Method Article

הפקה של חלקיקים Pseudotyped ללמוד מעוררת פתוגני באווירה אבטחה ברמה 2

DOI:

10.3791/59010

⸱

March 1st, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, College of Veterinary Medicine, Cornell University, 2INRA, Virologie et Immunologie Moléculaires, 3Robert Frederick Smith School of Chemical and Biomolecular Engineering, Cornell University, 4Department of Microbiology, College of Agricultural and Life Sciences, Cornell University, 5Horae Gene Therapy Center, University of Massachusetts Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר חלקיקים pseudotyped באווירה BSL-2 שילוב החלבון ספייק של וירוסים פתוגני במזרח התיכון תסמונת נשימתית, מעוררת סארס. החלקיקים pseudotyped מכילים גנים כתב לוציפראז המאפשר כימות של וירוס הערך לתוך התאים מארח היעד.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול שואפת לייצר חלבון כימרי ספייק (S) הקורונה (זה) חלקיקים pseudotyped עם לוקמיה מאתר וירוס (קמפנילה MLV) לוציפראז והליבה כתב, באמצעות הליך פשוט תקנים של HEK-293T הנפוצה תא קו. ברגע שנוצר ושוחררה מתאי מפיק, אלה pseudovirions לשלב גנים כתב לוציפראז. מאז הם להכיל רק הקורונה heterologous ספייק החלבון על פני השטח, החלקיקים להתנהג כמו מקביליהם הקורונה מקורית על מדרגות הכניסה. בתור שכזה, הם ממלאי מקום מעולה של virions יליד ללמוד נגיפי כניסה לתוך התאים המארחים. על כניסה מוצלחת ולדלקת לתוך תאי היעד, הכתב לוציפראז מקבל משולב לתוך הגנום של התא המארח, בא לידי ביטוי. שימוש assay לוציפראז פשוטה של, תאים transduced ניתן בקלות לכמת. יתרון חשוב של ההליך הוא כי זה ניתן לבצע גם אבטחה ברמה 2 מתקנים (BSL-2) במקום BSL-3 מתקנים הנדרשים לעבודה עם מעוררת פתוגני כגון נגיפי תסמונת נשימתית במזרח התיכון (מרס-זה), סארס הקורונה (הסארס-זה). יתרון נוסף נובע צדדיות שלה כמו זה שניתן להחיל על המעטפה חלבונים השייכים כל שלוש מחלקות של חלבונים ויראלי פיוז'ן, כגון מחלקת לי שפעת hemagglutinin (HA), אבולה וירוס גליקופרוטאין (GP), הווירוס יער II Semliki class E1 חלבון, או את גליקופרוטאין וירוס G class vesicular stomatitis השלישי. מגבלה של המתודולוגיה היא כי זה רק יכול לסכם מדרגות הכניסה וירוס מתווכת על ידי החלבון המעטפה נחקר. לימוד צעדים ויראלי מחזור חיים אחרים, נדרשים בשיטות אחרות. דוגמאות יישומים רבים שהחלקיקים pseudotype יכולים לשמש כוללות חקירה של רגישות התא המארח ו tropism בחינת השפעת וירוס מעכבי כניסה רק לחודש משעולים נגיפי כניסה בשימוש.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ערך התא המארח מהווה השלבים הראשונים של מחזור חיי זיהומיות ויראליות. לאיתור וירוסים מעטפת, זה כרוך איגוד קולטן תא מארח יחיד או מספר רצפטורים, ואחריו פיוז'ן של ממברנות ויראלית ו הסלולר. פונקציות חיוניות אלו מתבצעות על ידי מעטפת נגיפית glycoproteins1,2. גליקופרוטאין המעטפה הקורונה נקראת החלבון ספייק (S), הוא חבר של המעמד אני ויראלי פיוז'ן חלבונים2,3,4,5,6. לומד glycoproteins מעטפת נגיפית חיוני להבנת כמה מאפיינים חשובים של וירוס נתון, כגון: ייזום מחזור החיים, שלה המארח tropism הסלולר, התמסורת בין זנים, פתוגנזה ויראלי, וכן מארח תא כניסה מסלולים. נגיפים pseudotyped, גם בשם pseudovirions, הינם כלים רבי-עוצמה המאפשרים לנו לחקור בקלות את הפונקציה של חלבונים ויראלי פיוז'ן. חלקיקים pseudotyped או pseudovirions הם virions chimeric המורכבים של גרעין נגיפיות הפונדקאית עם חלבון מעטפת נגיפית heterologous על פני השטח שלהם. המטרה העיקרית של הפרוטוקול היא להראות כיצד להשיג הקורונה ספייק חלקיקים pseudotyped מבוססים על ליבה של וירוס (קמפנילה MLV) לוקמיה מאתר ומכילות לוציפראז כתב הגן. כדוגמאות, השיטה כדי לייצר חלקיקים pseudotyped עם החלבונים ספייק של פתוגני סארס (הסארס) ושל המזרח התיכון תסמונת נשימתית (מרס) מעוררת מוצגים. הפרוטוקול מתאר ההליך תרביות תאים מעורב, איך להדביק רגישים היעד תאים, infectivity כמת על ידי לוציפראז וזמינותו.

מאז מדרגות הכניסה של pseudovirions נשלטים על ידי הקורונה S על פני השטח שלהם, הם הזן תאים באופן דומה ליליד עמיתיהם. בתור שכזה, הם המחליפים מעולה של מבחני infectivity תפקודית. חלקיקים pseudotyped נובעים בדרך כלל הורים דגם וירוסים כגון רטרווירוסים (קמפנילה MLV7,8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 ו וירוס הכשל החיסוני lentivirus – HIV23,24,25,26,27,28,29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35) או rhabdoviruses (vesicular stomatitis וירוס — VSV36,39,40,41,42,43,44 , 45 , 46 , 47). כאשר נעשה שימוש ב- pseudotyping, הגנום של וירוסים הורים משתנים כדי להסיר גנים חיוניים, והוציאם פגומים לביצוע מחזור שכפול מלאה. תכונה זו מאפשרת להם להשתמש במתקנים רמת אבטחה ביניים (BSL-2), היא יתרון חשוב על באמצעות וירוסים יליד פתוגני הדורשים מתקני אבטחה גבוהה יותר (BSL-3, BSL-4 אשר אינם זמינים כמו) כאשר ניצוח וירוס ערך מחקרים. . הנה, החלבונים S סיכון לקבץ פתוגנים 3 הסארס-זה שהרובוט-זה משמשים דוגמאות של חלבוני מעטפת נגיפית שולבו קמפנילה MLV חלקיקים pseudotyped, יצירת הסארס-זה S ו- S שהרובוט-זה pseudovirions (הסארס-Spp, שהרובוט-Spp, בהתאמה). Pseudovirions אלה שימשו בהצלחה לימודי התמקדות הזנת אירועים אלה וירוסים48,49,50,51. יתרון נוסף הוא כי בטכניקה המתוארת כאן אינה מוגבלת pseudotyping הקורונה S חלבונים: זה מאוד גמיש, והוא יכול לשמש כדי לשלב נציגים של כל שלוש מחלקות של חלבונים ויראלי פיוז'ן. דוגמאות שפעת hemagglutinin (חה, מחלקה אני)52, אבולה וירוס גליקופרוטאין (GP מחלקה אני), חלבון E1 של אילנה אסטרייך יער Semliki וירוס (SFV, class II), וכן VSV גליקופרוטאין (G, class III)53. בנוסף, אחד או יותר מסוג גליקופרוטאין ויראלי יכול להיות שותף שולבו חלקיק pseudotyped, כמו במקרה של שפעת HA - ונה - חלקיקים pseudotyped51.

