הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

קיבעון של אנשים חיים Caenorhabditis elegans באמצעות שבב Microfluidic של דקים ועומדים בטמפרטורות Polydimethylsiloxane עם החזקת מים

7.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59008

⸱

19 במרץ 2019

 ,  , 
1Department of Radiation-Applied Biology Research, Takasaki Advanced Radiation Research Institute, National Institutes for Quantum and Radiological Science and Technology (QST-Takasaki)

במאמר זה

סיכום

סדרה של שיטות הנייח הוקם כדי לאפשר את ההקרנות יישוב של חיה Caenorhabditis elegans יחידים באמצעות microfluidic polydimethylsiloxane דקים שפותחו לאחרונה על שבב עם החזקת מים. קיבעון על שבב הרומן הזה מספיקה גם הדמיה תצפיות. טיפול מפורט ודוגמאות ליישום של השבב מוסברים.

תקציר

קרינה נעשה שימוש נרחב עבור יישומים ביולוגיים, לגידול יונים-קרן אור, בין שיטות אלו, microbeam הקרנה ומייצג אמצעי רב עוצמה לזיהוי אתרים רגיש היצורים החיים. מאמר זה מתאר סדרה של קיבעון על שבב שיטות שפותחו עבור ההקרנות microbeam יישוב של אנשים לחיות על פי Caenorhabditis elegans. ראוי לציין, הטיפול של polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic שביבי שפיתחנו קודם לכן על מנת לשתק C. elegans יחידים ללא הצורך עבור הרדמה הסבר מפורט. השבב הזה, המכונה סדין תולעת, הוא גמיש כדי לאפשר את ערוצי microfluidic שיש להרחיב, ומאפשר את האלסטיות בעלי חיים כדי להיות אפוף בעדינות. כמו כן, בשל יכולת ספיחה עצמית של PDMS, חיות לפרטיים הערוצים על ידי כיסוי השטח של הגיליון תולעת עם סרט כיסוי דק, שבו חיות הם לא דחפו לתוך הערוצים עבור מארז. לפנות הכיסוי לצלם מעל, אנו יכולים בקלות לאסוף את החיות. יתר על כן, הגיליון תולעת מראה החזקת מים, מאפשר ליחידים C. elegans יהיה נתון תצפית מיקרוסקופית במשך פרקי זמן ארוכים בתנאים בשידור חי. בנוסף, הגיליון הוא רק עבה, ומאפשר יונים כבדים כגון פחמן יונים לעבור הגיליון תוחמת את החיות, ובכך מאפשר את החלקיקים יון יזוהו והמנה קרינה שימושית כדי למדוד במדויק 300 מיקרומטר. כי מבחר הסרטים מכסה המשמש תוחמת את בעלי החיים חשובה מאד מוצלח הנייח לטווח ארוך, אנו ניצח את מבחר הסרטים כיסוי מתאים, הראה אחד מומלץ בין כמה צילומים. כדוגמה היישום של השבב, הצגנו תצפית הדמיה של פעילויות שרירים של חיות תוחמת את הערוץ microfluidic של הגיליון תולעת, כמו גם את ההקרנות microbeam. דוגמאות אלה מצביעות על הסדינים תולעת הרחיבו מאוד את האפשרויות עבור ניסויים ביולוגיים.

מבוא

קרינה, כולל צילומי רנטגן, קרני גמא קרן כבד-יון, נעשה שימוש נרחב עבור יישומים ביולוגיים כגון אבחון סרטן וטיפול, לגידול יונים-קרן. אינספור מחקרים ופיתוחים טכני מתמקדים כעת ההשפעות של קרינה1,2,3. Microbeam הקרנה הוא אמצעי רב עוצמה לזיהוי אתרים רגיש חי אורגניזמים4. טקסאקי מתקדמת קרינה מחקר מכון של המכונים הלאומיים קוונטית, רדיולוגית למדע וטכנולוגיה (QST-טקסאקי) פיתח טכנולוגיה כדי לעורר תאים בודדים בהסתכלות מיקרוסקופית שימוש כבד-יון microbeams5, והוא ביסס את שיטות להפעלת microbeam יישוב הקרנה של בעלי חיים מספר דגם, כגון תולעים נימיות Caenorhabditis elegans4,6, תולעי המשי7, ו Oryzias latipes (ביפנית medaka)8. Microbeam יישוב הקרנה של נמטודות C. elegans מאפשר את נוקאאוט אפקטיבי של אזורים ספציפיים, כגון הטבעת עצבי באזור הראש, ובכך מסייעת לזהות את התפקידים של מערכות אלה תהליכים כגון גפיים.

