הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מוטגנזה עבור במבחנה, בניסויים Vivo ביטוי עם אינטראקציות RNA ב- Escherichia Coli

20.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/58996

⸱

5 בפברואר 2019

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Southern Denmark

במאמר זה

סיכום

מוטגנזה היא טכניקה המשמשת להציג מוטציות ספציפיות חומצה deoxyribonucleic (DNA). פרוטוקול זה מתאר איך לעשות מוטגנזה בצעד 2, 3-צעד תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) המבוסס על הגישה, אשר חלים על כל מקטע DNA עניין.

תקציר

מוטגנזה היא טכניקה המשמשת להציג ספציפי מוטציות ב- DNA כדי לחקור את האינטראקציה בין מולקולות חומצה ריבונוקלאית (sRNA) קטנות ללא קידוד RNAs שליח היעד (mRNAs). בנוסף, מוטגנזה משמש כדי למפות אתרי קישור ספציפי חלבון ה-RNA. הקדמה PCR המבוסס על שלבים 2 ו- 3-צעד של מוטציות מתואר. הגישה היא רלוונטי כל חלבון-RNA ולימודי אינטראקציה RNA-RNA. בקיצור, השיטה מסתמכת על עיצוב תחל עם mutation(s) הרצויה, 2 או 3. הצעדים של ה-PCR סינתזה של מוצר ה-PCR עם המוטציה. המוצר PCR משמש לאחר מכן לקראת שיבוט. כאן, אנו נתאר כיצד לבצע מוטגנזה עם הגישה 2 - ו 3-צעד שני להציג מוטציות של sRNA, McaS של ה-mRNA, csgD, לחקור RNA-RNA ו- RNA חלבונים. אנו מיישמים את הטכניקה הזו לחקור אינטראקציות RNA; עם זאת, השיטה היא החלים על כל לימודי מוטגנזה מכוונת (למשל, אינטראקציות חלבון-דנ א, חומצה אמינית החלפת/מחיקה/הוספה). ניתן להציג כל סוג של מוטציה חוץ בסיסים הלא טבעי אבל הטכניקה ישימה רק אם מוצר ה-PCR יכול לשמש עבור יישום במורד הזרם (למשל, שיבוט, תבנית נוספת PCR).

מבוא

הדנ א הוא המכונה לעתים קרובות ה-blueprint של תא חי מאז מבני התא מקודדים את רצף ה-DNA שלו. שכפול מדויק מנגנוני תיקון DNA על מנת להבטיח כי רק מאוד נמוכים של מוטציות מתרחשות, שהוא חיוני לקיום פונקציות הנכון של גנים מקודד. שינויים של רצף הדנ א יכול להשפיע על פונקציות רציפות ברמות שונות החל עם ה-DNA (זיהוי על-ידי גורמי שעתוק, אנזימי הגבלה), ואז RNA (זוג בסיסים משלימים את החסר והשינויים מבנה שניוני) ו/או חלבון (אמינו החלפות חומצה, מחיקות, תוספות או מסגרת-משמרות). בעוד מוטציות רבות אינן משפיעות על תפקוד הגן באופן משמעותי, יש מוטציות ב- DNA יכולים להיות השלכות ענקיות. לפיכך, מוטגנזה הוא כלי רב ערך עבור לומד את החשיבות של אתרים DNA ספציפיים בכל הרמות.

פרוטוקול זה מתאר גישה מוטגנזה מכוונת יישוב נוהג להציג מוטציות ספציפיות. הפרוטוקול מסתמכת על שתי אסטרטגיות שונות של ה-PCR: צעד 2 או של PCR 3-צעד. 2-שלב ה-PCR ישימה אם המוטציה הרצוי קרוב בקצה 5' או 3' הסוף של ה-DNA של הריבית (< 200 בסיסי זוגות (bp) מסוף) ואת ה-PCR 3-צעד ישימה בכל המקרים.

