מוטגנזה עבור במבחנה, בניסויים Vivo ביטוי עם אינטראקציות RNA ב- Escherichia Coli

הדנ א הוא המכונה לעתים קרובות ה-blueprint של תא חי מאז מבני התא מקודדים את רצף ה-DNA שלו. שכפול מדויק מנגנוני תיקון DNA על מנת להבטיח כי רק מאוד נמוכים של מוטציות מתרחשות, שהוא חיוני לקיום פונקציות הנכון של גנים מקודד. שינויים של רצף הדנ א יכול להשפיע על פונקציות רציפות ברמות שונות החל עם ה-DNA (זיהוי על-ידי גורמי שעתוק, אנזימי הגבלה), ואז RNA (זוג בסיסים משלימים את החסר והשינויים מבנה שניוני) ו/או חלבון (אמינו החלפות חומצה, מחיקות, תוספות או מסגרת-משמרות). בעוד מוטציות רבות אינן משפיעות על תפקוד הגן באופן משמעותי, יש מוטציות ב- DNA יכולים להיות השלכות ענקיות. לפיכך, מוטגנזה הוא כלי רב ערך עבור לומד את החשיבות של אתרים DNA ספציפיים בכל הרמות.

פרוטוקול זה מתאר גישה מוטגנזה מכוונת יישוב נוהג להציג מוטציות ספציפיות. הפרוטוקול מסתמכת על שתי אסטרטגיות שונות של ה-PCR: צעד 2 או של PCR 3-צעד. 2-שלב ה-PCR ישימה אם המוטציה הרצוי קרוב בקצה 5' או 3' הסוף של ה-DNA של הריבית (< 200 בסיסי זוגות (bp) מסוף) ואת ה-PCR 3-צעד ישימה בכל המקרים.

בגישה PCR דו-שלבי, תחל 3 מיועדים שבו ערכה אחת של תחל נועד להגביר את ה-DNA של הריבית (primers 1 ו- 3, קדימה, הפוך, בהתאמה), יחיד פריימר נועדה לשלב את המוטציה. המוטציה היכרות עם פריימר (פריימר 2) צריך להיות כיוון הפוך, אם המוטציה קרוב לסוף 5', כיוון קדימה אם המוטציה קרוב בקצה 3'. בשלב הראשון PCR, פריימר 1 + 2 או 3 2 + מגביר קטע קטן קרוב 5' קצה או 3' בסוף, בהתאמה. PCR ובמוצר משמשת פריימר בשלב שתיים עם פריימר 1 או 3, ובעקבותיה במוצר ה-PCR עם מוטציה ב- DNA של עניין (איור 1 א').

ב- PCR 3-צעד, תחל 4 מיועד, שבו ערכה אחת של תחל נועד להגביר את ה-DNA של הריבית (primers 1 ו- 4, קדימה, הפוך, בהתאמה), סט צבעי יסוד אחד נועדה לשלב מוטציות ספציפיות עם חופפים משלימים את החסר (תחל 2 ו- 3, הפוך, קדימה, בהתאמה). בשלב הראשון והשני, תחל 1 + 2 ו- 3 + 4 להגביר בקצה 5' ו 3'. בשלב 3, מוצרי ה-PCR וכתוצאה מכך צעד ראשון, שני משמשים כתבניות ומצויים מוגבר עם תחל 1 + 4. לכן, ובמוצר PCR הוא ה-DNA של עניין עם המוטציה הרצוי (איור 1B).

בעוד ה-DNA מוטציה יכול לשמש עבור כל יישום במורד הזרם, פרוטוקול זה מתאר כיצד לשלב את הדנ א מחדש לתוך השיבוט וקטור. השימוש של שיבוט וקטורים יש מספר יתרונות כגון הקלות של שכפול ויישומים ספציפיים ניסיוני תלוי בתכונות של וקטור. תכונה זו משמשת לעתים קרובות ללימודי אינטראקציה עם ה-RNA. טכניקה נוספת ללימודי אינטראקציה עם ה-RNA היא חיטוט מבנית של הרנ א במתחם עם עוד RNA^1,2 או חלבון^3,4. עם זאת, חיטוט מבניים מבוצעת רק במבחנה ואילו מוטגנזה ו שיבוט עוקבות לאפשר ללימודי אינטראקציה ויוו.