בהתבסס על העבודה המבוצעת על-ידי Bartosch et al.20, פרוטוקול זה מתאר את הדור של קמפנילה MLV חלקיקים pseudotyped עם אסטרטגיה תרביות תאים שותף שלוש-פלסמיד שימוש נרחב זמין ומיומן מאוד תרביות תאים-HEK-293T תא קו 54. פלסמיד הראשון מקדדת את הליבה קמפנילה MLV גנים מחסום פה ואת פול פוט אבל חסר הגן env קמפנילה MLV מעטפה. פלסמיד השני הוא וקטור העברה מקודד גחלילית לוציפראז כתב הגן, אות אריזה ענבל-RNA קמפנילה MLV, יחד עם 5'- ואזורים 3'-איגוף קמפנילה MLV מסוף זמן חוזר (משמאל לימין). השלישי פלסמיד מקודד החלבון פיוז'ן מעניינים, במקרה זה גם החלבון הסארס-זה S או S שהרובוט-זה. על תרביות תאים שותף של פלסמידים שלוש באמצעות תגובה כימית תרביות תאים, נגיפי RNA וחלבונים לקבל ביטוי בתוך התאים transfected המאפשר יצירה של חלקיקים pseudotyped. מאז קמפנילה MLV משמש pseudovirion עמוד שדרה, זו מתרחשת ב קרום פלזמה: RNAs המכיל את הכתב ג'ין לוציפראז ושידור אריזה לקבל מקופל לתוך חלקיקים nascent המשלבים גם הביע קרום פלזמה הקורונה ספייק חלבונים. החלקיקים זה באד החוצה מהתאים מכילים חלבון נגיפי S על פני השטח שלהם, נקצרים לשימוש במבחני infectivity. כי חלקיקים pseudotyped הנמל חלבון נגיפי S ולא חלבון מעטפת קמפנילה MLV, כאשר המשמש להדביק תאים, הם מתנהגים כמו מקביליהם הקורונה מקורית על מדרגות הכניסה. לאחר מכן, נגיפי רנ א המכיל הכתב לוציפראז, איגוף LTRs משוחרר בתוך התא ולאפשר הפעילויות פולימראז retroviral שלה שעתוק במהופך לתוך ה-DNA ואינטגרציה לתוך הגנום של התא המארח. כימות infectivity של נגיפים pseudotyped תאים נגועים ואז מתבצע באמצעות assay פעילות לוציפראז פשוטה. כי רצף ה-DNA מקבל משולב לתוך הגנום של התא המארח מכיל רק את הגן לוציפראז ואף אחד הגנים קמפנילה MLV או נגיפי קידוד החלבון, הם מטבעו בטוח יותר לשימוש מאשר שכפול-המוסמכת וירוסים מקורית.

בנוסף להיותו ממלאי מקום בטוח יותר, וישימה מאוד כדי לאפשר שילוב של סוגים שונים של המעטפה glycoproteins, החלקיקים pseudotyped המתוארים כאן הם גם תכליתי מאוד והוא יכול לשמש ללמוד היבטים רבים של וירוס כניסה. זה כולל אך לא מוגבל ל: בדיקת הרגישות התא המארח בנגיף, ניתוח המסלולים כניסה הסלולר משתמש וירוס מעטפת, לומד את ההשפעות של מעכבי תרופתי ו סמים הקרנות, ניצוח ניטרול נוגדן מבחני, אפיון ערך התא המארח של מעטפת וירוסים לא יכול להיות תרבותי, ותפיק וקטורים ויראלי למסירה גן, יציב הסלולר ביטוי של גנים מעניינים, או ג'ין להחרשת.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תא זריעה לייצור חלקיקים Pseudotyped

הערה: לבצע שלב זה אבטחה בארון.

  1. על ידי טכניקות תרבות תא סטנדרטי, להשיג את הבקבוק2 confluent 75 ס מ של 80-90% של תאים HEK-293T/17 passaged ב Dulbecco מלאה של בינוני הנשר ששינה (DMEM-C) המכיל 10% (vol/כרך) העובר סרום שור (FBS), 10 מ מ 4-(2-hydroxyethyl)-1- חומצה piperazineethanesulfonic (HEPES), פניצילין 100 IU/mL ו- 100 סטרפטומיצין µg/mL. היכונו DMEM-T בינוני transfections (הקומפוזיציה שלה היא אותו הדבר כמו DMEM-C אך ללא אנטיביוטיקה).
  2. לשטוף פעמיים תאים עם 10 מ"ל של טרום ומחוממת (37 ° C) Dulbecco פוספט Buffered מלוחים (DPBS).
    הערה: לטפל HEK293T/17 תאים עם טיפול כפי שהם בקלות לנתק.
  3. וארוקן את תגובת שיקוע ולנתק תאים עם 1 מ"ל של 0.25% טריפסין פתרון להתחמם מראש ב- 37 מעלות צלזיוס. מקם את הבקבוקון של תאים ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% חממה של2 CO 3−5 דקות או עד התאים להתחיל ניתוק.
    הערה: הימנע המקננת תאים עם טריפסין עבור יותר מ 5 דקות כמו זה בדרך כלל מוביל תא הצליעה.
  4. לבטל טריפסין על-ידי הוספת 4 מ של DMEM-C בינונית, ספירת תאים באמצעות תא ספירת שקופיות, מיקרוסקופ אור.
    הערה: כדי להימנע מהצורך לספור תאים רבים מדי, צעד דילול נוסף עשוי להידרש מראש. זכור גורם לדילול זו בעת חישוב צפיפות התא בפועל של תאים trypsinized.
  5. לדלל לתאים 5 x 105 תאים למ"ל עם DMEM-סי
  6. זרע תרביות רקמה 6-ובכן צלחת עם 2 מ של התא פתרון לכל טוב, בעדינות להזיז את הצלחת ואחורה, צד לצד לפיזור אחיד של תאים, הימנעות תנועה מעגלית.
    הערה: זהו צעד המפתח. תאים המתפלג יבטיח כי תאים לא נדבקות במרכזו של וולס. בתורו, פעולה זו תבטיח תרביות תאים טובה היעילות ואת החלקיקים pseudotyped הייצור.
  7. דגירה את הצלחת בן לילה (16-18 h) ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 תא תרבות חממה.

2. שלוש-פלסמיד תרביות תאים שותף

הערה: לבצע שלב זה אבטחה בארון.