פותחה שיטה הנייח על שבב של C. elegans יחידים ללא הצורך בהרדמה כדי לאפשר הקרנה microbeam4. בנוסף, כדי לשפר את שבבי microfluidic המשמשים את המחקר הקודם4, לאחרונה פיתחנו צ'יפס microfluidic polydimethylsiloxane wettable, יון-נחדרת, (PDMS), המכונה התולעת גיליונות (ראה טבלה של חומרים), עבור שיתק C. elegans יחידים9. אלה מהווים של סדינים רכים דקים (עובי = מיקרומטר 300; רוחב = 15 מ מ; אורך = 15 מ מ) עם מספר ערוצים microfluidic ישר (20 או 25) (עומק = מיקרומטר 70; רוחב = מיקרומטר 60 או 50 מיקרומטר; אורך = 8 מ מ) על פני השטח (איור 1י-ם). Microfluidic הערוצים פתוחים ומאפשרים מרובים בעלי חיים כדי להיות מוקף בהם בו זמנית (איור 1E). הסדינים גמישים כדי לאפשר את ערוצי microfluidic שיש להרחיב (על-ידי ~ 10%, איור 1F), ומאפשרת את האלסטיות בעלי חיים כדי להיות אפוף בעדינות. כמו כן, בשל יכולת ספיחה עצמית של PDMS, חיות לפרטיים הערוצים על ידי כיסוי השטח של הגיליון תולעת עם סרט כיסוי דק, שבו חיות הם לא דחפו לתוך הערוצים עבור מארז. לפנות הכיסוי לצלם מעל, אנו יכולים בקלות לאסוף את החיות.

הערוצים אל תפגע התולעים הם להיות מוקפים או כאשר הם נאספו. יתר על כן, המצעים עשויים PDMS, שהוא בעצם הידרופוביות, אבל החזקת מים יכולה להיות מושגת על ידי להקניית hydrophilicity לחומר. השמירה על המים ועל עובי הם מאפיינים חיוביים של הסדינים תולעת. קיבולת המים שימור מונע התייבשות של בעלי החיים לאחר הנייח ממושך ומאפשר תצפיות ארוכות טווח יבוצע.

בנוסף, כפי שתואר לעיל9, המצעים הם רק עבה, ומאפשר יונים כבדים כגון פחמן יונים (עם מגוון של-1 מ מ במים) לעבור הגיליון תוחמת את החיות 300 מיקרומטר. פעולה זו מאפשרת את החלקיקים יון יזוהו והמנה קרינה שימושית כדי למדוד במדויק. יתר על כן, הסדינים תולעת הניתנים לשימוש חוזר, ולפיכך הם חסכוני. בשיטת הזרקת קונבנציונאלי, החיות למכתב לפעמים מתים, הם לא יכול להילקח התעלה; הביצים שלהם יכולים להיסתם גם הערוצים. זה הופך את השבב לא שמיש. צ'יפס, ולכן הם, בעצם חד פעמיים, העלות-תועלת יחס.

בתוך המאמר הנוכחי, נתאר בפירוט סדרה של שיטות הנייח על שבב של C. elegans חיה באמצעות התולעת גליונות יחידים. באמצעות מבחני ומכניקה של בעלי חיים 3 שעות לאחר הנייח על שבב, הערכנו את הסרט כיסוי מתאים. בנוסף, הראנו הדוגמאות של קיבעון על שבב תצפיות הדמיה וגם הקרנה microbeam.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. זנים ותחזוקה

  1. בחר זן מתאים של C. elegans , Escherichia coli (מזון) בהתאם למטרת הניסוי.
    הערה: המאמר הנוכחי, פראי-סוג N210C. elegans (איור 2א) בדרך כלל משמש, ו- HBR4:goeIs3 [pmyo-3::GCamP3.35::unc-54 - 3' utr, unc-119(+)] וי11 הוא מועסק רק הדמיה וזמינותו. E. coli OP50 שימש מזון עבור C. elegans. כמה מוטציות עם צורת גוף נורמלי, כגון המוטציה unc-119(e2498) השלישי בצורת מפותל (איור 2B), גם יכול להיות מוקף בערוצים microfluidic ישר (איור 2C).
  2. לשמר את C. elegans ב- 20 ° C-6 ס מ פטרי המכילות 10 מ"ל של מדיום הגידול נמטודות (NGM) פזורים מודגרות לילה (37 מעלות צלזיוס) e. coli כפי שתואר לעיל10. במידת האפשר, לסנכרן בשלבים התפתחותיים של C. elegans מהבמה העובר.
  3. להשתמש בבעלי חיים למבוגרים מוזן היטב, כ 3-4 ימים לאחר הבקיעה עם רוחב של 50-60 מיקרומטר, אשר מתאימים בצורה אופטימלית לגודל של הערוצים microfluidic בין הסדינים תולעת.

2. מבחר של בופר עבור קיבעון על שבב

  1. עבור גליונות wettable תולעת, להשתמש בכל בופר בהתאם למטרת הניסויים.
    הערה: מתאים מאגר פתרונות עבור קיבעון על שבב-microfluidic PDMS צ'יפס היה שהוגדרו בעבר9 ו מאגר הפתרונות הבאים הוצגו אין השפעה על תנועתיות של בעלי החיים לאחר קיבעון: מאגר הבסיס S פתרון (5.85 g של NaCl, 1 מ"ל של כולסטרול (5 מ"ג/מ"ל אתנול), 50 מ של 1 מ' pH 6.0 אשלגן פוספט, H2O 1 L; מחוטא ע י autoclaving)10 המכיל כמות גדולה של NaCl, M9 בופר פוספט (5 גרם של NaCl , דור 3 של2פו ח'4, 6 גר' Na-2-HPO-4, 1 מ"ל של MgSO 1 מ'4, H2O ל- 1 ליטר; מחוטא ע י autoclaving)10, שטיפת בופר (5 מ של 1 מ' pH 6.0 אשלגן פוספט, 1 מ"ל של 1 מ' CaCl2, 1 מ"ל של 1 מ' MgSO4, ג'לטין pf 0.5 g, H2O 1 L; מחוטא ע י autoclaving)12 המכילה ג'לטין , הנדסה גנטית מים9. המאמר הנוכחי, שטיפת בופר משמשת בדרך כלל, הבסיס S בופר הוא מועסק רק להערכת הנייח על שבב באמצעות כיסוי שונים סרטים בסעיף 3.
  2. עבור שבבי קונבנציונלי microfluidic ללא wettability, השתמש בופר לשטוף, אשר מספק את האמצעי היעיל ביותר של שמירה על לחות בערוצים microfluidic של השבב, ובכך מונעת ייבוש של C. elegans יחידים ( ללא קשר wettability של microfluidic chips).