מוטגנזה בהרחבה שימש לחקר אינטראקציה RNA כפי שהוצג כאן. עם זאת, שיטת המפתח לגבי 2 או 3-צעד PCR החלים על כל פיסת דנ א, ובכך לא רק מוגבל ללימודים RNA-אינטראקציה.

כדי להדגים את הטכניקה ואת השימושים האפשריים שלו, משמש אפיון אזורי חשוב post-transcriptional ויסות mRNA, csgD, של Escherichia coli (e. coli). ב e. coli, csgD מכוון על ידי קטן ללא קידוד RNA, McaS, בשיתוף עם חלבון, Hfq, להדחיק חלבון-ביטוי של^4,2,CsgD⁵. הטכניקה משמשת כדי להציג מוטציות באזור בסיס תיאום בין csgD לבין McaS, לאתר איגוד Hfq של csgD. ה-DNA שהושג לאחר מכן שוכפל לתוך וקטור מתאים לניסויים הבאים יישומים במורד הזרם של הטכניקה כוללים ניסויים במבחנה וגם ויוו. להמחשה, דוגמה 1 מאופיין ויוו שימוש assay תספיג והוא דוגמה 2 מאופיין במבחנה באמצעות assay משמרת של ניידות electrophoretic (EMSA). בשני המקרים, זה מאויר איך מוטגנזה יכול לשמש בשילוב עם טכניקות אחרות כדי להפוך ביולוגי מסקנות לגבי הגן עניין.

1. וקטור בחירה

1. לבחור וקטור לבצע ניסויים במורד הזרם. כל וקטור הוא ישים עבור שיטה זו PCR 2 - ו 3-צעד.
2. בהתבסס על הבחירה של וקטור, לבחור אנזימי הגבלה המתאים עבור שכפול.

2. פריימר עיצוב עבור אתר ביים מוטגנזה מכוונת

1. להחליט בכל שלב 2 או 3-צעד PCR האסטרטגיה (2-שלב זה רק עבור מוטציות < 200 bp מקצה ה-dna של עניין). עבור PCR דו-שלבי, עבור לשלב 2.2 וללכת על ה-PCR 3-צעד צעד 2.3.
2. עיצוב צבעי יסוד 2-שלב ה-PCR.
   1. עיצוב פריימר 1 ו- 3 כדי להגביר את ה-DNA של עניין ועם של 5' בולט זה מכיל נוקלאוטידים 4 (למשל, האישיות של או AGCT) ואחריו האתר זיהוי הגבלת הרלוונטי הדרוש לשבט לתוך הווקטור שבחרת.
   2. עיצוב פריימר 2 כדי להציג את mutation(s)-האתר הרצוי ולאגף את המוטציה עם 10-15 נוקלאוטידים משלימים משני הצדדים. הפוך את פריימר אם המוטציה הוא הציג בקצה 5' או להעביר אם המוטציה הוא הציג בקצה 3'.
3. עיצוב צבעי יסוד 3-צעד PCR.
   1. עיצוב פריימר 1 ו- 4 כדי להגביר את ה-DNA של עניין ועם של 5' בולט זה מכיל נוקלאוטידים 4 (למשל, האישיות של או AGCT) ואחריו האתר זיהוי הגבלת הרלוונטי הדרוש לשבט לתוך הווקטור שבחרת.
   2. עיצוב פריימר 2 ו- 3 כדי להציג את mutation(s) על האתר הרצוי ולאגף את המוטציה על ידי 10-15 נוקלאוטידים משלימים משני הצדדים. פריימר 2 ו- 3 הינם הפוך משלימים.

3. PCR הגברה של פראי סוג דנ א לקראת שיבוט

הערה: לקבלת פרטים אודות ה-PCR, ראה⁶.