בגישה PCR דו-שלבי, תחל 3 מיועדים שבו ערכה אחת של תחל נועד להגביר את ה-DNA של הריבית (primers 1 ו- 3, קדימה, הפוך, בהתאמה), יחיד פריימר נועדה לשלב את המוטציה. המוטציה היכרות עם פריימר (פריימר 2) צריך להיות כיוון הפוך, אם המוטציה קרוב לסוף 5', כיוון קדימה אם המוטציה קרוב בקצה 3'. בשלב הראשון PCR, פריימר 1 + 2 או 3 2 + מגביר קטע קטן קרוב 5' קצה או 3' בסוף, בהתאמה. PCR ובמוצר משמשת פריימר בשלב שתיים עם פריימר 1 או 3, ובעקבותיה במוצר ה-PCR עם מוטציה ב- DNA של עניין (איור 1 א').

ב- PCR 3-צעד, תחל 4 מיועד, שבו ערכה אחת של תחל נועד להגביר את ה-DNA של הריבית (primers 1 ו- 4, קדימה, הפוך, בהתאמה), סט צבעי יסוד אחד נועדה לשלב מוטציות ספציפיות עם חופפים משלימים את החסר (תחל 2 ו- 3, הפוך, קדימה, בהתאמה). בשלב הראשון והשני, תחל 1 + 2 ו- 3 + 4 להגביר בקצה 5' ו 3'. בשלב 3, מוצרי ה-PCR וכתוצאה מכך צעד ראשון, שני משמשים כתבניות ומצויים מוגבר עם תחל 1 + 4. לכן, ובמוצר PCR הוא ה-DNA של עניין עם המוטציה הרצוי (איור 1B).

בעוד ה-DNA מוטציה יכול לשמש עבור כל יישום במורד הזרם, פרוטוקול זה מתאר כיצד לשלב את הדנ א מחדש לתוך השיבוט וקטור. השימוש של שיבוט וקטורים יש מספר יתרונות כגון הקלות של שכפול ויישומים ספציפיים ניסיוני תלוי בתכונות של וקטור. תכונה זו משמשת לעתים קרובות ללימודי אינטראקציה עם ה-RNA. טכניקה נוספת ללימודי אינטראקציה עם ה-RNA היא חיטוט מבנית של הרנ א במתחם עם עוד RNA1,2 או חלבון3,4. עם זאת, חיטוט מבניים מבוצעת רק במבחנה ואילו מוטגנזה ו שיבוט עוקבות לאפשר ללימודי אינטראקציה ויוו.

מוטגנזה בהרחבה שימש לחקר אינטראקציה RNA כפי שהוצג כאן. עם זאת, שיטת המפתח לגבי 2 או 3-צעד PCR החלים על כל פיסת דנ א, ובכך לא רק מוגבל ללימודים RNA-אינטראקציה.

כדי להדגים את הטכניקה ואת השימושים האפשריים שלו, משמש אפיון אזורי חשוב post-transcriptional ויסות mRNA, csgD, של Escherichia coli (e. coli). ב e. coli, csgD מכוון על ידי קטן ללא קידוד RNA, McaS, בשיתוף עם חלבון, Hfq, להדחיק חלבון-ביטוי של4,2,CsgD5. הטכניקה משמשת כדי להציג מוטציות באזור בסיס תיאום בין csgD לבין McaS, לאתר איגוד Hfq של csgD. ה-DNA שהושג לאחר מכן שוכפל לתוך וקטור מתאים לניסויים הבאים יישומים במורד הזרם של הטכניקה כוללים ניסויים במבחנה וגם ויוו. להמחשה, דוגמה 1 מאופיין ויוו שימוש assay תספיג והוא דוגמה 2 מאופיין במבחנה באמצעות assay משמרת של ניידות electrophoretic (EMSA). בשני המקרים, זה מאויר איך מוטגנזה יכול לשמש בשילוב עם טכניקות אחרות כדי להפוך ביולוגי מסקנות לגבי הגן עניין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. וקטור בחירה

  1. לבחור וקטור לבצע ניסויים במורד הזרם. כל וקטור הוא ישים עבור שיטה זו PCR 2 - ו 3-צעד.
  2. בהתבסס על הבחירה של וקטור, לבחור אנזימי הגבלה המתאים עבור שכפול.