3. מבחר של הסרט כיסוי מתאים עבור קיבעון על שבב

  1. להכין סרטים כיסוי שונים כמפורט להלן. בהתבסס על הקלות של טיפול, לחתוך הבאות שקוף, מכסה מסתיימים סרטים בגודל מתאים (כלומר, ברוחב של 10-15 מ"מ ואורך של 30-50 מ מ): 130-170 מיקרומטר עבה מכסה זכוכית 125 µm עבה פוליאסטר (PET) ו ~ 130 מיקרומטר עבה פוליסטירן (PS) הסרט.
  2. לבצע הנייח על שבב 3 h באמצעות סרטים כיסוי שונים כמפורט להלן. מבוסס על שלבים 4.1-4.6, הקף ≥ 10 שטף למבוגרים בעלי חיים (3.5 ימים לאחר הבקיעה) בגיליון תולעת באמצעות כיסוי בכל סרט, בהתאמה, ולהשאיר במשך 3 שעות.
  3. לצורך השוואה, לאפשר h 3 התנועה החופשית כדלקמן. ≥ 10 מקום להתרחץ למבוגרים בעלי חיים על צלחת 3.5 ס"מ המכילה 3 מ"ל NGM טריים, מכסים עם מכסה, ולהשאיר במשך 3 שעות.
  4. לאסוף חיות מיד לאחר 3 שעות של קיבעון על שבב על פי שלבים 5.1-5.3. להסיר את הסרט כיסוי מהגיליון תולעת ולהוסיף טיפה של בופר כל בעל חיים. לאסוף חיות שחייה ה-droplet השימוש בבוחר platina ומעבירים אותם אל צלחת 3.5 ס"מ המכילה 3 מ"ל NGM טריים ללא מזון (assay צלחת).
  5. לאסוף חיות לאחר 3 שעות של תנועה חופשית. להוסיף טיפה של בופר כל בעל חיים. לאסוף חיות שחייה ה-droplet על הצלחת NGM ומעבירים אותם אל צלחת assay השימוש בבוחר platina.
  6. להעריך את ההשפעות של הסרט כיסוי על תנועתיות (assay גפיים).
    1. לפחות 5 דקות לאחר העברה לבסיס assay, ספירת ' גוף עיקולים (defined ככל שמספר כפיפות באזור הגוף הקדמי במרווחים של 20-s) באופן ידני תחת מיקרוסקופ13.
    2. לבצע מבחני ומכניקה חמש פעמים באופן עצמאי לסרט כל כיסוי.
      הערה: בניסויים המוצג בתוצאות ייצוגית, בעלי חיים 10 הוערכו עבור ניסוי שבו חיות מרובים היו למכתב בו זמנית, לעומת חיות רק חמש ספרתי את המחקר הקודם13.
    3. לחשב את המספר הממוצע של הגוף מתכופף למען החיות 10 בכל קבוצה עבור ניסוי. אז ממוצע ערכי חמישה ניסויים עצמאית כדי להעריך את effects של קיבעון על שבב. ניתוח נתונים סטטיסטית באמצעות מבחן חד-כיווני השונות (ANOVA) ב בתכנת רמות מובהקות 0.01 ל- 0.05.
      הערה: על סמך ניסויים אלה, סרט כיסוי PS עם חדירות חמצן גבוהה הוערך מתאימים (ראה את התוצאות נציג). סרטים PS אלה כלולים עם הסדינים תולעת. הסרט לחיות מחמד, אשר יש חדירות חמצן נמוך, לא הוערך מתאים כי החיות נטו להיחנק אם מכוסה בו במהלך הנייח לטווח ארוך על הסדינים תולעת. זה גם חשוב כי הסרט כיסוי לא לשבור במהלך סדרה של הליכים; מכסה זכוכית היו ולכן גם אינו מתאים (ראו את התוצאות נציג).

4. על שבב הנייח

הערה: כפפות חד פעמיות, סטרילי לענידה כדי להימנע מזיהום הסדינים תולעת.