1. לבצע PCR⁶ באמצעות תחל 1 + 2 (2-צעד PCR) או 1 + 4 (3-צעד PCR) ולהשתמש פראי סוג DNA כתבנית כדי להשיג PCR מוצר אני השתמש בתוכנית ה-PCR טבלה 1.
2. אמת PCR על-ידי agarose בג'ל.
   1. להפוך את agarose ג'ל פתרון (2%) על-ידי הוספת 2 גר' agarose לכל 100 מ ל 1 x טריס-אצטט-ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) (טה) המאגר. להמיס את agarose על ידי הרתחה בתנור מיקרוגל. להוסיף מכתים DNA לצבוע אתידיום ברומיד (כדי ריכוז סופי של ~ 0.5 µg/mL) כדי agarose ג'ל פתרון עבור פריט חזותי.
   2. יציקה agarose ג'ל, מניחים אותה יחידת אלקטרופורזה, וטען PCR (מעורבב עם טעינת ה-DNA צבען) ודוגמאות סולם הדנ א של גודל ידוע. לפעול דגימות בהספק של 75 וואט במשך 45 דקות, או עד להקות מופרדים כראוי, ותנסו לדמיין את להקות בשולחן אולטרה סגול (UV) או עם ג'ל מערכת הדמיה.
3. לטהר את המוצר PCR עם ערכת חילוץ ג'ל (טבלה של חומרים) ומדידת הריכוז של DNA מטוהרים עם ספקטרופוטומטרים (טבלה של חומרים).
4. חנות ה-DNA מטוהרים ב-20 ° C (במאגר טריס-EDTA (TE) – אחסון לטווח ארוך) או 4 ° C (ב- dH₂O – אחסון לטווח קצר) רק בשימוש בשלב 5.

4. PCR להציג את האתר מכוון מוטציות ב- DNA

1. PCR עבור 2-שלב ה-PCR (ראה שלב 4.2 עבור 3-צעד PCR)
   1. לבצע PCR⁶ באמצעות תחל 1 + 2 אם מוטציות הם בקצה 5' או 2 + 3 אם מוטציות נמצאים 3' קץ ולהשתמש דנ א פראי סוג כתבנית כדי לקבל מוצר ה-PCR II (ראה טבלה 1 לתוכנית ה-PCR).
   2. אמת PCR על-ידי agarose בג'ל כמו שלב 3.2.1 3.2.2.
   3. לטהר את המוצר PCR עם ערכת חילוץ ג'ל (טבלה של חומרים) ומדידת הריכוז של DNA מטוהרים עם ספקטרופוטומטרים (טבלה של חומרים).
   4. חנות טהור DNA ב-20 ° C (במאגר טה) או 4 ° C (ב- dH₂O) רק בשימוש בשלב 5.
   5. לבצע PCR⁶ באמצעות PCR המוצר השני כמו ומהצמיגים יחד עם פריימר 3 אם מוטציות נמצאים 5' קצה או פריימר 1 אם מוטציות בקצה 3' ושימוש פראי סוג DNA כתבנית כדי לקבל מוצר ה-PCR השלישי (ראה טבלה 1 לתוכנית ה-PCR).
   6. אמת PCR על-ידי agarose בג'ל כמו שלב 3.2.1 3.2.2.
   7. לטהר המוצר PCR עם ערכת חילוץ ג'ל (טבלה של חומרים) ומדידת הריכוז של ה-DNA מטוהרים עם ספקטרופוטומטרים (טבלה של חומרים).
   8. חנות טהור DNA ב-20 ° C (במאגר טה) או 4 ° C (ב- dH₂O) עד שלב 5.
2. PCR עבור 3-צעד PCR
   1. לבצע PCR⁶ באמצעות תחל 1 + 2 ו- 3 + 4 תגובות נפרדות ולהשתמש פראי סוג DNA כתבנית כדי לקבל מוצר ה-PCR II ו- III (ראה טבלה 1 לתוכנית ה-PCR).
   2. אמת מותני על-ידי agarose בג'ל כמו שלב 3.2.1 3.2.2.
   3. לטהר PCR מוצרים עם ערכת חילוץ ג'ל (טבלה של חומרים) ומדידת הריכוז של DNA מטוהרים עם ספקטרופוטומטרים (טבלה של חומרים).
   4. חנות טהור DNA ב-20 ° C (במאגר טה) או 4 ° C (ב- dH₂O).
   5. לבצע PCR⁶ באמצעות תחל 1 + 4 ולהשתמש נג 2-5 של שני המוצרים PCR II ו- III כתבניות (ב אותה התגובה) כדי להשיג PCR המוצר הרביעי (ראה טבלה 1 לתוכנית ה-PCR).
   6. אמת PCR על-ידי agarose בג'ל כמו שלב 3.2.1 3.2.2.
      הערה: זה לא יוצא דופן לקבל מספר להקות שגוי (לפעמים ניתן להפחית באמצעות תבנית פחות). עם זאת, ניתן להתעלם המוצרים PCR שגוי אם הלהקה בגודל הנכון הוא טוחנות, ג'ל, חילוץ.
   7. אם זה נכון, לטהר את מוצר ה-PCR עם ערכת חילוץ ג'ל (טבלה של חומרים) ומדידת הריכוז של ה-DNA מטוהרים עם ספקטרופוטומטרים (טבלה של חומרים).
   8. חנות טהור DNA ב-20 ° C (במאגר טה) או 4 ° C (ב- dH₂O) עד שלב 5.