2. פריימר עיצוב עבור אתר ביים מוטגנזה מכוונת

  1. להחליט בכל שלב 2 או 3-צעד PCR האסטרטגיה (2-שלב זה רק עבור מוטציות < 200 bp מקצה ה-dna של עניין). עבור PCR דו-שלבי, עבור לשלב 2.2 וללכת על ה-PCR 3-צעד צעד 2.3.
  2. עיצוב צבעי יסוד 2-שלב ה-PCR.
    1. עיצוב פריימר 1 ו- 3 כדי להגביר את ה-DNA של עניין ועם של 5' בולט זה מכיל נוקלאוטידים 4 (למשל, האישיות של או AGCT) ואחריו האתר זיהוי הגבלת הרלוונטי הדרוש לשבט לתוך הווקטור שבחרת.
    2. עיצוב פריימר 2 כדי להציג את mutation(s)-האתר הרצוי ולאגף את המוטציה עם 10-15 נוקלאוטידים משלימים משני הצדדים. הפוך את פריימר אם המוטציה הוא הציג בקצה 5' או להעביר אם המוטציה הוא הציג בקצה 3'.
  3. עיצוב צבעי יסוד 3-צעד PCR.
    1. עיצוב פריימר 1 ו- 4 כדי להגביר את ה-DNA של עניין ועם של 5' בולט זה מכיל נוקלאוטידים 4 (למשל, האישיות של או AGCT) ואחריו האתר זיהוי הגבלת הרלוונטי הדרוש לשבט לתוך הווקטור שבחרת.
    2. עיצוב פריימר 2 ו- 3 כדי להציג את mutation(s) על האתר הרצוי ולאגף את המוטציה על ידי 10-15 נוקלאוטידים משלימים משני הצדדים. פריימר 2 ו- 3 הינם הפוך משלימים.

3. PCR הגברה של פראי סוג דנ א לקראת שיבוט

הערה: לקבלת פרטים אודות ה-PCR, ראה6.

  1. לבצע PCR6 באמצעות תחל 1 + 2 (2-צעד PCR) או 1 + 4 (3-צעד PCR) ולהשתמש פראי סוג DNA כתבנית כדי להשיג PCR מוצר אני השתמש בתוכנית ה-PCR טבלה 1.
  2. אמת PCR על-ידי agarose בג'ל.
    1. להפוך את agarose ג'ל פתרון (2%) על-ידי הוספת 2 גר' agarose לכל 100 מ ל 1 x טריס-אצטט-ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) (טה) המאגר. להמיס את agarose על ידי הרתחה בתנור מיקרוגל. להוסיף מכתים DNA לצבוע אתידיום ברומיד (כדי ריכוז סופי של ~ 0.5 µg/mL) כדי agarose ג'ל פתרון עבור פריט חזותי.
    2. יציקה agarose ג'ל, מניחים אותה יחידת אלקטרופורזה, וטען PCR (מעורבב עם טעינת ה-DNA צבען) ודוגמאות סולם הדנ א של גודל ידוע. לפעול דגימות בהספק של 75 וואט במשך 45 דקות, או עד להקות מופרדים כראוי, ותנסו לדמיין את להקות בשולחן אולטרה סגול (UV) או עם ג'ל מערכת הדמיה.
  3. לטהר את המוצר PCR עם ערכת חילוץ ג'ל (טבלה של חומרים) ומדידת הריכוז של DNA מטוהרים עם ספקטרופוטומטרים (טבלה של חומרים).
  4. חנות ה-DNA מטוהרים ב-20 ° C (במאגר טריס-EDTA (TE) – אחסון לטווח ארוך) או 4 ° C (ב- dH2O – אחסון לטווח קצר) רק בשימוש בשלב 5.