  1. הניחו סדין שקוף דק כמו סרט כיסוי PS או זכוכית אשר אין autofluorescence, לשימוש כמו סרט כיסוי תחתון, על גבי השולחן ניסויית או השלב מיקרוסקופיים. הנח גיליון תולעת בעדינות על גבי הסרט המכסה התחתון באמצעות פינצטה שטוח.
    הערה: בנוסף הסדינים תולעת עם ערוצי microfluidic מיקרומטר ברוחב 60 (מתאים למבוגרים 3-4 ימים לאחר הבקיעה), סדינים עם ערוצי מיקרומטר ברוחב 50 (מתאים למבוגרים צעירים 3 ימים לאחר הבקיעה של מוטציות עם גוף קטן בשלב למבוגרים) יכול גם להיות מועסק. בחר גיליון מתאים בהתבסס על הגודל של החיות כדי לשמש.
  2. כדי לאסוף חיות, להרים נפרדות למבוגרים C. elegans מהצלחת תרבות תחת stereomicroscope השימוש בבוחר platina. חזור על התהליך אם חיות מרובות נדרשים.
  3. רחץ חיות להסיר את המזון (חיידקים).
    1. במקום לפחות שלוש טיפות (5 טיפות µL) של בופר על פני השטח של 6 ס מ שאינם מטופלים (דוחה מים) פטרי.
    2. להעביר את החיות droplet השימוש בבוחר platina ולאפשר להם להסיר כל מזון על ידי שחייה. לשטוף אותם פעמיים תוך שתי טיפות נפרדים, ואז לשטוף את בעלי החיים ב- droplet אחר.
      הערה: יש צורך לתרגל בהליך זה כדי שתוכל לבצע זאת במהירות לפני ביצוע ניסוי מדעי.
  4. ירידה 2-3 µL של בופר על פני גיליון תולעת. לאסוף את החיות שטף של ה-droplet על הפטרי ומעבירים אותם אל ה-droplet על הסדין תולעת.
  5. תחום חיות בערוצים microfluidic כדלקמן. מקם סרט כיסוי PS מעל הסדין תולעת באמצעות פינצטה שטוח, לחץ בעדינות על הערוצים מקצה אחד של הגיליון השני כדי לשמור על לחות (כפי שתואר לעיל4,9).
    הערה: בעלי חיים מוקפים באקראי הערוצים. טיפות המכילות חיות מפוזרים על הגיליון תולעת על ידי כיסוי הגיליון, וכתוצאה מכך טיפות להיות מורחב באופן נרחב על פני מספר ערוצים. כל בעל חיים יכול להיות מוקף בכל אחד הערוצים הללו. הנקודה החשובה לגבי השימוש של הגיליון תולעת הנייח על שבב הוא כי ערוצים מרובים זמינים על פני שטח רחב.
  6. מיד לאחר צירוף החיות בערוצים microfluidic, לאשר שהם בחיים על-ידי בדיקת לתנועה של הראש תחת מיקרוסקופ (למשל, 1 x או 2 x הגדלה).
  7. להקליט את המיקום של בעל החיים, במקביל כמו ביצוע שלב 4.6, שים לב לנקודות הבאות על גיליון נייר (1 קובץ משלים) ייעודי: מספר של הערוץ שבו מוקף החיה; המיקום של כל בעל חיים בערוץ (ימין/מרכז/שמאל); וכיוון של הראש.
  8. לצייר החצים כדי לסמן את המיקום של כל בעל חיים בתעלה, עם הכיוון של החץ המתאים לראש של החיה.
    הערה: המספרים ערוץ (למשל, 1, 5, 10, 15, 20, 25) חקוקים על פני השטח של הגיליון תולעת בקרבת קצות ימינה ושמאלה הערוצים microfluidic (איור 1B). מידע זה על הסדין ייעודי מאפשר בעלי חיים כדי להיות ממוקם במהירות, ביצוע התהליך יעיל יותר, ומסייעת גם כדי למנוע דליפה רדיואקטיבית במהלך והשלבים.

5. אוסף של חיות מגיליון תולעת

  1. מיד לאחר הנייח, הסר הסרט שער הגיליון תולעת באמצעות פינצטה שטוח.
  2. זרוק 10-15 µL בופר אל הערוצים microfluidic תוחמת את החיות ולצפות החיות החל לשחות בו טיפות תחת stereomicroscope.
    הערה: בעלי החיים התחילו שחייה ה-droplet חדש משלהם, בלי כל הלחץ הנוסף, עזרה או דחיפה. . ממש כאן מאגר מעליהם הוא מספיק כדי להפוך אותם לשחות התעלה. חיה עשויה להיות מסוגלים לשחות droplet אם זה חיוני נפגע על ידי הקרנה בשלב 7.9 או תהליך הנייח בשלבים 4.2-4.5, למרות שזה נדיר. בנוסף, אם בעל החיים נשאר קשור הסרט כיסוי כאשר הוא מוסר, להוסיף את טיפות על גבי הסרט כיסוי במקום לתוך הערוצים.
  3. לאסוף את החיות שחייה ה-droplet השימוש בבוחר platina ומניחים בצלחת וזמינותו.

6. יישום של תולעת גיליונות הדמיה תצפיות

הערה: תולעת גיליונות יכול להיות בשימוש נרחב תצפיות מיקרוסקופיות. השבב ניתן לשמור על המים, לא משפיעה על תנועתיות של C. elegans בודדים לאחר 3 שעות של קיבעון על שבב9. בנוסף, השבב עצמו יש אין autofluorescence, שהופך אותו מתאים לשימוש פלורסצנטיות מבחני הדמיה. יישום לדוגמה עבור קרינה פלואורסצנטית assay הדמיה היא כדלקמן.