  1. להתבונן התאים תחת מיקרוסקופ אור הפוך כדי לבדוק התא מורפולוגיה וצפיפות.
    הערה: באופן אידיאלי, צפיפות התא צריך להיות בטווח 40-60% confluency. זה קריטי כי תאים הם גם גם confluent (80−90% confluent) ולא מדי בדלילות מבוזר (20−30% confluent) כל היטב. צפיפות תא של 40−60% confluency יבטיחו ייצור חלקיקים pseudotyped טוב.
  2. פלסמידים לערבב
    1. לחשב את התמהיל פלסמיד עבור כל גליקופרוטאין המעטפה בעקבות כמויות באר אחת של צלחת 6-ובכן שמוצג בטבלה 1. להכפיל כמויות, אם transfecting כמה בארות, כוללים של באר נוספת כדי להימנע ואוזל של תערובת.
      הערה: יחד עם זה הסארס S ו S שהרובוט-זה קידוד פלסמידים, כוללים בקרה הריק וקטור לדור של חלקיקים שליטה שלילי שחסרה glycoproteins מעטפת נגיפית (חלקיקי Δenv) יחד עם גליקופרוטאין בקרה חיובית כמו vesicular stomatitis וירוס (VSV) G גליקופרוטאין הידוע robustly תדביק מגוון רחב מאוד של תאים (VSV-Gpp). פלסמידים הינם זמינים על פי בקשה.
    2. מיקס לחשב כרכים של פלסמידים, מופחת סרום תא תרבות בינוני (ראה טבלה של חומרים) צינור microcentrifuge.
  3. תרביות תאים מבוססת השומנים ריאגנט לערבב (ראה טבלה של חומרים)
    1. לחשב את אמצעי האחסון עבור המיקס ריאגנט תרביות תאים מן הכמויות המוצג בטבלה מס ' 2 עבור באר אחת (1:3 תרביות תאים יחס, להכפיל כמויות לפי הצורך). נמנים בארות נוספות כדי להימנע ואוזל של תרביות תאים ריאגנט מיקס.
    2. מיקס לחשב כרכים של ריאגנט ליפיד המבוסס על תרביות תאים (3 µL לכל טוב), מופחת סרום תא תרבות בינוני (47 µL לכל טוב) צינור microcentrifuge, מקפיד להוסיף הכימית תרביות תאים לתוך המדיום תרבות תא מופחת סרום. אתה לא מסביב.
  4. דגירה שתי תערובות (עבור באר אחת: µL 50 של פלסמידים מערבבים ו- 50 µL של תרביות תאים מבוססת השומנים ריאגנט לערבב) בנפרד עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. להוסיף את התוכן של המיקס ריאגנט תרביות תאים לתערובת פלסמידים ביחס של 1:1 (עבור 1 טוב: µL 50 של כל mix)
  6. לבצע מעלה-מטה יסודית pipetting של המיקס המתקבל.
  7. דגירה המיקס לפחות 20 דקות בטמפרטורת החדר.
  8. האחות המדיום בילה של תאים.
  9. להוסיף בעדינות 1 מ"ל ומחוממת מראש (37 מעלות צלזיוס) מופחת סרום תא תרבות בינוני לכל טוב.
  10. להוסיף dropwise 100 µL של תרביות תאים שילוב כל טוב.
    הערה: תרגיל טיפול בעת הוספת המיקס תרביות תאים בארות HEK-293T כפי שהם לנתק בקלות.
  11. דגירה בתאים 37 ° C, 5% CO2 תא תרבות חממה במשך 4-6 שעות.
  12. להוסיף 1 מ"ל לכל טוב של בינוני DMEM-T ומחוממת מראש (37 מעלות צלזיוס), אשר אינו מכיל אנטיביוטיקה
    הערה: זהו צעד המפתח. תרביות תאים ריאגנטים להגביר תא חדירות ולהגביר את הרגישות לאנטיביוטיקה. כדי להבטיח יעילות טובה תרביות תאים וייצור חלקיקים pseudotyped, חשוב להימנע משימוש בינוני התרבות התא המכיל אנטיביוטיקה
  13. דגירה בתאים 37 ° C, 5% CO2 תא תרבות חממה במשך 48 שעות.

3. אוסף של חלקיקים pseudotyped

הערה: לבצע שלב זה אבטחה בארון.

  1. להתבונן תאים במיקרוסקופ אור הפוך כדי לבדוק מצבו הכללי ומורפולוגיה של התא. לבדוק גם את הצבע של המדיום שאמור להיות אור כתום ורוד/מעט.
    הערה: זהו צעד חשוב. אם יש יותר מדי מוות תאים הקשורים של תרביות תאים או צבע בינוני הפך כתום/צהוב (pH חומצי), בדרך כלל יהיו מזוהה עם תשואות נמוכות בזיהומיות חלקיקים pseudotyped
  2. העברת supernatants של תאים transfected צינורות צנטריפוגה חרוט 50 מ.
  3. צנטריפוגה צינורות ב x 290 גרם במשך 7 דקות להסיר שאריות תאים.
  4. לסנן supernatants שקופה דרך מסנן סטרילי מיקרומטר 0.45 בגודל הנקבובית.
  5. להפוך את אמצעי האחסון קטן aliquots (למשל., µL 500 או 1 מ"ל) של פתרון וירוס pseudotyped cryovials.
  6. חנות ב-80 מעלות צלזיוס.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול פה. Pseudotyped חלקיקים יציבים ב-80 מעלות צלזיוס במשך חודשים רבים אך ברגע הקרת, להימנע מחדש להקפיא אותם כפי שהם יאבדו infectivity

4. pseudotyped חלקיקים זיהום של תאים רגישים

הערה: לבצע שלב זה אבטחה בארון.

  1. תא זריעה של תאים רגישים בצלחת 24-ובכן
    1. לקבל על-ידי תא סטנדרטי תרבות טכניקות 80−90% confluent 75 ס מ2 הבקבוקון של תאים רגישים: ורו-E6 תאים עבור סארס-זה pseudotyped חלקיקים (הסארס-Spp) ותאים מה-7 עבור S שהרובוט-זה pseudotyped חלקיקים (מרס-Spp).
      הערה: כדי לוודא אם החלקיקים pseudotyped כי הופקו הן זיהומיות, חשוב לבחור בקפידה את קו תאים רגישים מתאים עבור מבחני infectivity pseudovirion. באמצעות תאים מתירניות לקוי יוביל infectivity נמוכה.
    2. רחץ תאים פעמיים עם 10 מ"ל של טרום ומחוממת (37 ° C) DPBS.
    3. וארוקן את תגובת שיקוע ולנתק תאים עם 1 מ"ל של 0.25% טריפסין פתרון להתחמם מראש ב- 37 מעלות צלזיוס. מקם את הבקבוקון של תאים ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% חממה של2 CO 3−5 דקות או עד התאים להתחיל ניתוק.
      הערה: הימנע המקננת תאים עם טריפסין במשך יותר מ 5 דקות כמו זה בדרך כלל מוביל תא הצליעה. הא-7 תאים רגישים במיוחד את האפקט הזה.
    4. לבטל טריפסין על-ידי הוספת DMEM-C בינונית, ספירת תאים באמצעות תא ספירת שקופיות, מיקרוסקופ אור.
    5. לדלל לתאים 5 x 105 תאים למ"ל עם DMEM-סי
    6. זרע של 24-באר צלחת עם 0.5 מ של התא פתרון לכל טוב, בעדינות להזיז את הצלחת ואחורה בבארות צד לצד לפיזור אחיד של תאים, הימנעות תנועה מעגלית
      הערה: זהו צעד המפתח. תאים המתפלג יבטיח כי תאים לא נדבקות במרכזו של וולס. בתורו, פעולה זו תבטיח מבחני infectivity טובות. לכל חלקיק pseudotyped (הסארס-Spp, שהרובוט-Spp) או תנאי, משכפל ניסיוני שלושה להכין משלוש בארות. נמנים בארות עבור לבריא (N.I.), חלקיקים Δenv ריק וקטור שליטה חיובית חלקיקים כגון VSV-Gpp
    7. דגירה את הצלחת בן לילה (16−18 h) ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 תא תרבות חממה
  2. זיהום החלקיקים pseudotyped
    1. להתבונן תאים במיקרוסקופ אור ואשר ויזואלית כי יש שטיח confluent של תאים.
    2. להביא cryovials של וירוס pseudotyped להפשיר על קרח.
    3. שטיפת התאים שלוש פעמים עם 0.5 mL מראש חימם (37 ° C) DPBS
      הערה: זהו צעד המפתח. התאים שאינם כראוי לשטוף לפני זיהום להוביל בדרך כלל הקריאות הבאות infectivity המסכן
    4. מחוק לגמרי את supernatants של תאים.
    5. לחסן תאים עם 200 µL של חלקיקים pseudotyped המופשרים פתרון.
    6. דגירה בתאים 37 ° C, 5% CO2 תא תרבות חממה עבור 1−2 h.
    7. הוסף µL 300 של טרום ומחוממת (37 ° C) DMEM-C בינוני.
    8. דגירה בתאים 37 ° C, 5% CO2 תא תרבות חממה במשך 72 h.