4. PCR להציג את האתר מכוון מוטציות ב- DNA

  1. PCR עבור 2-שלב ה-PCR (ראה שלב 4.2 עבור 3-צעד PCR)
    1. לבצע PCR6 באמצעות תחל 1 + 2 אם מוטציות הם בקצה 5' או 2 + 3 אם מוטציות נמצאים 3' קץ ולהשתמש דנ א פראי סוג כתבנית כדי לקבל מוצר ה-PCR II (ראה טבלה 1 לתוכנית ה-PCR).
    2. אמת PCR על-ידי agarose בג'ל כמו שלב 3.2.1 3.2.2.
    3. לטהר את המוצר PCR עם ערכת חילוץ ג'ל (טבלה של חומרים) ומדידת הריכוז של DNA מטוהרים עם ספקטרופוטומטרים (טבלה של חומרים).
    4. חנות טהור DNA ב-20 ° C (במאגר טה) או 4 ° C (ב- dH2O) רק בשימוש בשלב 5.
    5. לבצע PCR6 באמצעות PCR המוצר השני כמו ומהצמיגים יחד עם פריימר 3 אם מוטציות נמצאים 5' קצה או פריימר 1 אם מוטציות בקצה 3' ושימוש פראי סוג DNA כתבנית כדי לקבל מוצר ה-PCR השלישי (ראה טבלה 1 לתוכנית ה-PCR).
    6. אמת PCR על-ידי agarose בג'ל כמו שלב 3.2.1 3.2.2.
    7. לטהר המוצר PCR עם ערכת חילוץ ג'ל (טבלה של חומרים) ומדידת הריכוז של ה-DNA מטוהרים עם ספקטרופוטומטרים (טבלה של חומרים).
    8. חנות טהור DNA ב-20 ° C (במאגר טה) או 4 ° C (ב- dH2O) עד שלב 5.
  2. PCR עבור 3-צעד PCR
    1. לבצע PCR6 באמצעות תחל 1 + 2 ו- 3 + 4 תגובות נפרדות ולהשתמש פראי סוג DNA כתבנית כדי לקבל מוצר ה-PCR II ו- III (ראה טבלה 1 לתוכנית ה-PCR).
    2. אמת מותני על-ידי agarose בג'ל כמו שלב 3.2.1 3.2.2.
    3. לטהר PCR מוצרים עם ערכת חילוץ ג'ל (טבלה של חומרים) ומדידת הריכוז של DNA מטוהרים עם ספקטרופוטומטרים (טבלה של חומרים).
    4. חנות טהור DNA ב-20 ° C (במאגר טה) או 4 ° C (ב- dH2O).
    5. לבצע PCR6 באמצעות תחל 1 + 4 ולהשתמש נג 2-5 של שני המוצרים PCR II ו- III כתבניות (ב אותה התגובה) כדי להשיג PCR המוצר הרביעי (ראה טבלה 1 לתוכנית ה-PCR).
    6. אמת PCR על-ידי agarose בג'ל כמו שלב 3.2.1 3.2.2.
      הערה: זה לא יוצא דופן לקבל מספר להקות שגוי (לפעמים ניתן להפחית באמצעות תבנית פחות). עם זאת, ניתן להתעלם המוצרים PCR שגוי אם הלהקה בגודל הנכון הוא טוחנות, ג'ל, חילוץ.
    7. אם זה נכון, לטהר את מוצר ה-PCR עם ערכת חילוץ ג'ל (טבלה של חומרים) ומדידת הריכוז של ה-DNA מטוהרים עם ספקטרופוטומטרים (טבלה של חומרים).
    8. חנות טהור DNA ב-20 ° C (במאגר טה) או 4 ° C (ב- dH2O) עד שלב 5.

5. רקומבינציה וסוג הפרוע הגירסאות מוטציה של ה-DNA לתוך הווקטור שבחרת.

הערה: לקבלת פרטים אודות ביצוע השלבים, ראה7.