5. רקומבינציה וסוג הפרוע הגירסאות מוטציה של ה-DNA לתוך הווקטור שבחרת.

הערה: לקבלת פרטים אודות ביצוע השלבים, ראה⁷.

1. תקציר מטוהרים PCR מוצרים I ו- III (מ- 2-צעד PCR) ו/או הרביעי (מתוך 3-צעד PCR) באמצעות אנזימי הגבלה הרלוונטיים את.
   1. ב 20 µL 1 x עיכול מאגר עם µL 1 של כל אנזים הגבלה, תקציר 200 ng של מוצר ה-PCR ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30-60 דקות.
2. לטהר המוצר PCR מתעכל על ידי ג'ל-חילוץ באמצעות ערכת חילוץ ג'ל (טבלה של חומרים), מודדים את ריכוז הדנ א של DNA מטוהרים עם ספקטרופוטומטרים (טבלה של חומרים) ו לאחסן ב-20 ° C (במאגר טה) או 4 ° C (ב- dH₂ O) עד המשמש שלב 5.6.
3. לעכל את וקטור מטוהרים עם אנזימי הגבלה הרלוונטיים ולנהוג עם אלקליין פוספטאז כדי להקטין את וקטור מצדו מחדש אירועים. אל תתייחס PCR מוצרים עם phosphatase אלקליין.
   1. ב- µL 30 1 x עיכול מאגר עם µL 1 של כל אנזים הגבלה, µL 1 של phosphatase אלקליין, תקציר 1,000 ng של וקטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30-60 דקות.
4. וקטור מתעכל נפרד מ- DNA פסולת (למשל, וקטור נימולים, לגזור את הדנ א) שימוש בג'ל agarose כמו שלב 3.2.1 3.2.2.
5. לטהר וקטור מתעכל על ידי ג'ל-חילוץ באמצעות ערכת חילוץ ג'ל (טבלה של חומרים), למדוד את ריכוז הדנ א של ה-DNA מטוהרים עם ספקטרופוטומטרים (טבלה של חומרים) ו לאחסן ב-20 ° C (במאגר טה) או 4 ° C (ב- dH₂O) עד לשימוש שלב 5.6.
6. מאתרים ומפסיקים את מוצרי ה-PCR מתעכל לתוך וקטור מתעכל עם תגובות המצוין בטבלה מס ' 2.
7. דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעתיים או לילה ב-16 ° c
8. להפוך הנמען זן (למשל, e. coli K12) עם תגובות מצדו.
   1. לגדול עומס יתר₆₀₀= 0.3-0.5 והעברה 1 מ"ל תרבות כדי צינורות 1.5 mL רבים כמו תגובות ליגאז.
   2. ספין-x 3,500 g עבור 5 דקות ולמחוק את תגובת שיקוע.
   3. Resuspend תאים μL 200 מאגר טרנספורמציה (10 מ"ל של מרק lysogeny (ליברות) עם 0.1 g/mL פוליאתילן גליקול 3350, 5% דימתיל סולפט ו 20 מ מ MgCl₂).
   4. הוסף תגובה מצדו, במקום הצינורות על קרח למשך 30 דקות.
   5. מכת חום למשך 2 דקות ב 42 º C.
   6. להוסיף 1 מ"ל של LB הצינורות 1.5 מ ל, וכן לאפשר ביטוי פנוטיפי של עמידות לאנטיביוטיקה לפחות 45 דקות ב 37 º C.
   7. לסובב את התאים ב 3,500 x g למשך 5 דקות, למחוק 1 מ"ל של תגובת שיקוע ולאחר resuspend התאים תגובת שיקוע הנותרים.
   8. צלחת את התאים על צלחות עם אנטיביוטיקה מתאימה, דגירה בין לילה ב 37 º C.
9. זהה transformants מחסה וקטורים עם האינטגרציה המוצלחת של ה-DNA הוספה (לדוגמה, על ידי ה-PCR באמצעות תחל ספציפיים וקטוריים או הוספה).
10. לאמת את רצף ה-DNA על ידי סנגר רצף.
    התראה: לא להשתמש תחל את אותו רצף משמש עבור שלב 5.9.