  1. בחרו מיקרוסקופ פלורסצנטיות, הר של המצלמה הדיגיטלית או מצלמת וידאו דיגיטלית בהמיקרוסקופ כדי ללכוד תמונות או קטעי וידאו, בהתאמה (איור 3א).
    הערה: המרחק עובד (WD) של מיקרוסקופ הוא יותר מ- 0.2 מ מ בהתאם מפרט עדשה המטרה (ראה איור 3ב, ג). המפרט של מערכת מיקרוסקופ פלורסצנטיות בשימוש הנייר הזה מוצג בטבלה של חומרים. עם זאת, המפרט אינה מוגבלת בדוגמה שלנו כי זה תלוי מטרת התצפית או / ו משתמשים.
  2. בחר כל זן פלורסנט של C. elegans ולתחזק כמתואר בסעיף 1.
    הערה: אם יש צורך להתבונן להתכווצות שרירי הגוף-קיר (ראה תוצאות נציג), שימוש צעירים למבוגרים HBR411C. elegans, שבו גנים כתב משמש כדי לבטא את מחוון סידן GCaMP3.35 בכל הגוף-קיר תאי שריר. חשוב להשתמש בוגרים צעירים (≤3 ימים לאחר הבקיעה) כי הם דק יותר מאשר הרוחב של הערוצים microfluidic (50-60 מיקרומטר) של הגיליון תולעת. מידת הסיווג קטן אומר כי החיות יכולה לכופף מעט, כך שניתן לצפות את התכווצות השרירים והסיומת במהלך הסריקה, באמצעות מחוון יון סידן.
  3. לבצע את מארז של חיות על פי הנוהל הנייח בסעיף 4.
  4. להתבונן פלורסנט כתמים של בעלי חיים (למשל, ירוק ניאון התווית על-ידי חלבון זנים) באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות, לכידת תמונות באמצעות מצלמה דיגיטלית רכוב על המיקרוסקופ.
    הערה: בצע את השיטות שנקבעו קודם14,15,16, מאז שיטות תצפית במיקרוסקופ (כולל תצפית זריחה), המפרט של מערכת מיקרוסקופ תלוי מטרת התצפית.
  5. תמונה יון סידן גל הפצת באמצעות רכישת וידאו לקיים פעילויות דינמי, כגון התכווצות שרירי הגוף-קיר והסיומת של התולעים HBR4 (1 וידאו).

7. היישום של תולעת גיליונות עבור microbeam הקרנה

הערה: collimating microbeam הקרנה מערכת5 ניתן להשתמש מספר חלקיקים כבדים-יון מואצת של ציקלוטרון שדה azimuthally בדרגות שונות מותקנת על מאיצים יון טקסאקי עבור יישום קרינה מתקדמים (כתר) מתקן של QST-טקסאקי (איור 4א). יש שלב אוטומטי עבור הקרנה תחת היציאה קרן (איור 4B). ההליך עבור כבד-יון microbeam הקרנה של C. elegans באמצעות מערכת זו הוא כדלקמן.

  1. אתר הגליון תולעת צירוף מספר החיות על מסגרת אלומיניום לפי הזמנה עבור המתקן microbeam-הקרנה והגדר אותו על הבמה אוטומטית עבור הקרנה (איור 4C).
  2. להעלות את הדגימה הקרנה (כלומר, בעלי חיים בתוך גיליון תולעת על מסגרת), מיד תחת יציאה (~ 2 מ מ) הקרן בהתבסס על התמונה לצג מ מיקרוסקופ ממוקם מתחת לבמה אוטומטי (איור 4D).
  3. לאחר מיקום אנכי, אתר כל בעל חיים למטרה עם ההקרנות microbeam באמצעות התוכנה בהזמנה אישית עבור יישוב הקרנה של בעלי חיים ותרביות תאים. כדי לאתר כל חיה בתוך התעלה microfluidic, להפנות הגיליון מוקדש המתוארים שלב 4.7 4.8-(ראה 1 קובץ משלים) ואשר את מספר הערוץ סמוך לקצות ימינה ושמאלה של הערוצים.
  4. לשלוט השלב אוטומטית ב- X ו- Y כיוונים כדי למקם את החיות תחת הקורה יציאה באמצעות מערכת שליטה מרחוק ומופעל עכבר לייזר עם התוכנה הקרנה.
  5. בערך המנגינה אזור הקרנה על-ידי צפייה ההקרנה של המיקרוסקופ ממוקם מתחת לבמה אוטומטית של המדגם, הזזת הסמן למיקום הקרנה של החיים ניתן לפלח.
  6. לאחר מיקום מחוספס, יציאה וסגור את חדר הקרנה ולאחר לעבור לחדר הבקרה סמוכים כדי להימנע בין המפעילים.
  7. סט מספר חלקיקים יון עבור הליך הקרנה אחת, המתאימה הקרנה של אזור מסוים של החיה, באמצעות המסוף הרצוי מקושרים למערכת יון-מונה.
    הערה: זה מורכב scintillator פלסטיק מכפיל photoelectron במערכת הקרנה של microbeam collimating.
  8. מחדר הבקרה-הקרנה, לכוונן את המיקום של החיות בהתבסס על התמונה לצג מ המיקרוסקופ ממוקם מתחת לבמה אוטומטי, אשר אותה תמונה מוקרן על המסך בחדר הקרנה (איור 4E).
  9. מקד ההקרנות microbeam על ידי לחיצה על לחצן הקרנה של התוכנה עבור הקרנה.
    הערה: בדוגמה המוצגת באיור 4F, אנו יעד הלוע באזור הראש, להאיר עם מספר מתאים של יונים פחמן microbeam. . כי מספר החלקיקים יון עובר דרך הדגימה נספרת באמצעות המערכת יון-מונה מקושר המסוף, את תוכנת הקרנה, ההקרנות הופסק לאחר הלידה של המספר הרצוי של יון חלקיקים.
  10. כל חיה הוקלט על הגיליון מוקדש לאתר ולבצע הקרנה יישוב על כל בעל חיים. חזור על שלבים 7.8 ו- 7.9 עד כל בעלי החיים הייתה מוקרנת.
  11. מיד לאחר הקרנה, להיכנס לחדר הקרנה ולהוריד את הבמה הקרנה אוטומטית. הסר את הדגימה על המסגרת בהזמנה אישית הממוקמת על במת אוטומטית.
  12. לאסוף את החיות כמתואר בצעדים 5.1-5.3.
  13. לבצע ניתוח התנהגותי ו/או מולקולרית ככל הנדרש כדי להעריך את ההשפעות של ההקרנות יישוב, בהתאם למטרת המחקר.
    הערה: וזמינותו ומכניקה שמתואר בשלב 3.6 היא שיטה יעילה להערכת ההשפעות של הקרנה על תנועתיות4,9.