5. infectivity כמת על ידי Readout Assay לוציפראז

הערה: ביצוע שלבים התחלתיים אבטחה בארון.

  1. המצע luciferin הפשרה (מאוחסן ב-80 מעלות צלזיוס) ומאגר 5 x לוציפראז assay פירוק (מאוחסן ב-20 ° C) עד שהם מגיעים לטמפרטורת החדר.
  2. לדלל לוציפראז assay פירוק המאגר ל- x 1 במים סטריליים.
  3. האחות supernatants של תאים נגועים חלקיקים pseudotyped.
  4. להוסיף 100 µL x 1 לוציפראז assay פירוק מאגר כל טוב.
  5. מניחים את הצלחת על כיסא נדנדה, תקופת דגירה של 15 דקות עם נדנדה בטמפרטורת החדר (מנקודה זו ואילך שהצלחת יכול להיות מטופלים מחוץ אבטחה הקבינט).
  6. היכונו microcentrifuge צינורות מכל קידוח על-ידי הוספת 20 µL של luciferin המצע כל שפופרת.
  7. הפעל את luminometer.
  8. לבצע מדידה פעילות לוציפראז אחד טוב בכל פעם על ידי העברת 10 µL של lysate שפופרת אחת המכילה 20 µL של luciferin המצע.
  9. קפיצי צינור בעדינות כדי לערבב תוכן, אך להימנע ועקרו מבתיהם את הנוזל על דפנות הצינור.
  10. המקום הצינור התקן, לסגור את המכסה.
  11. למדוד את ערך הפריה חוץ גופית של הצינור באמצעות את luminometer.
  12. שיא המדידה של היחידה קלות יחסית.
  13. חזור על שלבים 5.8-5.12 עד בארות כל מנותחות.
    הערה: עם ציוד מתאים כמו צלחת קריאה luminometer, תהליך זה יכול להתבצע באופן אוטומטי. וזמינותו יהיה צורך ניתן לשנות את התבנית צלחת (למשל תבנית 96-ובכן צלחת של, ).

6. ניתוח נתונים

  1. חישוב, התוויית לוציפראז היחסי היחידות ממוצעים, סטיות תקן
    1. השימוש גרף התוויית תוכנה לחישוב לוציפראז assay מדידה ממוצעים, סטיות תקן של ניסיוני וביולוגית משכפל.
    2. להתוות נתונים כמו תרשים עם סטיות תקן.
      הערה: בעת ביצוע ניתוחים סטטיסטיים על נתונים, הקפד לכלול משכפל ביולוגית לפחות שלוש ערכות נתונים.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נציג תוצאות של מבחני infectivity של הסארס-זה S ו- S שהרובוט-זה חלקיקים pseudotyped מוצגים באיור1. כצפוי, עבור שני איור 1A ו- 1B, ג'י VSV pseudotyped חיובי שליטה חלקיקים (VSV-Gpp) נתן infectivity ממוצע גבוה מאוד ב 106 7 10 לוציפראז יחסית יחידות (RLU) טווח בהתאמה. עבור S הסארס-זה זיהום חלקיקי pseudotyped (איור 1א') של תאים רגישים ורו-E6, infectivity הממוצע חזקה נמדדה ב 9.8 x 104 RLU. ערך זה הוא כמעט 3 סדרי גודל גבוה יותר מאשר הערכים הנמדדים עבור הפקד לבריא (1.1 x 102 RLU), או את החלקיקים Δenv (1.5 x 102 RLU), אשר לא הנמל בכל glycoproteins מעטפת נגיפית על פני השטח שלהם. באופן דומה, עבור S שהרובוט-זה זיהום חלקיקי pseudotyped (איור 1B) של תאים מה-7, infectivity ממוצע גבוה נמדדה ב 1.0 x 106 RLU. . זה כמעט 4 סדרי גודל גבוה יותר מאשר הערכים הנמדדים עבור הפקד לבריא (0.8 x 102 RLU), או את החלקיקים Δenv (2.0 x 102 RLU). וזמינותו infectivity נוספים בוצעה בו הסארס-Spp ואת שהרובוט-Spp היו באופן סדרתי מדולל, נעשה שימוש כדי להדביק תאים ורו-E6 (איור 2א). זה וזמינותו מאשר הפעילות לוציפראז נמדד תלויה ריכוז החלקיקים נעשה שימוש כדי להדביק תאים... כדי לאשר את התפקיד של אנגיוטנסין המרת אנזים 2 (ACE2) ואת peptidase dipeptidyl 4 (DPP4), הקולטנים של הסארס-זה, שהרובוט-זה, בהתאמה, של מתווכים מצורף וכניסה של החלקיקים pseudotyped, השתמשנו גרוע-מתירני תאים HEK-293T, transfected לבטא או ACE2 או DPP4 (איור 2B). התאים transfected שימשו ואז וזמינותו infectivity. ניתוח זה מדגים על ביטוי של ACE2 ושל DPP4, יש עלייה ~ 4-לוג, ~ 2-יומן עבור infectivity הסארס-Spp, שהרובוט-Spp, בהתאמה, המאשר את השימוש קולטן pseudovirions דומה לזה של וירוסים מקורית.

הדוגמאות המוצגות כאן להדגים את חשיבותה של כולל שלילי (לבריא, חלקיקי Δenv) כמו גם תנאי בקרה חיובית (VSV-Gpp) כאשר ייצור חלקיקים pseudotyped. אכן, החלקיקים בקרה חיובית VSV-Gpp מאפשרים לנו להעריך אם אצווה מסוים של חלקיקים pseudotyped הצליחה מניב pseudovirions זיהומיות פונקציונלי. התוצאות הצפויות של טיפוסי זיהום על ידי חלקיקי VSV-Gpp ביותר בתרבית של תאים קווי נמצאים בטווח של 106−107 RLU. בעיות עם תאים המפיקה HEK-293T/17 (מספר מעבר גבוה, בעיות עם צפיפות תא) או יעילות תרביות תאים עניים יכולים להשפיע ייצור חלקיקים pseudotyped הכללית, infectivity. יתר על כן, התנאים שליטה שלילי חשובים גם בכך שהם מאפשרים לנו להעריך את התוכניות הבסיסיות של מדידות RLU בקו לתא מסוים (תנאי לבריא) שאינם ספציפיים הפנמה של חלקיקים (זיהום Δenv) אשר לא מתווך על ידי חלבון מעטפת נגיפית. באופן אידיאלי, עבור סוג מסוים של חלקיקים pseudotyped עם חלבון מעטפת נגיפית של עניין, מומלץ לקבל ערכים שאינם כמה סדרי גודל גבוה יותר ערכי בקרה שלילית, בדומה למוצג באיור 1A, B. עם זאת, אם עבור סוג תא נתון בווירוס pseudotyped נותן מעט מאוד infectivity (קרי, סגור שלילי פקדים כגון איור 2B בתנאים N.T. שאינם transfected) זה לא בהכרח אומר את pseudotyped ייצור החלקיקים היה פגום. זה יכול להיות זה הקו לתא מסוים בשימוש אינו או לקוי מתירניות לזיהום. מומלץ לבדוק אם סוג תא נתון צפוי להיות פגיעים לזיהום על ידי וירוס נחקר. Transfecting לקוי מתירניות תאים עם plasmid(s) לבטא ש-receptor(s) ויראלי יכול לאפשר כניסה ויראלי יעיל יותר ולדלקת להתרחש, כמו באיור איור 2B, שבו על תקנים של רצפטורים ACE2 של DPP4 היעד HEK-293T תאים, יש ~ 4- ו ~ 2-יומן לודיג infectivity, בהתאמה.