6. שימוש את הווקטורים נבנה עבור ניסויים במבחנה ו/או ויוו

1. ניסוי in vivo
   הערה: זה דוגמה לשימוש וקטור לבטא פראי סוג מוטציה RNA לאפיין תקנה post-transcriptional. ראו פרטים נוספים על סופג המערבי,⁸.
   1. גדלים זנים K12 e. coli עם וקטורים נבנה בינוני המתאים, זירוז ביטוי במידת הצורך. דוגמאות הקציר על ידי צנטריפוגה.
   2. הכין דוגמיות נתרן dodecyl סולפט – לזיהוי בג'ל (מרחביות-עמוד) על ידי המסת תא כדורי 1 x מרחביות דוגמת המאגר (62.5 מ"מ טריס-HCl pH 6.8, 2.5% מרחביות, 0.002% bromophenol כחול, β-mercaptoethanol 5%, 10% גליצרול) והרתיחו ב 95 ° C 5 min.
      הערה: זה אפשרי להטיל ג'ל או להשתמש ג'ל precast זמינים מסחרית. האחרון היה בשימוש התוצאות המוצג באיור 3 (טבלה של חומרים).
   3. לטעון 10⁷ תאים של כל מדגם בבארות נפרדים, (כולל סולם חלבון), ולהפעיל ג'ל ב- 200 וולט עד החלבונים מופרדים (כ- 45 דקות).
   4. למחוק את החלבונים על תאית-קרום בהעברה חצי יבש 80 mA לשעה.
   5. לחסום את הקרום עם תערובת של חלבונים (למשל, 5%-אבקת חלב מומס 1 x Tween 20 טריס-באגירה מלוחים (TTBS) מאגר).
   6. מוסיפים נוגדן הראשי (מומס 1 מאגר x TTBS) המטרה החלבון עניין (למשל, ה-GFP-, דגל או חלבון מתויג שלו), תקופת דגירה של h 1 עם עצבנות עדין.
   7. רחץ ממברנה ב 1 x TTBS 10 דקות להסיר את הנוגדנים לא מאוגד. חזור פעמיים יותר.
   8. הוספת נוגדן המשני (מומס 1 מאגר x TTBS) שמכוונת את הנוגדנים הראשי ולאפשר איתור (למשל, חזרת peroxidase (HRP)-מצומדת נוגדנים משניים. תקופת דגירה של h 1 עם עצבנות עדין.
   9. לשטוף את הקרום ב 1 x TTBS 10 דקות להסיר את הנוגדנים לא מאוגד. חזור פעמיים יותר.
   10. המחש את הקרום בעזרת טכניקה תואם הנוגדנים משני (למשל, על-ידי הדמיה לאחר דגירה עם chemiluminescence נגזר הלומינול, אם נוגדנים משניים מצומדת HRP היה בשימוש).
2. ניסויים במבחנה
   הערה: זוהי דוגמה של שימוש וקטור כתבנית עבור הפריה שעתוק RNA לאפיון אינטראקציות חלבון ה-RNA. ראו פרטים נוספים על EMSA,⁹.
   1. להפוך תעתיקים במבחנה באמצעות T7 חוץ גופית שעתוק קיט (טבלה של חומרים), וקטורים משלב 5 כתבניות.
   2. נפרדים תעתיקים RNA מאת דף על אוריאה שבעה מ' 4.5% denaturing ג'ל ולאחר לחלץ RNA ישירות מן הג'ל על-ידי אלקטרו • תנאי עם דיאליזה צינורות (טבלה של חומרים).
   3. תווית ה-RNA (למשל, radiolabeling עם γ -³²P-ATP באמצעות T4-polynucleotide קינאז (טבלה של חומרים) ולטהר שוב עם עמודות (טבלה של חומרים).
      התראה: לפני עבודה עם חומר רדיואקטיבי, התייעץ עם הקצין בטיחות קרינה מקומית.
   4. מערבבים מתויג-RNA עם ריכוז חלבון נפרד בתגובות 1 x מחייבת מאגר (20 מ מ טריס, pH 8, 100 מ מ אשלגן כלורי, 1 מ MgCl₂, dithiothreitol 1 מ מ (DTT)).
      הערה: בתוצאות הציג (איור 4), 2 nM של csgD radiolabeled mRNA היה מעורב עם שיפוע של 0 עד 2 מיקרומטר Hfq חלבון (ריכוז מונומר).
   5. לאפשר חלבון ו- RNA hybridize לפני טעינת הכלאה תערובת על ג'ל לזיהוי ללא denaturing ולהפעיל את הג'ל על 1.5 h ב- 200 וולט.
   6. דמיינו את הג'ל עם טכניקה תואם עם תיוג מהשלב 6.1.3. (למשל, על-ידי phosphoimaging אם radiolabeling היה מוחל).
   7. לכמת שהבוטות היחסית של הלהקות שהוסטו לדימות עיבוד תוכנית ובכושר עקומה (sigmoidal) על הנתונים באמצעות גרף ותוכנה ניתוח נתונים (טבלה של חומרים). בהתבסס על העקומה מצויד, ערכים (_דK) קבוע דיסוציאציה יכול להיקבע באופן אוטומטי עם התוכנה.