8. טיפול של תולעת יריעות לשימוש חוזר

הערה: תולעת גליונות ניתן להשתמש שוב ושוב לפחות 10 פעמים9 ללא השפעות שליליות על בעלי החיים אם מנקים את לעקר כהלכה לאחר שימוש כמפורט להלן.

  1. ניקוי
    1. מניחים את הגיליון תולעת בשימוש על 6 ס מ פטרי ושחרר µL כ-100 סטיריליים הנדסה גנטית מים על גבי הגיליון כולו.
    2. ההנעה העטויה בכפפה המים על פני השטח של גיליון באמצעות האצבעות כדי לשטוף לכלוך כגון אבק, חיידקי מזון ביצים הניח בערוצים.
    3. נגב את הלחות מהסדין תולעת ביסודיות באמצעות מגבונים חד פעמיים.
  2. עיקור
    1. להזריק כ 5 מ ל-70% אתנול לתוך הפטרי המכיל את גליון תולעת, ולהכות את פני השטח של הגיליון באמצעות האצבעות בכפפה לשטוף את הלכלוך.
  3. ייבוש
    1. הסר את האסימונים הפטרי מלא 70% אתנול, אפשר להתייבש באופן טבעי.
  4. אחסון
    1. לאחר ייבוש, למקם את הגיליון תולעת על צלחת פטרי סטריליות, לכסות את זה. ניתן גם לאחסן מצעים על צלחת פטרי סטריליות מלא 70% אתנול.
      הערה: עדיף להיפטר הסרטים כיסוי לאחר השימוש, אבל אם הם רוצים להיות שימוש חוזר, לנקות אותם כפי שנעשה עבור הגיליון תולעת. עם זאת, אם מתקפל לפתח על הסרט כיסוי לאחר שימוש זה נישמע יותר לשבב, והתוצאה היא התייבשות של בעלי החיים, ולא ולכן שתחליף אותה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פעילים יחידים C. elegans יכול להיות משותק בהצלחה באמצעות PDMS של דקים, wettable, microfluidic שבב (תולעת גיליון). . חקרנו את ההתאמה של סרטים כיסוי שונים עבור איטום הסדין תולעת, כמתואר בסעיף 3 פרוטוקול כדי להעריך את ההשפעות איטום של הסרטים כיסוי, קבענו על תנועתיות של בעלי חיים 3 שעות לאחר הנייח על שבב באמצעות כיסוי זכוכית (עובי: 130-170 מיקרומטר), הסרט חיית המחמד (עובי: 125 µm), והקולנוע PS (עובי: ~ 130 מיקרומטר), בהתאמה. כמוצג באיור5, היה הבדל משמעות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

קיבעון על שבב של C. elegans בתנאים בשידור חי באמצעות שבב microfluidic PDMS wettable מאפשר את ההקרנות microbeam ממוקד ויעיל של חיות מרובים. הקלות של טיפול ותכונות כדי למנוע התייבשות להפוך מערכת זו מתאים ליישומי לא רק הקרנה microbeam, אלא גם במספר מבחני התנהגות. גליונות תולעת אלה כבר ממוסחר, ניתן להשיג בקלות. שבבי קונבנציונלי microfluidic, כגון צ'יפס חוש הריח, קשורים בבעיות לרבות סתימת חיות וביצים בערוצים microfluidic סגור ולכן קשה לאסוף את החיות, ובכך כזה צ'יפס נטו להיות זניחים, ובכך הגדלת העלות. לעומת זאת, ערוצי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

המחברים תודה ד ר אטסשי Higashitani עצה חיובית לגבי הטיפול של C. elegans , ד"ר הוא נקרא יויה האטורי, Yuichiro יוקוטה Yasuhiko קוביאשי לדיונים יקרי ערך. המחברים תודה המרכז הגנטי Caenorhabditis למתן זנים של C. elegans , e. coli. אנו מודים לצוות של ציקלוטרון של הכתר-QST-טקסאקי על הנדיבה שלהם עם הניסויים הקרנה. אנו מודים ד ר סוזן אביב לעריכה טיוטה של כתב היד הזה. מחקר זה נתמך בחלקה על ידי KAKENHI (גרנט מספרים JP15K11921 ו- JP18K18839) מ- JSPS לטרשת נפוצה