  1. תקציר מטוהרים PCR מוצרים I ו- III (מ- 2-צעד PCR) ו/או הרביעי (מתוך 3-צעד PCR) באמצעות אנזימי הגבלה הרלוונטיים את.
    1. ב 20 µL 1 x עיכול מאגר עם µL 1 של כל אנזים הגבלה, תקציר 200 ng של מוצר ה-PCR ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30-60 דקות.
  2. לטהר המוצר PCR מתעכל על ידי ג'ל-חילוץ באמצעות ערכת חילוץ ג'ל (טבלה של חומרים), מודדים את ריכוז הדנ א של DNA מטוהרים עם ספקטרופוטומטרים (טבלה של חומרים) ו לאחסן ב-20 ° C (במאגר טה) או 4 ° C (ב- dH2 O) עד המשמש שלב 5.6.
  3. לעכל את וקטור מטוהרים עם אנזימי הגבלה הרלוונטיים ולנהוג עם אלקליין פוספטאז כדי להקטין את וקטור מצדו מחדש אירועים. אל תתייחס PCR מוצרים עם phosphatase אלקליין.
    1. ב- µL 30 1 x עיכול מאגר עם µL 1 של כל אנזים הגבלה, µL 1 של phosphatase אלקליין, תקציר 1,000 ng של וקטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30-60 דקות.
  4. וקטור מתעכל נפרד מ- DNA פסולת (למשל, וקטור נימולים, לגזור את הדנ א) שימוש בג'ל agarose כמו שלב 3.2.1 3.2.2.
  5. לטהר וקטור מתעכל על ידי ג'ל-חילוץ באמצעות ערכת חילוץ ג'ל (טבלה של חומרים), למדוד את ריכוז הדנ א של ה-DNA מטוהרים עם ספקטרופוטומטרים (טבלה של חומרים) ו לאחסן ב-20 ° C (במאגר טה) או 4 ° C (ב- dH2O) עד לשימוש שלב 5.6.
  6. מאתרים ומפסיקים את מוצרי ה-PCR מתעכל לתוך וקטור מתעכל עם תגובות המצוין בטבלה מס ' 2.
  7. דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעתיים או לילה ב-16 ° c
  8. להפוך הנמען זן (למשל, e. coli K12) עם תגובות מצדו.
    1. לגדול עומס יתר600= 0.3-0.5 והעברה 1 מ"ל תרבות כדי צינורות 1.5 mL רבים כמו תגובות ליגאז.
    2. ספין-x 3,500 g עבור 5 דקות ולמחוק את תגובת שיקוע.
    3. Resuspend תאים μL 200 מאגר טרנספורמציה (10 מ"ל של מרק lysogeny (ליברות) עם 0.1 g/mL פוליאתילן גליקול 3350, 5% דימתיל סולפט ו 20 מ מ MgCl2).
    4. הוסף תגובה מצדו, במקום הצינורות על קרח למשך 30 דקות.
    5. מכת חום למשך 2 דקות ב 42 º C.
    6. להוסיף 1 מ"ל של LB הצינורות 1.5 מ ל, וכן לאפשר ביטוי פנוטיפי של עמידות לאנטיביוטיקה לפחות 45 דקות ב 37 º C.
    7. לסובב את התאים ב 3,500 x g למשך 5 דקות, למחוק 1 מ"ל של תגובת שיקוע ולאחר resuspend התאים תגובת שיקוע הנותרים.
    8. צלחת את התאים על צלחות עם אנטיביוטיקה מתאימה, דגירה בין לילה ב 37 º C.
  9. זהה transformants מחסה וקטורים עם האינטגרציה המוצלחת של ה-DNA הוספה (לדוגמה, על ידי ה-PCR באמצעות תחל ספציפיים וקטוריים או הוספה).
  10. לאמת את רצף ה-DNA על ידי סנגר רצף.
    התראה: לא להשתמש תחל את אותו רצף משמש עבור שלב 5.9.