לחקור RNA אינטראקציות מנשר post-transcriptional של csgD, מלכודת וקטור זוגי נבחר: אחד לבטא את csgD mRNA ועוד לבטא את קטן ללא קידוד RNA, McaS. csgD היה משובטים לתוך pBAD33, אשר הוא אראבינוז, inducible פלסמיד בינוני-העתק בהתנגדות כלורמפניקול, McaS היה משובטים לתוך מיני pNDM220 R1, אשר הוא פלסמיד inducible עותק נמוך איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) עם אמפיצילין ההתנגדות. פראי סוג csgD היה PCR מוגבר באמצעות תחל 1A ו- 4A (4A כולל דגל-רצף) להניב PCR המוצר IA, בזמן פראי סוג McaS היה PCR מוגבר באמצעות תחל 1B ו- 4B להניב PCR המוצר ליברות. האסטרטגיה PCR 3-צעד שימש להציג החלפות באזור בסיס בשיוך החזוי של csgD , McaS. ב- שני השלבים הראשונים, מוצרים PCR IIA IIIA היו מסונתז באמצעות תחל 1A + 2A, ו- 3 א + 4A, בהתאמה. בשלב השלישי, PCR המוצר IVA סונתז באמצעות מוצרים PCR IIA IIIA כמו תבנית ו- 1A ו- 4A כמו תחל (איור 2 א). באופן דומה, הוכנסו משלימים מכוון לאתר מוטציות McaS, באמצעות תחל 1B, 2B, 3B, 4B להניב PCR מוצרים IIB, IIIB ב שני השלבים הראשונים ו- IVB בשלב השלישי (איור 2 א). pBAD33 ומוצרים PCR IA ו- IVA היו עם BamHI וגם PstI מתעכל מתעכל IA של IVA היו מאתרים לתוך pBAD33 מעוכל. בונה וכתוצאה מכך נקראו pBAD-csgDהדגל pBAD-csgD63-66FLAG (מוטציה במיקום 63-66 יחסית התחלה גנים ברמת השעתוק באתר). pNDM220 ומוצרים PCR ליברות ו- IVB היו עם AatII ו- BamHI מתעכל מתעכל ליברות ו- IVB היו מאתרים לתוך pNDM220 מעוכל. בונה וכתוצאה מכך נקראו pNDM-mcaS pNDM-mcaS42-45 (מוטציה במיקום 42-45 ביחס התחלה גנים ברמת השעתוק באתר).

