הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בחינה כמותית של רגישות לאנטיביוטיקה Neisseria gonorrhoeae ATP-ניצול אגרגטים באמצעות מבחני מסחרי, חי/מת מכתים

8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/58978

⸱

8 בפברואר 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Marine Biotechnology and Resources, National Sun Yat-Sen University, 2Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

במאמר זה

סיכום

Assay ATP-מדידה פשוטה של חיים/מתים מכתים שיטת שימשו כדי לכמת והמחש Neisseria gonorrhoeae הישרדות לאחר הטיפול עם צפטריאקסון. פרוטוקול זה ניתן להרחיב לבחון את ההשפעות מיקרוביאלית של כל אנטיביוטיקה, ניתן להשתמש כדי להגדיר את הריכוז המעכב מינימלי של אנטיביוטיקה biofilms חיידקי.

תקציר

הופעתה של עמידים לאנטיביוטיקה Neisseria gonorrhoeae (GC) איום בריאותי ברחבי העולם, מדגיש את הצורך לזהות אנשים נכשלים טיפול. חיידק גראם שליליים זה גורם זיבה באופן בלעדי אצל בני אדם. במהלך זיהום, הוא מסוגל טופס אגרגטים ו/או biofilms. הבדיקה הריכוז המעכב המינימלי (MIC) משמש כדי לקבוע את הרגישות לאנטיביוטיקה וכדי להגדיר את הטיפול המתאים. עם זאת, המנגנון של בהשמדה ויוו ויחסה תוצאות מעבדה לא ידועים. פותחה שיטה זה בוחן כיצד GC צבירת משפיע על רגישות לאנטיביוטיקה ואת מציגה את הקשר בין גודל צבירה של רגישות לאנטיביוטיקה. כאשר הצבירה GC, הם עמידים יותר בפני אנטיביוטיקה להרוג, עם חיידקים במרכז ששרדו צפטריאקסון טיפול טובים יותר מאלו בפריפריה. הנתונים מצביעים כי צבירת gonorrhoeae ש יכול להפחית את הרגישות צפטריאקסון, אשר אינה משתקפת באמצעות השיטות מיקרופון המבוסס על צלחת אגר רגיל. השיטה שבה נעשה שימוש במחקר זה יאפשר לחוקרים לבדוק את הרגישות בקטריאלי בתנאים הרלוונטית קלינית.

מבוא

זיבה היא שנפוצה במגע מיני זיהום (STI)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), diplococcal חיידק גראם שליליים, הוא סוכן סיבתי של המחלה. סימפטומים של זיהום הגניטלי עלולה לגרום לכאב במהלך מתן שתן מוכללת מכאבים באברי המין, הפרשות השופכה. זיהום לעיתים קרובות ללא תסמינים2,3,4,5, זה מאפשר קולוניזציה המורחבת. זיהומים אלה ללא טיפול הם דאגה בריאות קשות, הן בעלות פוטנציאל כדי להקל על שידור של האורגניזם, זה יכול לגרום לסיבוכים כגון מחלה דלקתית של האגן (PID), והופץ על ידי זיבה הזיהום (DGI)6. זיבה עמידים לאנטיביוטיקה היא משבר בריאות הציבור העיקריים של הגדלת נטל חברתי-כלכלי7. הרגישות מופחתת צפלוספורינים הביא שינוי משטר טיפול אנטיביוטיקה יחיד לטיפול כפול, המשלב azithromycin או דוקסיציקלין עם צפטריאקסון8. הכשל מוגברת של צפטריאקסון, azithromycin9,10, בשילוב עם זיהומים אסימפטומטיים, מדגיש את הצורך להבנת כשלים טיפול בזיבה.

המבחן הריכוז המעכב המינימלי (MIC), כולל אגר דילול ולדיסק דיפוזיה בדיקות, שימשה הבדיקה הרפואית סטנדרטי לזיהוי עמידות בפני אנטיביוטיקה. עם זאת, לא ברור אם הבדיקה מיקרופון משקף חיידקים עמידות לאנטיביוטיקה ויוו. היווצרות biofilms חיידקי תורמת ההישרדות של החיידקים בנוכחות ריכוזים אחרים של אנטיביוטיקה: הבדיקה מיקרופון אין אפשרות לזהות את אפקט11. כי GC יכול ליצור biofilms על משטחים הרירית12, אנחנו משערים אנטיביוטיקה זה הרגישות בתוך אגרגטים יהיה שונה כי ראיתי ב- GC בודדים. בנוסף, מחקרים הראו כי שלב שלוש מולקולות על פני משתנה, פילי, חלבונים הקשורים אטימות (אופה), lipooligosaccharides (לוס), המסדירים את האינטראקציות הבין-חיידק, להוביל אגרגטים בגדלים שונים13, 14 , 15. התרומה של רכיבים אלה כדי עמידות לאנטיביוטיקה לא נבדקה עקב המחסור של שיטות נאותה.