פלסמיד/מגיבכמות
pCMV-MLVgagpol קמפנילה MLV איסור פרסום ו pol קידוד פלסמיד300 ng
pTG-לוק וקטור העברה עם הכתב לוציפראז400 ng
וקטור pcDNA-הסארס-S, pcDNA-מרס-S או ריק300 ng
מופחת סרום תא תרבות בינוניכדי 50 µL

טבלה 1: כמויות של פלסמידים מופחת סרום תא בינוני תרבות נדרשים transfect אחד טוב של צלחת 6-ובכן HEK-293T/17 תאים לייצור חלקיקים pseudotyped. מן הריכוז של ההכנות פלסמיד, לחשב את אמצעי האחסון הדרושים כדי להגיע את הכמות הנדרשת של פלסמיד ה-DNA. אם אחד או יותר טוב הוא transfected עם פלסמידים אותו, להכפיל כרכים על ידי המספר הנדרש של בארות כדי transfect, כולל באר נוספת בחישובים כדי להימנע ואוזל של מיקס בשלבים מאוחר יותר. הסכום הכולל של DNA להיות transfected הוא µg 1/טוב. פלסמידים הינם זמינים על פי דרישה למחברים.

מגיבכמות
ריאגנט תרביות תאים3 ΜL
מופחת סרום תא תרבות בינוני47 ΜL

בטבלה 2: כמויות של תרביות תאים ריאגנט מופחת סרום תא בינוני תרבות נדרשים transfect אחד טוב של צלחת 6-ובכן HEK-293T/17 תאים לייצור חלקיקים pseudotyped. הכפל כרכים על ידי המספר הנדרש של בארות transfect ולכלול בארות נוספות בחישובים כדי להימנע ואוזל של מיקס בשלבים מאוחר יותר. תרביות תאים הכימית: יחס דנ א פלסמיד בשימוש הוא 3:1.

figure-results-1
איור 1 : חלקיק נגיפי S-pseudotyped infectivity מבחני בתאי המארח רגישים באמצעות מאתר לוקמיה וירוס (קמפנילה MLV) עמוד השדרה ו לוציפראז כתב גן. (א) S הסארס-זה חלקיקים pseudotyped infectivity assay בתאים ורו-E6. (B) S שהרובוט-זה חלקיקים pseudotyped infectivity assay מה-7 תאים. עבור שניהם (א), (B), הנתונים המותווים תואמת ליחידות לוציפראז היחסי הממוצע של 3 ניסויים עצמאית, קווי שגיאה התואמות סטיית תקן (ש). נתונים מותווים בקנה מידה10 יומן על ציר ה-y. N.I.: לבריא שליטה; Δenv: זיהום עם חלקיקים pseudotyped חסר glycoproteins מעטפת נגיפית, VSV-Gpp: זיהום עם חלקיקים pseudotyped הנושאת בקרה חיובית VSV G המעטפה גליקופרוטאין. קיצור אחר שימוש, הסארס-Spp: זיהום עם S הסארס-זה חלקיקים pseudotyped, שהרובוט-Spp: זיהום עם S שהרובוט-זה חלקיקים pseudotyped. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-2
איור 2 : ריכוז-התלות של זה S-pseudovirion infectivity ואת התפקיד של רצפטורים ACE2 של DPP4 בערך הסארס-Spp, שהרובוט-Spp. (א) ריכוז-התלות של infectivity הסארס-Spp, שהרובוט-Spp נמדדת לוציפראז פעילות וזמינותו. Pseudovirions היו באופן סדרתי מדולל, נעשה שימוש כדי להדביק תאים ורו-E6. Infectivity (B) וזמינותו של הסארס-Spp, שהרובוט-Spp בתאי המטרה HEK-293T לקוי מתירניות transfected כדי ACE2 אקספרס, ו DPP4 רצפטורים, בהתאמה. נתונים מותווים בקנה מידה10 יומן על ציר ה-y כמו באיור 1 מן הניסויים כפולים, עם קווי שגיאה התואמות סטיית תקן (ש). N.T.: תאי בקרה שאינם transfected HEK-293T; ACE2: אנגיוטנסין המרת אנזים 2 (קולטן הסארס-זה) ו DPP4: peptidase dipeptidyl 4 (קולטן שהרובוט-זה). קיצורים אחרים בשימוש הם כמו באיור 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר שיטה לייצר ביעילות pseudotyped חלקיקים הנושאת חלבון S של הסיכון קבוצה 3 מעוררת, הסארס-זה, שהרובוט-זה, באווירה BSL-2. חלקיקים אלה, אשר לשלב גנים כתב לוציפראז, מאפשרים לנו בקלות לכמת נגיפי כניסה בתיווך S אירועים על ידי לוציפראז פשוטה יחסית assay48,49,50,51. מבחני infectivity באמצעות תאים מתירני, אנו אשר כי הפעילות לוציפראז נמדד היא תלויה הריכוז של חלקיקים. בנוסף, תקנים קולטן ACE2 ו DPP4 מאפשר הזנה יעילה יותר בשורות תאים גרוע מתירני, כגון תאים HEK-293T. השיטה לסגלה מאוד glycoproteins מעטפת נגיפית אחרים, נעשה שימוש נרחב48,49,50,51,52,53, 55,56,57,58,59, לעיתים קרובות כדי להשלים את מבחני אחרים כמו ניתוחים ביוכימי או זיהומים וירוס יליד.

פרוטוקול שנתאר כאן מבוסס על הרטרווירוס קמפנילה MLV המשלבת לוציפראז כתב. עם זאת, חשוב להדגיש כי יש מגוון רחב מאוד של מערכות אחרות-pseudotyping אשר בהצלחה פותחו עבור אריזה הקורונה S12,13,25,26, 30 , 31 , 32 ו אחרים מעטפת נגיפית glycoproteins10,11,14,16,17,23,24, 29 , 33 , 38 , 40 , 42 , 44 , 46. חלק מערכות אלה מבוססות על נפוץ קמפנילה MLV הליבה retroviral7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20, או על סמך שימוש נרחב lentiviral HIV-1 המערכת pseudotyping באמצעות אסטרטגיות שונות23,24,25,26,27,28,29,30 ,31,32,33,34,35, או בנגיף כמו כלבת vesicular stomatitis (VSV) כמו הליבה, מה שמאפשר לשלב מגוון רחב של המעטפה glycoproteins, ושוב עם מבחר אסטרטגיות המועסקים37,38,39,40,41,42,43 ,44,45,46,47. בנוסף, עיתונאים נוספים כגון פלורסנט חלבונים כמו GFP11,13 ו- RFP36או אנזימים חוץ לוציפראז כמו β-galactosidase16,17 והוא מופרש אלקליין פוספטאז (SEAP)42 יש כבר מועסקים בהצלחה למדידות. יתר על כן, וזמינותו הוצג פרוטוקול זה, תרביות תאים ארעי שימשה לבטא את קמפנילה MLV ו- S זה גנים, חלבונים. עם זאת, ישנם אחרים אסטרטגיות עבור הביטוי, כגון דור של שורות תאים יציב לייצור של וירוסים pseudotyped7,14. כמו כל המערכות הללו יש יתרונות וחסרונות, חשוב לקחת בחשבון את הפרמטרים החשובים הבאים כאשר מחליטים באיזו מערכת pseudotyping הכי מתאים לצרכים של חוקר: pseudovirion ליבה (קמפנילה MLV, HIV-1, VSV או אחרים), איך סלקטיבי גרעין pseudotyping מסוים נמצא שילוב גליקופרוטאין מעטפת נגיפית ספציפיים, כתב לבדיקה assay (GFP, לוציפראז, SEAP או אחר), האסטרטגיה תרביות תאים (מספר פלסמידים מעורב תרביות תאים משותפת, חולף תקנים או יצירה של שורות תאים יציב).