כדי assay ההשפעה של מוטציות, זני החיידק מסתירים את pBAD-csgDדגל או pBAD-csgD63-66FLAG , pNDM220, pNDM-mcaS או pNDM-McaS42-45 גדלו במדיום מינימלי M9 בתוספת 0.2% גליצרול למנת יתר 450 של 0.4. ביטוי מ pNDM-הווקטורים הושרה ואז 10 דקות על ידי תוספת של 1 מ מ IPTG ואחריו 5 דקות אינדוקציה של pBAD-הווקטורים על ידי תוספת של 1 מ מ אראבינוז. בשלב זה, דגימות נקטפו, ניתוח תספיג בוצעה עם הדגימות שנקטפו. בעוד הביטוי של פראי סוג McaS מונע תרגום של פראי סוג CsgD, הקדמה של מוטציות בגן CsgD או McaS מקלה על הדיכוי שנצפו. עם זאת, כאשר המושלמים עם מוטציות בדיכוי translational הן CsgD והן McaS של CsgD משוחזר (איור 3; שונה מ-2). לפיכך, הגישה mutational מכוון האתר תומך ההשערה הזאת McaS ו- csgD בסיסי-זוגות-אזור זה.

וקטור pBAD33 נבחר לניסוי ויוו, שימש גם למטרות היכרות עם מוטציה האתר מכוון לחקור מחייב Hfq כדי csgD ה-mRNA במבחנה. האתר מכוון מוטציות הוצגו עם האסטרטגיה PCR 2-צעד ליצירת מוטציה csgD RNAs במבנים ראשי או משני שונה כאשר עיבד. תחל 1 + 2 ג דו-ממדי, 2E, 2F או דור 2 שימשו כדי להגביר ולהציג מוטציות לסוף 5' csgD. המוצרים PCR וכתוצאה מכך (IIC, IID, שקר, IIF ו IIG) שימשו כתבניות עם פריימר 3 להגביר ולהציג מוטציות על כל csgD דנ א (איור 2B). המוצרים PCR וכתוצאה מכך (IIIC, IIID, IIIE, IIIF ו IIIG) היו משובטים לתוך pBAD33, כמתואר לעיל. תעתיקים במבחנה תמללו עם T7 RNA-פולימראז: ראשית, מוצרי ה-PCR היו מסונתז עם תחל 5A, 5C, 5D, 5E, 5F או 5G + 6 באמצעות הווקטורים נבנה כתבנית. המוצרים PCR וכתוצאה מכך שימשו כתבניות T7 RNA-פולימראז. במבחנה עיבד csgD פראי סוג של מוטציה RNAs היו מטוהרים, radiolabeled, מעורבים עם הגדלת ריכוזים של Hfq מטוהרים. התגובות הכלאה לרוץ על מוצקים הלא-denaturing, דמיינו. K מוגברתd-ערכים של אללים mutant מוכיח כי Hfq נקשר פחות ביעילות המוטציות. בנוסף, Hfq יש מספר אתרי קישור על csgD אשר מוצג על ידי המשמרות 3 שנצפו עבור סוג הפרוע RNA. עם זאת, רק 2 אתרי קישור שנצפו החשבונאי שונים RNAs (איור 4; שונה מ-4). לפיכך, הגישה mutational מכוון האתר מזהה ראשי או משני מבני csgD ה-mRNA חשובים עבור איגוד מלאה של Hfq.

יחדיו, זה אפשרי לבצע מוטגנזה בגישה PCR 2 או 3-צעד בשילוב עם מבחני במורד להגיע למסקנות ביולוגי על הכונה רמת post-transcriptional, כמו גם אינטראקציות חלבון-RNA .

טבלה 1: תוכנית ה-PCR

טבלה 2: תגובות מצדו

טבלה 3: תחל המשמשים מוטגנזה סינתזה תבנית T7
מודגש: אנזים הגבלה זיהוי אתרים (BamHI, PstI ו- AatII)
תחתון: מוטציות נוקלאוטיד