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
C. elegans Wild-type זןCaenorhabditis Genetics Center (CGC), מינסוטה, ארה"בN2זן C. elegans מסוג פרא המשמש בדרך כלל במחקר זה
C. elegans unc-119(e2498) III mutant strainCaenorhabditis Genetics Center (CGC), מינסוטה, ארה"בCB4845זן C. elegans משמש רק כדוגמה למוטציות עם צורת גוף לא תקינה 
C. elegans transgenic strain HBR4Caenorhabditis Genetics Center (CGC), מינסוטה, ארה"בHBR4הגנוטיפ של זן טרנסגני זה C. elegans הוא HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35:: unc-54– 3' utr, unc-119(+)]V. זן זה שימש רק לתצפית הדמיה.
E. coli strainCaenorhabditis Genetics Center (CGC), מינסוטה, ארה"בOP50E. coli זן OP50emE. coli/em המשמש כמזון ל-C. elegans
Worm Sheet IR (50/60)Biocosm, Inc., Hyogo, JapanBCM17-0001שבב מיקרופלואידית עם 25 ישרים 50/60-& ערוצים ברוחב m המשמשים בכל הניסויים והתצפיות במאמר זה 
גיליון תולעת 60Biocosm, Inc., Hyogo, יפןBCM18-0001שבב מיקרופלואידית עם 20 ישרים 60 ומיקרו; ערוצים ברוחב m. זה ניתן לישיבה למבוגרים 3-5 ימים לאחר הבקיעה ב-20 מעלות צלזיוס.
גיליון תולעת 50Biocosm, Inc., היוגו, יפןBCM18-0002שבב מיקרופלואידית עם 20 ישר 50 ומיקרו; ערוצים ברוחב m. זה ניתן לישיבה עבור המבוגרים שלך ~ 3 ימים לאחר הבקיעה ב -20 מעלות צלזיוס.
זכוכית מיקרו כיסוימטסונאמי זכוכית תעשיות בע"מC030401כיסוי זכוכית (עובי: 130-170 ומיקרו; m) משמש במבחני תנועה בפרוטוקול 3
Polystyrene FilmBiocosm, Inc., Hyogo, JapanBCM18-0001/ BCM18-0002פריטים ארוזים של יריעות תולעת. פילים PS (עובי: ~130 ומיקרו; m) בשימוש במבחני תנועה בפרוטוקול 3.
סרט פוליאסטר LumirrorTORAY INDUSTRIES, INC., טוקיו, יפןLumirror T60 (t 125 ומיקרו; מ ')פילים PET (עובי: 125 ומיקרו; m) בשימוש במבחני תנועה בפרוטוקול 3
IWAKI 60 מ"מ/צלחת לא מטופלתAGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, יפן).1010-060צלחת לא מטופלת המשמשת לשילוב של C. elegans בפרוטוקול 1
IWAKI 35 מ"מ/צלחת לא מטופלתAGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, יפן).1010-035צלחת לא מטופלת המשמשת במבחני תנועה בפרוטוקול 3
Milli-QMerck, צרפתמים טהורים
Kimwipe S-200Nippon Paper Crecia Co., Ltd., טוקיו, יפן62020120 מ"מ x 215 מ"מ; 200 גיליונות/קופסה
WormStuff Worm PickGenesee Scientific Corporation, CA, USA)59-AWPPlatina picker המיועד לאיסוף C. elegans
מערכת מיקרוסקופ סטריאו מחקריתOLYMPUS CORPORATION, טוקיו, יפןSZX16מיקרוסקופ שימש בכל הניסויים והתצפיות במאמר זה
מעמד פוקוס ממונע עבור SZX16OLYMPUS CORPORATION, טוקיו, יפןSZX2-ILLBזה שימש לתצפית שדה בהיר בפרוטוקול 3-8.
עדשת אובייקט (וזמנים; 1)תאגיד אולימפוס, טוקיו, יפןSDFPLAPO1 וזמנים; PFNA: 0.15; משקל: 60 מ"מ. השאלה זו שימשה לתצפית שדה בהיר בפרוטוקול 3-8.
עדשת אובייקט (וזמנים; 2)תאגיד אולימפוס, טוקיו, יפןSDFPLAPO2XPFCNA: 0.3; משקל: 20 מ"מ. זה  הלוואות שימשו לתצפיות הדמיה.
מקור אור כספיתOLYMPUS CORPORATION, טוקיו, יפןU-LH100HGספקטרום הפליטה הרחב מאפשר לבצע מגוון ניסויי הדמיה פלואורסצנטיים באמצעות כל הפלואורופורים הנפוצים.
יחידת מסנן פלורסנט SZX16 (ביצועים גבוהים עבור YFP)OLYMPUS CORPORATION, טוקיו, יפןSZX2-FYFPHQEx: 490-500 ננומטר; אמ: 510-560. זה שימש לתצפית הדמיה של זן HBR4.
מצלמה דיגיטלית במהירות גבוהה EXILIMCASIO COMPUTER Co., Ltd, טוקיו, יפןEX-F1 איור 1B, 1E, 1F, איור 2A-C ווידאו 1 הושגו באמצעות מצלמה דיגיטלית זו.
Office 2013Microsoft Co. Ltd, רדמונד, וושינגטון, ארה"בתוכנת EXCEL המשמשת לניתוחים סטטיסטיים
במיוחד