ישנם מספר צעדים קריטיים בשיטה חשובים להדגיש. צפיפות התאים, במיוחד של הקו תא המפיקה HEK-293T/17 הוא גורם קריטי בביטוח תקנים מוצלחת. צפיפות התאים בטווח של 40-60% confluency נמצא מיטביות. צפיפות גבוהה יותר בדרך כלל לגרום יעילות נמוכה תרביות תאים וייצור חלקיקים נמוכה. כמו כן, חשוב לזכור כי תאים HEK-293T/17 הם חסיד פחות מאשר שורות תאים אחרים. טיפול צריך סדרניות בעת טיפול אותם כדי למנוע ניתוק אותם שלא לצורך. אפשרות אחת היא להתייחס תא תרבות משטחי פלסטיק עם פולי-D-ליזין לשיפור הדבקות. יתר על כן, מעבר לתא גבוה יותר לעתים קרובות התוצאות המחירים תרביות תאים עניים. לאחר הוספת ריאגנט של תרביות תאים לתאים HEK-293T/17, חשוב גם לזכור כי מגביר חדירות תאים. לכן בשלב זה מומלץ להימנע משימוש בינוני המכיל אנטיביוטיקה כפי שהם עשויים להגביר את cytotoxicity. לפני איסוף חלקיקים pseudotyped, בדוק את צבע transfected HEK-293T/17 תא supernatants. בדרך כלל, לאחר 48 שעות של תרביות תאים, צבע בינוני התרבות התא מקבל גוון של כתום-ורוד. בגוון צהוב חום בינוני בדרך כלל מתורגם התשואות חלקיקים pseudotyped המסכנה, היא לעתים קרובות תוצאה של בעיות עם התא זריעה צפיפות או מספר מעבר גבוהה.

ב פרוטוקול זה, ייצור חלקיקים pseudotyped מבוצעת בתבנית צלחת 6-. טוב. כדי להגביר את עוצמת הקול של חלקיקים המיוצר, כמה בארות של צלחת 6-טוב יכול להיות transfected עם המיקס פלסמידים אותו, יכול להיות איחדו את supernatants ביחד. הבריכה ניתן לאחר מכן בהירה, מסוננות ולא aliquoted. לחלופין, לשנות את קנה המידה הפקה עד, סוגים אחרים של כלי (למשל, 25 או 75 ס מ2 מבחנות) יכול לשמש. במקרה זה, תרביות תאים תנאים יותאם בהתאם. ב פרוטוקול זה, וזמינותו infectivity מתבצעת באמצעות תבנית 24-ובכן צלחת וגם luminometer זה רק מאפשר מדידות שפופרת אחת בכל פעם. עבור הקרנות תפוקה גבוהה, תבניות אחרות הינן גם אפשריות, כגון תבנית צלחת 96-ובכן, luminometer קורא על צלחת. ריאגנטים עבור וזמינותו לוציפראז ואמצעי צריכים להתאים בהתאם. אחסון של חלקיקים pseudotyped ב cryovials ב-80 מעלות צלזיוס שומר על היציבות שלהם במשך מספר חודשים ללא ירידה ניכרת infectivity. לא מומלץ לקשר אותם כדי להקפיא-הפשרה מחזורי כפי יפחת infectivity שלהם לאורך זמן. לכן כדאי לאחסן אותם aliquots קטנים כגון 0.5-1 מ ל, להפשיר אותם לפני זיהום.

השיטה המוצגת כאן יש מספר מגבלות. חשובה היא העובדה כי חלקיקים pseudotyped מסכם את הדברים רק נגיפי כניסה לאירועים. כדי לנתח צעדים אחרים במחזור החיים של זיהומיות, נדרשים מבחני אחרים. יתר על כן, כמו חלקיקי קמפנילה MLV באד-קרום פלזמה, חשוב לזכור באמת גליקופרוטאין המעטפה נחקר צריך גם לתנועה כדי קרום פלזמה עבור השתלבות pseudovirions במהלך הייצור. ככזה, חשוב לדעת היכן בתא גליקופרוטאין מעטפת נגיפית מסוים מתבטא בתנאים תרביות תאים, כגון דמיין לוקליזציה subcellular עם וזמינותו immunofluorescence ו/או על-ידי בדיקה עבור השמירה אותות בתוך החלבון. כמו כן, בעוד הפרוטוקול מתאר צעדים כדי לייצר ולבדוק infectivity, זה לא פרט כיצד למדוד השתלבות של מעטפת נגיפית glycoproteins חלקיקים pseudotyped. שיטה אחת היא לבצע מבחני תספיג על פתרונות מרוכזים של חלקיקים, כפי שתואר לעיל50,51 עבור S שהרובוט-זה התאגדות. במבחני האלה, גליקופרוטאין המעטפה S של מרס-זה הוא נחקר יחד עם החלבון capsid (p30) של קמפנילה MLV, אשר מאפשרים לנו לנרמל את השתלבות של החלבון S חלקיקים. דוגמאות נוספות כגון מבחני ניתוח מעטפת נגיפית גליקופרוטאין השתלבות pseudovirions בוצעו עבור S הסארס-זה ההתאגדות בשנת HIV-1 lentiviral pseudovirion מערכת32 , אבולה גליקופרוטאין (GP) בקמפנילה MLV עוד pseudotyped מערכת חלקיקים17, שפעת hemagglutinin (HA), neuraminidase (NA) VSV pseudovirions38. התפתחות באפיון ייצור חלקיקים pseudotyped הוא השימוש של התקני הדמיה חדשניות כגון Nanosight: זה מאפשר לנו ישירות להמחיש לכמת, גודל חלקיקים נגיפיים50. המכשיר מספק מידע מפורט על ייצור חלקיקים הכללית; עם זאת, חשוב לזכור כי זה אינו מספק מידע על המעטפה גליקופרוטאין ההתאגדות. כיוון עתידי עבור היישום של החלקיקים pseudovirion רב-תכליתי זה כדי לנתח אירועים בודדים פיוז'ן ויראלי באמצעות מעקב אחר חלקיק הנע, מיקרופלואידיקה גמורה פלורסצנטיות מיקרוסקופ60,61 ,62. גישות כאלה הוחלו בהצלחה שנגיף שפעת, חלקיקי נגיף הקורונה, כמו גם שפעת HA - ונה-pseudotyped pseudovirions מבוססי VSV63. הפריסה של טכניקות אלה חלה על הקורונה חלקיקים מבוסס-קמפנילה MLV S-pseudotyped כיום מפותח.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנחנו רוצים להודות לכל החברים של מעבדות ויטאקר ודניאל להערות מועיל. מענקי מחקר סופק על ידי NIH מעניקה R21 AI111085 ו R01 AI135270. טי. מאשר תמיכה של המשפחה מדעי החיים לנשיאות ב אוניברסיטת קורנל וב נבחרת המדע קרן מחקר מלגת לימודים לתואר שני תחת גרנט מס DGE-1650441. L.N. מודה תמיכה סמואל ג פלמינג המשפחה המלגה לתואר שני, נבחרת המדע קרן מחקר מלגת לימודים לתואר שני תחת גרנט מס DGE-1650441. עבודה זו נתמכת גם 1504846 קרן המדע הלאומית (כדי ש ו- G.R.W.).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
כליה עוברית אנושית (HEK) HEK-293T/17 תאים ATCCCRL-11268תאי שיבוט 17 מוכשרים מאוד לטרנספקציה.
תאי Vero-E6 אפיתל כליה של קוף ירוק אפריקאיATCCCRL-1586
תאי Huh-7 בכבד אנושי המכונים הלאומיים של יפן לחדשנות ביו-רפואית, בריאות ותזונהJCRB0403
מיקרוסקופ אור הפוך עם 10 & פעמים; אובייקטיבי ניקוןTS100
דולבקו' s שינוי של מדיום הנשר (DMEM) עם 4.5 גרם/ליטר גלוקוז, L-גלוטמין ללא נתרן פירובטCorning Mediatech10-017-CV
סרום בקר עוברי מומת בחום (FBS)Thermo Fisher Scientific, Gibco1614071
1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic acid (HEPES) קורנינג מדיאטק25-060-Cl
100 ופעמים; תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין (PS)קורנינג מדיאטק30-002-Cl
דולבקו' s תמיסת מלח חוצצת פוספט (DPBS) עם Ca2+ ו-Mg2+ Corning Mediatech21-030-CV
0.25% טריפסין, 2.21 מ"מ חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA) 1 & פעמים; תמיסה Corning Mediatech25-053-Cl
שקופיות ספירת תאים עם רשתות Kova87144
Opti-minimal חיוני מדיום (Opti-MEM)Thermo Fisher Scientific, Gibco31985-070
Lipofectamine 2000 מגיב טרנספקציהThermo Fisher Scientific, Invitrogen11668-027
0.45 ומיקרו; מסנן סטרילי בגודל נקבוביות M Pall4184
מזרקים 10 מ"ל BD309604
5 ופעמים; מאגר ליזיס של בדיקת לוציפראז PromegaE1531
לוציפרין, מצע לבדיקת לוציפראזPromegaE1501
מים סטריליים VWRE476-1L
GloMax 20/20 לומינומטר פרומגה2030-100