כיום, ישנן מספר שיטות למדידת biofilm מיגור. כמותיים השיטה הנפוצה ביותר היא על ידי מדידת שינויים ביומסה באמצעות קריסטל ויולט מכתים16. עם זאת, השיטה דורשת משמעותי מניפולציה ניסויית, אשר יכולים ליצור פוטנציאל שגיאות ניסוי חזרה17. שיטת צביעת חי/מת המשמשת כאן מאפשר הדמיה של חיידקים מתים וחיים והפצה שלהם בתוך biofilm. עם זאת, המבנה biofilm יכול להוות מכשול פיסי אשר מפחית את צבען חדירה. לכן, לכמת חיידקים חיים/מתים בתוך קבוצה, ההכתמה היא מוגבלת biofilms קטן או קודמן-microcolonies או הסיכומים שלה. שיטות אחרות, לרבות אגר דילול ולדיסק דיפוזיה הבדיקות, אינם יכולים למדוד את ההשפעות של צבירה. לבחון GC הרגישות תוך צבירת לאחר חשיפה לאנטיביוטיקה, שיטה אידיאלית צריך לקיים את שניהם assay כמותיים שיכול למדוד לחיות חיידקים והמחש ההפצה שלהם.

ההליך המתואר כאן משלב המדידה של ATP-ניצול, חי/מת מכתים הנועד באופן כמותי, בחנו ויזואלית GC הרגישות בתוך אגרגטים בנוכחות אנטיביוטיקה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

תחזוקה כללית של זנים GC

  1. פסים gonorrhoeae ש זנים על אגר חוזרת עם 1% קלוג תוספי תזונה18 (טבלה 1, בטבלה 2) ממניות מקפיא, דגירה 37 ° C עם 5% CO2 במשך 16-18 ח' שימוש MS11 לבטא משתנה-שלב Opa (MS11Opa +), לא אופה (MS11ΔOpa), או לוס קטום (MS11ΔLgtE).
  2. בזהירות לבחור pili שלילי (המושבה ללא קצה כהה) או חיובית (המושבה עם קצה כהה) מושבות מהמאמץ כל מבוסס על המושבה מורפולוגיה19 באמצעות מיקרוסקופ אור ויבתר פס על גבי צלחת חוזרת חדשה.
  3. דגירה ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך 16-18 שעות לפני השימוש.

2. הכדאיות כימות של הצטברויות של GC

  1. לאסוף GC באמצעות של המוליך סטרילי. ספוגית GC מהצלחת ו- GC להשעות מחדש במרק ומחוממת מראש (GCP, טבלה 3) בתוספת NaHCO 4.2%3 ו- 1% קלוג פתרונות18. השתמש ספקטרופוטומטר באורך-גל של 650 nm (OD650 1 = ~ 1 x CFU 109/mL) כדי לקבוע ריכוז חיידקים על תנאי.
  2. התאם את הריכוז של GC ~ 1 x 108 CFU/mL.
  3. להוסיף µL 99 של השעיה GC מנוכי עונתיות לתוך בארות של צלחת 96-ובכן.
  4. דגירה את הצלחת. בשביל 6-אייץ ' ב 37 ° C עם 5% CO2 כדי לאפשר את החיידקים להפעיל עליה פונקציית צבירה.
  5. להוסיף 1 µL של טורי צפטריאקסון מדולל (1000, 100, 50, 25, 12.5, 6.2, 3.1, 1.5, 0.8, 0.4, 0.2 µg/mL) כל טוב. להשאיר מספר בארות לא מטופל לשמש כפקדי.
  6. דגירה את הצלחת במשך 24 שעות ביממה ב 37 ° C עם 5% CO2.
  7. Sonicate התליה 3 פעמים ב מכל קידוח עבור 5 s ב 144 W ו-20 קילו-הרץ.
  8. להוסיף 100 µL של ניצול ATP זמינים מסחרית, זוהר ריאגנט לבאר כל, פיפטה למעלה-למטה עבור 3 פעמים, ואת תקופת דגירה של 15 דקות ב 37 ° C עם 5% CO2.
  9. בזהירות להעביר µL 150 של תערובת מכל קידוח לתוך באר חדשה ב microplate שחור 96-ובכן ולהימנע היכרות עם בועות.
  10. למדוד את ספיגת כל הבאר-560 nm באמצעות קורא צלחת.
  11. לחשב שיעור ההישרדות לפי היחס של הקריאה שהושג לאחר הטיפול צפטריאקסון טורי לקריאת מבארות ללא טיפול.