6. שימוש את הווקטורים נבנה עבור ניסויים במבחנה ו/או ויוו

  1. ניסוי in vivo
    הערה: זה דוגמה לשימוש וקטור לבטא פראי סוג מוטציה RNA לאפיין תקנה post-transcriptional. ראו פרטים נוספים על סופג המערבי,8.
    1. גדלים זנים K12 e. coli עם וקטורים נבנה בינוני המתאים, זירוז ביטוי במידת הצורך. דוגמאות הקציר על ידי צנטריפוגה.
    2. הכין דוגמיות נתרן dodecyl סולפט – לזיהוי בג'ל (מרחביות-עמוד) על ידי המסת תא כדורי 1 x מרחביות דוגמת המאגר (62.5 מ"מ טריס-HCl pH 6.8, 2.5% מרחביות, 0.002% bromophenol כחול, β-mercaptoethanol 5%, 10% גליצרול) והרתיחו ב 95 ° C 5 min.
      הערה: זה אפשרי להטיל ג'ל או להשתמש ג'ל precast זמינים מסחרית. האחרון היה בשימוש התוצאות המוצג באיור 3 (טבלה של חומרים).
    3. לטעון 107 תאים של כל מדגם בבארות נפרדים, (כולל סולם חלבון), ולהפעיל ג'ל ב- 200 וולט עד החלבונים מופרדים (כ- 45 דקות).
    4. למחוק את החלבונים על תאית-קרום בהעברה חצי יבש 80 mA לשעה.
    5. לחסום את הקרום עם תערובת של חלבונים (למשל, 5%-אבקת חלב מומס 1 x Tween 20 טריס-באגירה מלוחים (TTBS) מאגר).
    6. מוסיפים נוגדן הראשי (מומס 1 מאגר x TTBS) המטרה החלבון עניין (למשל, ה-GFP-, דגל או חלבון מתויג שלו), תקופת דגירה של h 1 עם עצבנות עדין.
    7. רחץ ממברנה ב 1 x TTBS 10 דקות להסיר את הנוגדנים לא מאוגד. חזור פעמיים יותר.
    8. הוספת נוגדן המשני (מומס 1 מאגר x TTBS) שמכוונת את הנוגדנים הראשי ולאפשר איתור (למשל, חזרת peroxidase (HRP)-מצומדת נוגדנים משניים. תקופת דגירה של h 1 עם עצבנות עדין.
    9. לשטוף את הקרום ב 1 x TTBS 10 דקות להסיר את הנוגדנים לא מאוגד. חזור פעמיים יותר.
    10. המחש את הקרום בעזרת טכניקה תואם הנוגדנים משני (למשל, על-ידי הדמיה לאחר דגירה עם chemiluminescence נגזר הלומינול, אם נוגדנים משניים מצומדת HRP היה בשימוש).
  2. ניסויים במבחנה
    הערה: זוהי דוגמה של שימוש וקטור כתבנית עבור הפריה שעתוק RNA לאפיון אינטראקציות חלבון ה-RNA. ראו פרטים נוספים על EMSA,9.
    1. להפוך תעתיקים במבחנה באמצעות T7 חוץ גופית שעתוק קיט (טבלה של חומרים), וקטורים משלב 5 כתבניות.
    2. נפרדים תעתיקים RNA מאת דף על אוריאה שבעה מ' 4.5% denaturing ג'ל ולאחר לחלץ RNA ישירות מן הג'ל על-ידי אלקטרו • תנאי עם דיאליזה צינורות (טבלה של חומרים).
    3. תווית ה-RNA (למשל, radiolabeling עם γ -32P-ATP באמצעות T4-polynucleotide קינאז (טבלה של חומרים) ולטהר שוב עם עמודות (טבלה של חומרים).
      התראה: לפני עבודה עם חומר רדיואקטיבי, התייעץ עם הקצין בטיחות קרינה מקומית.
    4. מערבבים מתויג-RNA עם ריכוז חלבון נפרד בתגובות 1 x מחייבת מאגר (20 מ מ טריס, pH 8, 100 מ מ אשלגן כלורי, 1 מ MgCl2, dithiothreitol 1 מ מ (DTT)).
      הערה: בתוצאות הציג (איור 4), 2 nM של csgD radiolabeled mRNA היה מעורב עם שיפוע של 0 עד 2 מיקרומטר Hfq חלבון (ריכוז מונומר).
    5. לאפשר חלבון ו- RNA hybridize לפני טעינת הכלאה תערובת על ג'ל לזיהוי ללא denaturing ולהפעיל את הג'ל על 1.5 h ב- 200 וולט.
    6. דמיינו את הג'ל עם טכניקה תואם עם תיוג מהשלב 6.1.3. (למשל, על-ידי phosphoimaging אם radiolabeling היה מוחל).
    7. לכמת שהבוטות היחסית של הלהקות שהוסטו לדימות עיבוד תוכנית ובכושר עקומה (sigmoidal) על הנתונים באמצעות גרף ותוכנה ניתוח נתונים (טבלה של חומרים). בהתבסס על העקומה מצויד, ערכים (דK) קבוע דיסוציאציה יכול להיקבע באופן אוטומטי עם התוכנה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

לחקור RNA אינטראקציות מנשר post-transcriptional של csgD, מלכודת וקטור זוגי נבחר: אחד לבטא את csgD mRNA ועוד לבטא את קטן ללא קידוד RNA, McaS. csgD היה משובטים לתוך pBAD33, אשר הוא אראבינוז, inducible פלסמיד בינוני-העתק בהתנגדות כלורמפניקול, McaS היה משובטים לתוך מיני pNDM220 R1, אשר הוא פלסמיד inducible עותק נמוך איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) עם אמפיצילין ההתנגדות. פראי סוג csgD היה PCR מוגבר באמצעות תחל 1A ו- 4A (4A כולל דגל-רצף) להניב P...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מוטגנזה יש מגוון רחב של יישומים שונים, כאן, התוצאות נציג של ויוו, ניסוי המבחנה נכללו בתור דוגמאות כיצד להפוך את מסקנות ביולוגי בטכניקה. מוטגנזה כבר זמן רב תקן הזהב ללימודי אינטראקציה RNA. כוחה של השיטה טמון השילוב של היכרות עם מוטציות הרלוונטיים עם מבחני במורד הזרם, ניסויים (למשל, תספיג או EMSA) כדי להסיק מסקנות לגבי אתרים DNA ספציפיים וחשיבותן בפונקציות ג'ין-מוצרים שאלה. כאשר אתה מחליט לעשות מוטגנזה, העיצוב של צבעי בסיס צריך להיות תכננה בקפדנות כדי להשיג את המרב של הטכניקה (למשל אילו אתרים להפוך למוטציות); הקפד נמנים המ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים אין אינטרסים מתחרים.