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dimitrov, D. S. Virus entry: molecular mechanisms and biomedical applications. Nature Reviews Microbiology. 2 (2), 109-122 (2004).
  2. White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. Structures and Mechanisms of Viral Membrane Fusion Proteins: Multiple Variations on a Common Theme. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43 (3), 189-219 (2008).
  3. Bosch, B. J., van der Zee, R., de Haan, C. A. M., Rottier, P. J. M. The Coronavirus Spike Protein Is a Class I Virus Fusion Protein: Structural and Functional Characterization of the Fusion Core Complex. Journal of Virology. 77 (16), 8801-8811 (2003).
  4. Belouzard, S., Millet, J. K., Licitra, B. N., Whittaker, G. R. Mechanisms of Coronavirus Cell Entry Mediated by the Viral Spike Protein. Viruses. 4 (6), 1011-1033 (2012).
  5. Millet, J. K., Whittaker, G. R. Physiological and molecular triggers for SARS-CoV membrane fusion and entry into host cells. Virology. 517, 3-8 (2018).
  6. Millet, J. K., Whittaker, G. R. Host cell proteases: Critical determinants of coronavirus tropism and pathogenesis. Virus Research. 202 (0), 120-134 (2015).
  7. Steidl, S., et al. Coreceptor Switch of [MLV(SIVagm)] Pseudotype Vectors by V3-Loop Exchange. Virology. 300 (2), 205-216 (2002).
  8. Höhne, M., Thaler, S., Dudda, J. C., Groner, B., Schnierle, B. S. Truncation of the Human Immunodeficiency Virus-Type-2 Envelope Glycoprotein Allows Efficient Pseudotyping of Murine Leukemia Virus Retroviral Vector Particles. Virology. 261 (1), 70-78 (1999).
  9. Wang, W., et al. Establishment of retroviral pseudotypes with influenza hemagglutinins from H1, H3, and H5 subtypes for sensitive and specific detection of neutralizing antibodies. Journal of Virological Methods. 153 (2), 111-119 (2008).
  10. Wallerstrom, S., et al. Detection of antibodies against H5 and H7 strains in birds: evaluation of influenza pseudovirus particle neutralization tests. Infection Ecology, Epidemiology. 4, (2014).
  11. Radoshitzky, S. R., et al. Transferrin receptor 1 is a cellular receptor for New World haemorrhagic fever arenaviruses. Nature. 446 (7131), 92-96 (2007).
  12. Han, D. P., Kim, H. G., Kim, Y. B., Poon, L. L., Cho, M. W. Development of a safe neutralization assay for SARS-CoV and characterization of S-glycoprotein. Virology. 326 (1), 140-149 (2004).
  13. Moore, M. J., et al. Retroviruses pseudotyped with the severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein efficiently infect cells expressing angiotensin-converting enzyme 2. Journal of Virology. 78 (19), 10628-10635 (2004).
  14. Sharkey, C. M., North, C. L., Kuhn, R. J., Sanders, D. A. Ross River virus glycoprotein-pseudotyped retroviruses and stable cell lines for their production. Journal of Virology. 75 (6), 2653-2659 (2001).
  15. Bruett, L., Clements, J. E. Functional murine leukemia virus vectors pseudotyped with the visna virus envelope show expanded visna virus cell tropism. Journal of Virology. 75 (23), 11464-11473 (2001).
  16. Ma, M., et al. Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism. Virus Research. 64 (1), 23-32 (1999).
  17. Wool-Lewis, R. J., Bates, P. Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines. Journal of Virology. 72 (4), 3155-3160 (1998).
  18. Op De Beeck, A., et al. Characterization of Functional Hepatitis C Virus Envelope Glycoproteins. Journal of Virology. 78 (6), 2994-3002 (2004).
  19. Calland, N., et al. (-)-Epigallocatechin-3-gallate is a new inhibitor of hepatitis C virus entry. Hepatology. 55 (3), 720-729 (2012).
  20. Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes. Journal of Experimental Medicine. 197 (5), 633-642 (2003).
  21. Giroglou, T., et al. Retroviral vectors pseudotyped with severe acute respiratory syndrome coronavirus S protein. Journal of Virology. 78 (17), 9007-9015 (2004).
  22. Dye, C., Temperton, N., Siddell, S. G. Type I feline coronavirus spike glycoprotein fails to recognize aminopeptidase N as a functional receptor on feline cell lines. Journal of General Virology. 88 (6), 1753-1760 (2007).
  23. Kobinger, G. P., Weiner, D. J., Yu, Q. -C., Wilson, J. M. Filovirus-pseudotyped lentiviral vector can efficiently and stably transduce airway epithelia in vivo. Nature Biotechnology. 19, 225(2001).
  24. Salvador, B., Zhou, Y., Michault, A., Muench, M. O., Simmons, G. Characterization of Chikungunya pseudotyped viruses: Identification of refractory cell lines and demonstration of cellular tropism differences mediated by mutations in E1 glycoprotein. Virology. 393 (1), 33-41 (2009).
  25. Nie, Y., et al. Highly infectious SARS-CoV pseudotyped virus reveals the cell tropism and its correlation with receptor expression. Biochemical and Biophysical Research Communications. 321 (4), 994-1000 (2004).
  26. Grehan, K., Ferrara, F., Temperton, N. An optimised method for the production of MERS-CoV spike expressing viral pseudotypes. MethodsX. 2, 379-384 (2015).
  27. Bakri, Y., et al. The Maturation of Dendritic Cells Results in Postintegration Inhibition of HIV-1 Replication. The Journal of Immunology. 166 (6), 3780-3788 (2001).
  28. Hsu, M., et al. Hepatitis C virus glycoproteins mediate pH-dependent cell entry of pseudotyped retroviral particles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (12), 7271-7276 (2003).
  29. Simmons, G., et al. DC-SIGN and DC-SIGNR Bind Ebola Glycoproteins and Enhance Infection of Macrophages and Endothelial Cells. Virology. 305 (1), 115-123 (2003).
  30. Simmons, G., et al. Inhibitors of cathepsin L prevent severe acute respiratory syndrome coronavirus entry. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (33), 11876-11881 (2005).
  31. Gierer, S., et al. The spike-protein of the emerging betacoronavirus EMC uses a novel coronavirus receptor for entry, can be activated by TMPRSS2 and is targeted by neutralizing antibodies. Journal of Virology. 87 (10), 5502-5511 (2013).
  32. Bertram, S., et al. Cleavage and activation of the SARS-coronavirus spike-protein by human airway trypsin-like protease. Journal of Virology. 85 (24), 13363-13372 (2011).
  33. Bertram, S., et al. TMPRSS2 and TMPRSS4 facilitate trypsin-independent spread of influenza virus in Caco-2 cells. Journal of Virology. 84 (19), 10016-10025 (2010).
