398-LP-01MLigand
FGF2Sigma_Aldrich_OwnSRP4037-50UGLigand
FGF6RnD_Systems_Own238-F6Ligand
IL7RnD_Systems_Own207-IL-005Ligand
TGFB1RnD_Systems_Own246-LP-025Ligand
PDGFBRnD_Systems_Own220-BB-010Ligand
WNT10AGenemed_Own90009Ligand
PTNRnD_Systems_Own252-PL-050Ligand
BMP3RnD_Systems_Own113-BP-100ליגנד
BMP4RnD_Systems_Own314-BP-010ליגנד
TNFSF11RnD_Systems_Own 390-TN-010ליגנד
CSF2RnD_Systems_Own215-GM-010ליגנד
BMP5RnD_Systems_Own615-BMC-020ליגנד
DLL1RnD_Systems_Own1818-DL-050ליגנד
NRG1RnD_Systems_Own296-HR-050ליגנד
KNG1RnD_Systems_Own1569-PI-010ליגנד
GPNMBRnD_Systems_Own2550-AC-050ליגנד
CXCL12RnD_Systems_Own350-NS-010ליגנד
IL15RnD_Systems_Own 247-ILB-005ליגנד
TNFRnD_ Systems_Own210-TA-020ליגנד
IGFBP3RnD_Systems_Own675-B3-025ליגנד
WNT3ARnD_Systems_Own5036-WNP-010ליגנד
PDGFABRnD_Systems_Own222-ABליגנד
AREGRnD_Systems_Own262-AR-100ליגנד
JAG1RnD_Systems_Own1277-JG-050ליגנד
BMP7RnD_Systems_Own354-BP-010Ligand
TGFB2RnD_Systems_Own302-B2-010Ligand
VEGFARnD_Systems_Own 293-VE-010Ligand
IL6RnD_Systems_Own 206-IL-010Ligand
CXCL12RnD_Systems_Own351-FS-010Ligand
NRG1RnD_Systems_Own378-SMLigand
IGFBP2RnD_Systems_Own674-B2-025Ligand
SHHRnD_Systems_Own1314-SH-025Ligand
FASLGRnD_Systems_Own126-FL-010Ligand
מערכת רובוט BioTek Precision XS מטפל נוזלי רובוט טיפול בנוזלים BioTek המשמש בפרוטוקול Trizma hydrochloride Buffer Solution Sigma T2069

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
  2. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
  3. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  4. LaBarge, M. A., et al. Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integrative Biology (Cambridge). 1 (1), 70-79 (2009).
  5. Watson, S. S., et al. Microenvironment-Mediated Mechanisms of Resistance to HER2 Inhibitors Differ between HER2+ Breast Cancer Subtypes. Cell Systems. 6 (3), 329-342 (2018).
  6. Ranga, A., et al. 3D niche microarrays for systems-level analyses of cell fate. Nature Communications. 5, 4324(2014).
  7. Malta, D. F. B., et al. Extracellular matrix microarrays to study inductive signaling for endoderm specification. Acta Biomater. 34, 30-40 (2016).
  8. Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
  9. Gagnon-Bartsch, J. A., Jacob, L., Speed, T. P. Removing Unwanted Variation from High Dimensional Data with Negative Controls. University of California, Berkeley, Department of Statistics, University of California, Berkeley. , Report No. 820 (2013).
  10. Allan, C., et al. OMERO: flexible, model-driven data management for experimental biology. Nature Methods. 9 (3), 245-253 (2012).
  11. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  12. Bissell, M. J. The differentiated state of normal and malignant cells or how to define a "normal" cell in culture. International Review of Cytology. 70, 27-100 (1981).
  13. Serban, M. A., Prestwich, G. D. Modular extracellular matrices: solutions for the puzzle. Methods. 45 (1), 93-98 (2008).
  14. Kaylan, K. B., et al. Mapping lung tumor cell drug responses as a function of matrix context and genotype using cell microarrays. Integrative Biology (Cambridge). 8 (12), 1221-1231 (2016).
  15. Lin, C. H., Jokela, T., Gray, J., LaBarge, M. A. Combinatorial Microenvironments Impose a Continuum of Cellular Responses to a Single Pathway-Targeted Anti-cancer Compound. Cell Reports. 21 (2), 533-545 (2017).
  16. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Microenvironment MicroarrayExtracellular Matrix ProteinsLigand TreatmentCell Proliferation AssayFluorescent ImagingCellProfiler AnalysisEdU IncorporationBreast Cancer CellsMicroenvironmental FactorsAutomated Imaging

מאמרים קשורים