3. קרינה פלואורסצנטית ניתוח מיקרוסקופי של חי/מת האגרגטים GC

  1. לאסוף GC באמצעות של המוליך סטרילי. ספוגית GC מהצלחת ו- GC מחדש להשעות מראש ומחוממת GCP מדיה בתוספת 1% קלוג תוספי תזונה.
  2. לקבוע את מספר החיידקים על ידי ספקטרופוטומטר באורך-גל של 650 nm ולהתאים את הריכוז של GC ~ 1 x 107 CFU/mL.
  3. להוסיף µL 198 GC השעיה לתוך צ'יימברס 8-ובכן coverslip למטה.
  4. דגירה התא עבור 6-אייץ ' ב 37 ° C עם 5% CO2 כדי לאפשר היווצרות צבירה.
  5. להוסיף 2 µL של צפטריאקסון (µg 100/mL או דילולים שונים) כל טוב בתוך בכל מצב צבירה. תקופת דגירה של הזמן המבוקש ב 37 ° C עם 5% CO2.
  6. הוסף µL 0.6 תערובת פתרון מכתימים חי/מת לבאר כל ' תקופת דגירה של 20 דקות ב 37 ° C עם 5% CO2.
  7. רוכשים את Z-סדרת תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (מיקרוסקופ המקביל יכול לשמש).
  8. לנתח את התמונות באמצעות תוכנת ImageJ למדידת גודל אגרגטים GC היחס עוצמת קרינה פלואורסצנטית (FIR) של חיים-אל-מת מכתים במצטבר לכל.

4. תמונות ניתוח

  1. הערכה של גודל האגרגטים חיידקי.
    1. פתח ImageJ ופתח תמונה על-ידי גרירת קובץ תמונה מסוג raw לשורת התפריטים ImageJ.
    2. לחץ על קווים חופשיים בשורת התפריטים ImageJ ותזיזו את האזור של כל מצבור בתמונה.
    3. לחץ על ניתוח | מדד בשורת התפריטים ImageJ.
    4. להשיג את המספר בחלון חדש תחת העמודה באזור .
  2. כימות של חיים-אל-מת יחס של הסיכומים
    1. פתח ImageJ ופתח תמונה על-ידי גרירת קובץ תמונה מסוג raw לשורת התפריטים ImageJ.
    2. לחץ על ניתוח | לקבוע מידות בשורת התפריטים ImageJ.
    3. בדוק את צפיפות משולבים בחלון המוקפץ ' ולחץ על ' אישור'.
    4. לחץ על התמונה | צבע | ערוצי כלי שורת התפריטים, בחר צבע.
    5. בדוק בערוץ 1 כמו זריחה על חיידקים חיים מכתים.
    6. לחץ על קווים חופשיים בשורת התפריטים ImageJ ותזיזו את האזור של כל מצבור.
    7. לחץ על ניתוח | מדד בשורת התפריטים ImageJ.
    8. להשיג את המספר תחת העמודה IntDen .
    9. בדוק בערוץ 2 כמו זריחה על צביעת חיידקים מתים. חזור על שלבים 4.2.6-4.2.8.
    10. להשיג את היחס לחיות-אל-מת על-ידי חלוקת מספר מהשלב 4.2.8 לפי מספר מהשלב 4.2.9.
  3. ניתוח סטטיסטי
    1. פתח GraphPad מנסרה, הזן את המספרים המתקבלים ImageJ אל העמודה הרצויה.
    2. לחץ על Analyze ובחר t בדיקות תחת העמודה ניתוחים.
    3. בדוק את העמודה הרצויה עבור השוואה ' ולחץ על ' אישור'.
    4. להשיג ערך P מתחת לחלון ניתוח .
    5. בחר את הרגרסיה הליניארית תחת ניתוחים XY מ שלב 4.3.3
    6. להשיג את R בריבוע ואת ערך-P מתחת לחלון ניתוח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