  34. Connor, R. I., Chen, B. K., Choe, S., Landau, N. R. Vpr Is Required for Efficient Replication of Human Immunodeficiency Virus Type-1 in Mononuclear Phagocytes. Virology. 206 (2), 935-944 (1995).
  35. Evans, M. J., et al. Claudin-1 is a hepatitis C virus co-receptor required for a late step in entry. Nature. 446 (7137), 801-805 (2007).
  36. Negrete, O. A., et al. EphrinB2 is the entry receptor for Nipah virus, an emergent deadly paramyxovirus. Nature. 436 (7049), 401-405 (2005).
  37. Suda, Y., et al. Analysis of the entry mechanism of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus, using a vesicular stomatitis virus pseudotyping system. Archives of Virology. 161 (6), 1447-1454 (2016).
  38. Zimmer, G., Locher, S., Berger Rentsch, M., Halbherr, S. J. Pseudotyping of vesicular stomatitis virus with the envelope glycoproteins of highly pathogenic avian influenza viruses. Journal of General Virology. 95, Pt 8 1634-1639 (2014).
  39. Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles. Viruses. 8 (9), (2016).
  40. Tong, W., Yin, X. X., Lee, B. J., Li, Y. G. Preparation of vesicular stomatitis virus pseudotype with Chikungunya virus envelope protein. Acta Virologica. 59 (02), 189-193 (2015).
  41. Tani, H., et al. Involvement of ceramide in the propagation of Japanese encephalitis virus. Journal of Virology. 84 (6), 2798-2807 (2010).
  42. Kaku, Y., et al. Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase. Journal of Virological Methods. 179 (1), 226-232 (2012).
  43. Tani, H., et al. Analysis of Lujo virus cell entry using pseudotype vesicular stomatitis virus. Journal of Virology. 88 (13), 7317-7330 (2014).
  44. Ogino, M., et al. Use of Vesicular Stomatitis Virus Pseudotypes Bearing Hantaan or Seoul Virus Envelope Proteins in a Rapid and Safe Neutralization Test. Clinical and Vaccine Immunology. 10 (1), 154-160 (2003).
  45. Logan, N., et al. Efficient generation of vesicular stomatitis virus (VSV)-pseudotypes bearing morbilliviral glycoproteins and their use in quantifying virus neutralising antibodies. Vaccine. 34 (6), 814-822 (2016).
  46. Takada, A., et al. A system for functional analysis of Ebola virus glycoprotein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (26), 14764-14769 (1997).
  47. Whitt, M. A. Generation of VSV pseudotypes using recombinant DeltaG-VSV for studies on virus entry, identification of entry inhibitors, and immune responses to vaccines. Journal of Virological Methods. 169 (2), 365-374 (2010).
  48. Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner. Journal of Molecular Biology. 429 (24), 3875-3892 (2017).
  49. Millet, J. K., et al. Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin. Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).
  50. Millet, J. K., et al. A camel-derived MERS-CoV with a variant spike protein cleavage site and distinct fusion activation properties. Emerging Microbes, Infections. 5 (12), 126(2016).
  51. Millet, J. K., Whittaker, G. R. Host cell entry of Middle East respiratory syndrome coronavirus after two-step, furin-mediated activation of the spike protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (42), 15214-15219 (2014).
  52. Tse, L. V., Hamilton, A. M., Friling, T., Whittaker, G. R. A Novel Activation Mechanism of Avian Influenza Virus H9N2 by Furin. Journal of Virology. 88 (3), 1673-1683 (2014).
  53. Sun, X., Belouzard, S., Whittaker, G. R. Molecular architecture of the bipartite fusion loops of vesicular stomatitis virus glycoprotein G, a class III viral fusion protein. Journal of Biological Chemistry. 283 (10), 6418-6427 (2008).
  54. Millet, J., Whittaker, G. Murine Leukemia Virus (MLV)-based Coronavirus Spike-pseudotyped Particle Production and Infection. Bio-Protocol. 6 (23), 2035(2016).
  55. Bonnin, A., Danneels, A., Dubuisson, J., Goffard, A., Belouzard, S. HCoV-229E spike protein fusion activation by trypsin-like serine proteases is mediated by proteolytic processing in the S2' region. Journal of General Virology. , (2018).
  56. Belouzard, S., Madu, I., Whittaker, G. R. Elastase-mediated activation of the SARS coronavirus spike protein at discrete sites within the S2 domain. Journal of Biological Chemistry. 285 (30), 22758-22763 (2010).
  57. Madu, I. G., Roth, S. L., Belouzard, S., Whittaker, G. R. Characterization of a Highly Conserved Domain within the Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Spike Protein S2 Domain with Characteristics of a Viral Fusion Peptide. Journal of Virology. 83 (15), 7411-7421 (2009).
  58. Madu, I. G., Belouzard, S., Whittaker, G. R. SARS-coronavirus spike S2 domain flanked by cysteine residues C822 and C833 is important for activation of membrane fusion. Virology. 393 (2), 265-271 (2009).
  59. Belouzard, S., Chu, V. C., Whittaker, G. R. Activation of the SARS coronavirus spike protein via sequential proteolytic cleavage at two distinct sites. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (14), 5871-5876 (2009).
  60. Costello, D. A., Millet, J. K., Hsia, C. -Y., Whittaker, G. R., Daniel, S. Single particle assay of coronavirus membrane fusion with proteinaceous receptor-embedded supported bilayers. Biomaterials. 34 (32), 7895-7904 (2013).
  61. Costello, D. A., Hsia, C. -Y., Millet, J. K., Porri, T., Daniel, S. Membrane Fusion-Competent Virus-Like Proteoliposomes and Proteinaceous Supported Bilayers Made Directly from Cell Plasma Membranes. Langmuir. 29 (21), 6409-6419 (2013).
  62. Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Single particle kinetics of influenza virus membrane fusion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (40), 15382-15387 (2008).
  63. Hsu, H. -L., Millet, J. K., Costello, D. A., Whittaker, G. R., Daniel, S. Viral fusion efficacy of specific H3N2 influenza virus reassortant combinations at single-particle level. Scientific reports. 6, 35537(2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Pseudotyped ParticlesViral Entry AssayHEK 293T TransfectionLuciferase ReporterBiosafety Level 2Coronavirus Spike ProteinMurine Leukemia Virus CoreCell Culture ProtocolVirus Infection AssayLuciferase Activity Measurement

Related Articles