איור 1: אסטרטגיה PCR מוטגנזה. א) שלושה צבעי יסוד משמשים את גישת ה-PCR דו-שלבי להציג את האתר מכוון מוטציות אל הגן עניין. תחל 1 ו- 3 מגביר את הגן (PCR מוצר אני), בזמן פריימר 2 מציגה מוטציות ספציפיות (*). פריימר זוגות 1 + 2 מגביר את קטע קטן קצותיו של ה-DNA של עניין לסנתז PCR המוצר II (שלב 1). PCR ובמוצר משמש לאחר מכן פריימר יחד עם פריימר 3 לסנתז PCR המוצר השלישי עם המוטציה באתר של שילב (שלב 2). ב) תחל ארבעה משמשים את גישת ה-PCR 3-צעד כדי להציג את האתר מכוון מוטציות אל הגן עניין. תחל 1 ו- 4 מגביר את הגן (PCR מוצר אני), בזמן תחל 2 ו- 3 מציג מוטציות ספציפיות (*). זוגות פריימר 1 + 2 ו- 3 + 4 משמשים את שני השלבים הראשונים של ה-PCR לסנתז את מוצר ה-PCR II ו- III (שלב 1 & 2). בשלב השלישי, מוצרי ה-PCR II ו- III משמשים כתבנית עם פריימר זוג 1 + 4 לסנתז PCR המוצר הרביעי עם האתר מכוון המוטציה שולבו (שלב 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: מוצרי ה-PCR מוטגנזה. מותני בוצעו עם תחל ותבניות כפי שתוארה בטקסט. מוצרי ה-PCR נוהלו על 2% agarose ג'ל עם אתידיום ברומיד (~ 0.5 µg/mL) עם 1 µg של סולם הדנ א לערבב (טבלה של חומרים). להקות בגודל הנכון מסומנים ריבוע אדום. א) רוב תגובות PCR הלהקה היחידה של הגודל הנכון הוא גלוי. עם זאת, התגובה PCR IVB יש שתי להקות גלוי אשר הלהקה העליון (מעל 300 bp) יש באורך הנכון. כצפוי, הסכום של האורך של מוצרי ה-PCR II ו- IIIC שווה האורך של מוצרי ה-PCR ו- IV (ת csgD PCR מוצרי, מוצרי ה-PCR McaS ב':, i: פראי סוג csgD/McaS מוגבר באמצעות תחל 1A/B + 4A/B, II + השלישי: ביניים מוצרי ה-PCR הוגדל באמצעות תחל 1A/B + 2A/B ו- 3A/B + 4A/B, בהתאמה, הרביעי: מוצר ה-PCR מוטציה מוגבר באמצעות תחל 1A/B + 4A/B עם המוצרים PCR ביניים II ו- III כתבניות). תגובות PCR כל להקה אחת בלבד של הגודל הנכון הוא גלוי. במקרה זה, כמעט כל מולקולות של מוצרי ה-PCR שהשנייה נוספו תגובות PCR השלישי שימשו לסנתז PCR מוצרים השלישי. רק עבור ה-PCR IIIE הוא מוצר ה-PCR שקר גלוי עדיין (IA: פראי סוג csgD PCR מוצר מוגבר באמצעות פריימר 1A + 3A, IIC-g: מוצרי ה-PCR ביניים מוגבר באמצעות פריימר 1A + 2 C-G, IIIC-g: מוטציה PCR מוצרים מוגבר באמצעות פריימר 3A במוצרים PCR IA ו- G IIC כתבניות). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: ניסוי In vivo עם האתר מכוון csgD, מוטציות McaS. תספיג חלבון ניתוח של זנים מחסה הצביעו על וקטורים. זנים היו מבוגרים לשלב מעריכית, המושרה למשך 10 דקות עם 1 מ מ IPTG (McaS) ואחריו אינדוקציה 5 דקות עם אראבינוז 1 מ מ (csgD). Α-דגל נוגדנים שימשו כדי למקד את דגל מתויג CsgD, α-GroEL נוגדנים שימשו למטרה החלבון משק GroEL (מדולל פי 10,000 ו 50,000, בהתאמה). עכבר, ארנב מצומדת HRP נוגדנים שימשו נוגדנים משניים (מדולל 2000 פעמים). איור זה השתנה מ2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4: במבחנה ניסוי עם מוטציות מכוון באתר csgD . EMSA של סוג בטבע ויטרו csgD משועתקים (WT) ו RNAs מוטציה (לוח C-G) ביחס Hfq מחייב. אללים csgD (WT ומוטציה C-G) היו radiolabeled, מעורבב עם 0, 0.25, 0.5, 1 או 2 מיקרומטר monomeric Hfq. הכלאה תגובות נוהלו על ג'לים לזיהוי שאינם denaturing. שהבוטות היחסית של הלהקות שהוסטו הייתה לכמת, עיקול סיגמואיד הורכב על הנתונים. ערכים (Kd) קבוע דיסוציאציה היו נחושים באמצעות SigmaPlot. איור זה השתנה מ-4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

המחברים מצהירים אין אינטרסים מתחרים.