מקורות

  1. Funayama, T., Hamada, N., Sakashita, T., Kobayashi, Y. Heavy-Ion microbeams-development and applications in biological studies. IEEE Transactions on Plasma Science. 36 (4), 1432-1440 (2008).
  2. Tanaka, A., Shikazono, N., Hase, Y. Studies on biological effects of ion beams on lethality, molecular nature of mutation, mutation rate, and spectrum of mutation phenotype for mutation breeding in higher plants. Journal of Radiation Research. 51 (3), 223-233 (2010).
  3. Ghita, M., Fernandez-Palomo, C., Fukunaga, H., Fredericia, P. M., Schettino, G., Bräuer-Krisch, E., Butterworth, K. T., McMahon, S. J., Prise, K. M. Microbeam evolution: from single cell irradiation to pre-clinical studies. International Journal of Radiation Biology. 94 (8), 708-718 (2018).
  4. Suzuki, M., Hattori, Y., Sakashita, T., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. Region-specific irradiation system with heavy-ion microbeam for active individuals of Caenorhabditis elegans. Journal of Radiation Research. 58 (6), 881-886 (2017).
  5. Funayama, T., Wada, S., Yokota, Y., Fukamoto, K., Sakashita, T., Taguchi, M., Kakizaki, T., Hamada, N., Suzuki, M., Furusawa, Y., Watanabe, H., Kiguchi, K., Kobayashi, Y. Heavy-ion microbeam system at JAEA-Takasaki for microbeam biology. Journal of Radiation Research. 49 (1), 71-82 (2008).
  6. Sugimoto, T., Dazai, K., Sakashita, T., Funayama, T., Wada, S., Hamada, N., Kakizaki, T., Kobayashi, Y., Higashitani, A. Cell cycle arrest and apoptosis in Caenorhabditis elegans germline cells following heavy-ion microbeam irradiation. International Journal of Radiation Biology. 82 (1), 31-38 (2006).
  7. Fukamoto, K., Shirai, K., Sakata, T., Sakashita, T., Funayama, T., Hamada, N., Wada, S., Kakizaki, T., Shimura, S., Kobayashi, Y., Kiguchi, K. Development of the irradiation method for the first instar silkworm larvae using locally targeted heavy-ion microbeam. Journal of Radiation Research. 48 (3), 247-253 (2007).
  8. Yasuda, T., Kamahori, M., Nagata, K., Watanabe-Asaka, T., Suzuki, M., Funayama, T., Mitani, H., Oda, S. Abscopal activation of microglia in embryonic fish brain following targeted irradiation with heavy-ion microbeam. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1-15 (2017).
  9. Suzuki, M., Sakashita, T., Hattori, Y., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration. Journal of Neuroscience Methods. 306, Aug 1 32-37 (2018).
  10. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  11. Schwarz, J., Spies, J. P., Bringmann, H. Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus. Worm. 1 (1), 12-14 (2012).
  12. Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans. Experimental Biology. 204, Pt 10 1757-1764 (2001).
  13. Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. C. elegans locomotory rate is modulated by the environment through a dopaminergic pathway and by experience through a serotonergic pathway. Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).
  14. Momma, K., Homma, T., Isaka, R., Sudevan, S., Higashitan, A. Heat-induced calcium leakage causes mitochondrial damage in Caenorhabditis elegans body-wall muscles. Genetics. 206 (4), 1985-1994 (2017).
  15. Kerr, R. A. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. 2, 1-13 (2006).
  16. Aubry, G., Lu, H. A perspective on optical developments in microfluidic platforms for Caenorhabditis elegans research. Biomicrofluidics. 8, 011301(2014).
  17. Lumirror Catalog. TORAY. , Available from: https://www.toray.jp/films/en/products/pdf/lumirror.pdf (2018).
  18. Otobe, K., Itou, K., Mizukubo, T. Micro-moulded substrates for the analysis of structure-dependent behaviour of nematodes. Nematology. 6 (1), 73-77 (2004).
  19. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  20. Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab on a Chip. 7 (11), 1515-1523 (2007).
  21. Lockery, S. R., Lawton, K. J., Doll, J. C., Faumont, S., Coulthard, S. M., Thiele, T. R., Chronis, N., McCormick, K. E., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. Artificial dirt: Microfluidic substrates for nematode neurobiology and behavior. Journal of Neurophysiology. 99 (6), 3136-3143 (2008).
  22. Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 5 (12), 1888-1902 (2010).
  23. Fehlauer, H., Nekimken, A. L., Kim, A. A., Pruitt, B. L., Goodman, M. B., Krieg, M. Using a microfluidics device for mechanical stimulation and high resolution imaging of C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (132), e56530(2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Microbeam
קיבעון של אנשים חיים Caenorhabditis elegans באמצעות שבב Microfluidic של דקים ועומדים בטמפרטורות Polydimethylsiloxane עם החזקת מים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.