תודות

המחברים רוצה להודות באוניברסיטת דרום דנמרק גישה פתוחה מדיניות מענקים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נוגדן Anti-GroEL המיוצר בארנבMerckG6532נוגדן ראשוני
Azure c200AzureNAGel הדמיית תחנת עבודה
מותאמת אישית DNAoligo MerckVC00021
DeNovix DS-11DeNovixNAספקטרופוטומטר למדידות חומצות גרעין
DNA ג'ל טעינת צבע (6X)Thermo ScientificR0611
תמיסת אתידיום ברומיד 1קארל רוט2218.1
ערכת מיצוי ג'ל GeneJETThermo ScientificK0691
GeneRuler DNA סולם תערובתתסיסהSM0333
Gerard GeBAflex-tube Midi GerardBiotechTO12צינורות דיאליזה לפליטה אלקטרו
MEGAscript T7 ערכת תמלולInvitrogenAM1334
Mini-Sub Cell GT CellBio-Rad1704406מערכת אלקטרופורזה אופקית
נוגדן חד-שבטי ANTI-FLAG M2 המיוצר בעכברMerckF3165נוגדן ראשוני
אימונוגלובולינים של עכברDako CytomationP0447HRP נוגדן משני מצומד
NucleoSpin miRNAMacherey Nagel740971טיהור RNA
NuPAGE 4-12% Bis-Tris ג'לי חלבוןThermo ScientificNP0323BOXBis-Tris ג'לים להפרדת חלבונים
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix עם HF Bufferניו אינגלנד BiolabsM0531SDNA פולימראז
PowerPac HC ספק כוח זרם גבוהBio-Rad1645052
ארנב אימונוגלובוליניםDako CytomationP0448HRP מצומד נוגדן משני
SeaKem LE AgaroseLonza50004
SigmaPlotSystat Software IncNAכלי תוכנה לניתוח גרפים ונתונים
T100 ThermalCycler Bio-Rad1861096 PCR מכונת T4
DNA ligaseניו אינגלנד BiolabsM0202Ligase
T4 פולינוקלאוטיד Kinaseניו אינגלנד BiolabsM0201S
חוצץ TAE (Tris-אצטט-EDTA) (50X)Thermo ScientificB49
%

מקורות

  1. Bouvier, M., et al. Small RNA binding to 5' mRNA coding region inhibits translational initiation. Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).
  2. Jorgensen, M. G., et al. Small regulatory RNAs control the multi-cellular adhesive lifestyle of Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
  3. Antal, M., et al. A small bacterial RNA regulates a putative ABC transporter. The Journal of Biological Chemistry. 280 (9), 7901-7908 (2005).
  4. Andreassen, P. R., et al. sRNA-dependent control of curli biosynthesis in Escherichia coli: McaS directs endonucleolytic cleavage of csgD mRNA. Nucleic Acids Research. , (2018).
  5. Thomason, M. K., et al. A small RNA that regulates motility and biofilm formation in response to changes in nutrient availability in Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
  6. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).
  7. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
  8. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
  9. JoVE Science Education Database. Biochemistry. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA). Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
  10. Kunkel, T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (2), 488-492 (1985).
  11. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
  12. Wells, J. A., Vasser, M., Powers, D. B. Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites. Gene. 34 (2-3), 315-323 (1985).
  13. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  14. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

PCRWestern BlottingEMSADNATE
מוטגנזה עבור במבחנה, בניסויים Vivo ביטוי עם אינטראקציות RNA ב- Escherichia Coli
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.