שתי שיטות הועסקו: assay ניצול של ATP ואת וזמינותו מוכתמים חי/מת. התוצאות ניתן להיות משולב או בנפרד המשמש לבחינת הישרדות חיידקי בתוך אגרגטים לאחר טיפול אנטיביוטי. ATP הניצול וזמינותו הוכח כדי למדוד במדויק קיימא חיידקים S. aureus biofilms20,21. כאן, פיל + MS11Opa + זן שימש לבחון את התפקיד של צבירת GC רגישות לאנטיביוטיקה. Non-המצטברים MS11Opa + פיל +, MS11Opa צבור + פיל +, או המצטברים, ואז ע י sonication MS11Opa + לפיל + שטו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

חיידקים יכולים ליצור biofilms במהלך זיהום של הגוף האנושי. בדיקת מיקרופון מסורתיות אינן משקפות בהכרח את הריכוז הדרוש כדי למגר חיידקים ממבנה biofilm. כדי לבדוק את ההשפעות antimicrobials על ממבנה biofilm, שיטות בהתבסס על biofilm ביומסה, כמו גם plating CFUs יכול להיות מוטעים עקב ההשפעה של מבנה biofilm. לדוגמה, שיטת ציפוי פועלת רק אם biofilm עלולות להפגע. לפיכך, CFU שהושג עשוי להיות נמוך יותר מאשר מספר חיידקים מעשית בפועל. להמחיש חיידקים מתים וחיים בתוך biofilm הוקמו למדידת ההישרדות של החיידקים בתוך biofilm, עם זאת, בהתאם מבנ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענק של המכון הלאומי לבריאות D.C.S., W.S. AI123340. ל', סי-וו. וו, איי. סי., והסתייעות E.N. ב חלק/להשתתף בתוכנית "בשנה הראשונה חדשנות & מחקר ניסיון" ממומן על ידי אוניברסיטת מרילנד. התורמים שחיים היה אין תפקיד לימוד עיצוב, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה לפרסם, או אופן ההכנה של כתב היד. אנו להכיר UMD CBMG הדמיה הליבה עבור כל הניסויים מיקרוסקופ.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
100x קלוגס
אגרארצות הברית ביולוגיA0930
BacTiter Assay PromegaG8232
CeftriaxoneTCIC2226
Difco GC בסיס בינוני BD228950
ברזל חנקתי, נולאהידרט Sigma-Aldrich254223-10G
גלוקוזתרמו פישר מדעיBP350-1
L-גלוטמין אבקה גבישיתפישר סיינטיפיקBP379-100
BacLight צביעה חיה/מתהInvitrogenL7012
MS11 Neisseria gonorrhoeae זןמסופק באדיבות על ידי ד"ר הרמן שניידר, המכון הצבאי וולטר ריד עבור מחקר
אשלגן פוספט דו-בסיסי (K2HPO4)FisherScientificP290-500
אשלגן פוספט מונו-בסיסי (KH2PO4)Fisher ScientificBP329-1
פרוטאוז פפטון BD Biosciences211693
נתרן כלורי (NaCl)פישר סיינטיפיקS671-10
עמילן מסיססיגמא-אולדריץ'S9765
תיאמין פירופוספטסיגמא-אולדריץ'C8754-5G
ציוד
צלחות פטריVWR25384-302
8 בארות כיסויתא תחתון Thermo Fisher Scientific155411
צלחות תרבית רקמה 96 בארות קורנינג, ארון3370
(NU-425-600 Class II, קולט אדים למינארי זרימה ביולוגית)Nuaire32776
CO2 חממתפישר סיינטיפיק  דגם 3530
מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד בתא הדמיה חיLeicaSP5X
Corning  96 באר מיקרופלטת פוליסטירן שחורה תאורת קורנינג3904
גלומקס קצות פיפטה PromegaE6521
(0.1-10 ומיקרו; L)Thermo Fisher Scientific02-717-133
קצות פיפטה (1000 ומיקרו; L)VWR83007-382
קצות פיפטה (200 ומיקרו; L)VWR53509-007
ספקטרופוטומטר Ultrospec 2000 UVPharmacia Biotech80-2106-00
צינורות חרוטיים סטריליים 15 מ"לVWR21008-216
צינורות מיקרוצנטריפוגה סטריליים (1.7 מ"ל)Sorenson BioScience16070
אפליקטורים סטריליים עם קצה פוליאסטרפישר סיינטיפיק23-400-122
SonicatorKontesשווה ערך ל-9110001
תוסף בטיחות ביולוגית פלקון

מקורות

  1. CDC STD Facts. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: http://www.cdc.gov/std/gonnorrhea/STDFact-gonorrhea-detailed.htm (2017).
  2. den Heijer, C. D., et al. A comprehensive overview of urogenital, anorectal and oropharyngeal Neisseria gonorrhoeae testing and diagnoses among different STI care providers: a cross-sectional study. BMC Infectious Diseases. 17 (1), (2017).
  3. Hein, K., Marks, A., Cohen, M. I. Asymptomatic gonorrhea: prevalence in a population of urban adolescents. The Journal of Pediatrics. 90 (4), 634-635 (1977).
  4. Hananta, I. P., et al. Gonorrhea in Indonesia: High Prevalence of Asymptomatic Urogenital Gonorrhea but No Circulating Extended Spectrum Cephalosporins-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strains in Jakarta, Yogyakarta, and Denpasar, Indonesia. Sexually Transmitted Diseases. 43 (10), 608-616 (2016).
  5. Chlamydia, W. H. O. Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, syphilis and Trichomonas vaginalis. Methods and results used by WHO to generate 2005 estimates. World Health Organisation, 2011. Prevalence and incidence of selected sexually transmitted infections. World Health Organisation. , accessed Oct 5 (2011).
  6. Mayor, M. T., Roett, M. A., Uduhiri, K. A. Diagnosis and management of gonococcal infections. American Family Physician. 86 (10), 931-938 (2012).
  7. Alirol, E., et al. Multidrug-resistant gonorrhea: A research and development roadmap to discover new medicines. PLOS Medicine. 14 (7), (2017).
  8. Workowski, K. A., Bolan, G. A. Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2015. MMWR Recommendations and Reports. 64, 1-137 (2015).
  9. Lahra, M. M., et al. Cooperative Recognition of Internationally Disseminated Ceftriaxone-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strain. Emerging Infectious Diseases. 24 (4), (2018).
  10. Wi, T., et al. Antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae: Global surveillance and a call for international collaborative action. PLOS Medicine. 14 (7), 1002344(2017).
  11. Singh, S., Singh, S. K., Chowdhury, I., Singh, R. Understanding the Mechanism of Bacterial Biofilms Resistance to Antimicrobial Agents. Open Microbiology Journal. 11, 53-62 (2017).
  12. Greiner, L. L., et al. Biofilm Formation by Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 73 (4), 1964-1970 (2005).
  13. Zollner, R., Oldewurtel, E. R., Kouzel, N., Maier, B. Phase and antigenic variation govern competition dynamics through positioning in bacterial colonies. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
  14. Stein, D. C., et al. Expression of Opacity Proteins Interferes with the Transmigration of Neisseria gonorrhoeae. across Polarized Epithelial Cells. PLoS One. 10 (8), 0134342(2015).
  15. LeVan, A., et al. Construction and characterization of a derivative of Neisseria gonorrhoeae strain MS11 devoid of all opa genes. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6468-6478 (2012).
  16. Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Curr Protoc Microbiol. , Chapter 1., Unit 1B.1 (2005).
  17. Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
  18. White, L. A., Kellogg, D. S. Neisseria Gonorrhoeae Identification in Direct Smears by a Fluorescent Antibody-Counterstain Method. Journal of Applied Microbiology. 13, 171-174 (1965).
  19. Swanson, J., Kraus, S. J., Gotschlich, E. C. Studies on gonococcus infection. I. Pili and zones of adhesion: their relation to gonococcal growth patterns. Journal of Experimental Medicine. 134 (4), 886-906 (1971).
  20. Herten, M., et al. Rapid in Vitro Quantification of S. aureus Biofilms on Vascular Graft Surfaces. Frontiers in Microbiology. 8, 2333(2017).
  21. Gracia, E., et al. In vitro development of Staphylococcus aureus biofilms using slime-producing variants and ATP-bioluminescence for automated bacterial quantification. Luminescence. 14 (1), 23-31 (1999).
  22. Webb, J. S., et al. Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Journal of Bacteriology. 185 (15), 4585-4592 (2003).
  23. Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide. Journal of visualized experiments. (47), (2011).
  24. Wang, L. C., Litwin, M., Sahiholnasab, Z., Song, W., Stein, D. C. Neisseria gonorrhoeae Aggregation Reduces Its Ceftriaxone Susceptibility. Antibiotics (Basel). 7 (2), (2018).
  25. Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 510-543 (2014).
  26. Hall-Stoodley, L., et al. Towards diagnostic guidelines for biofilm-associated infections. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 127-145 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ATP
בחינה כמותית של רגישות לאנטיביוטיקה Neisseria gonorrhoeae ATP-ניצול אגרגטים באמצעות מבחני מסחרי, חי/מת מכתים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.