הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

תא Fractionation של תאים U937, בהעדר צנטריפוגה במהירות גבוהה

13.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59022

⸱

18 בינואר 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבודד את קרום פלזמה, הציטופלסמה ואת המיטוכונדריה U937 תאים ללא שימוש צנטריפוגה במהירות גבוהה. טכניקה זו ניתן לטהר שברים subcellular הבאים בחינת לוקליזציה חלבון באמצעות immunoblotting.

תקציר

ב פרוטוקול זה אנחנו מפרטים שיטה להשיג שברים subcellular של תאים U937 ללא שימוש ultracentrifugation או בדטרגנטים ללא הבחנה. שיטה זו משתמשת מאגרי היפוטוניק, digitonin, פירוק מכני, צנטריפוגה דיפרנציאלית כדי לבודד את הציטופלסמה, המיטוכונדריה ואת קרום פלזמה. התהליך וניתן לשנותם כדי להתאים את הצרכים של החוקרים, היא פעולה פשוטה וזולה. שיטה זו יאפשר לחוקרים לקבוע לוקליזציה של חלבונים בתאים ללא בדיקות מיוחדות וללא שימוש קיטים מסחריים, אשר שניהם ניתן לחדשו. אנחנו משתמשים בהצלחה זו שיטה להפרדת cytosolic, קרום פלזמה, חלבונים מיטוכונדריאלי בקו התא האנושי מונוציט U937.

מבוא

זיהוי אמין של חלבון לוקליזציה הכרחי לעתים קרובות בעת בחינת מסלולים מולקולריים בתאים האיקריוטים. שיטות להשגת שברים subcellular מנוצלים על ידי חוקרים לבחון מקרוב את מרכיבי התא עניין.

רוב שיטות קיימות fractionation תא בדרך כלל נחלקים לשתי קטגוריות רחבות, המבוסס על אבקת1,2 ומבוסס-ultracentrifugation3,4,5, אשר יכול להיות מובחנת על ידי מהירות, דיוק ועלות. דטרגנט פרוטוקולים מבוסס מסתמכים על השימוש במאגרים עם הגדלת כוח דטרגנט solubilize רכיבים נפרדים של התא. זו היא שיטה מהירה ונוחה לעיבוד דגימות והוא יכול להיות העלות האפקטיבית אם המספר והגודל של דגימות קטנות. ניתן לרכוש ערכות המבוסס על אבקת לבודד cytoplasmic ממברנה/אברון (שבר מעורב), שברים גרעיני תאים. עם זאת, מספר חסרונות הקשורים עם ערכות אלה להגביל את התועלת שלהם לחוקרים. הם נועדו בקלות לבודד את מרכיבי התא אחד או שניים, אך אינם מסוגלים לבודד כל שברים מתוך מדגם בו-זמנית. השימוש של דטרגנטים אומר כי קרום פלזמה של organelles מוקף קרום להיות באותה מידה solubilized ולכן אין אפשרות להיות מופרדים אחד מהשני. סיבוך נוסף נובע הרכיבים קניינית ערכות אלה אשר מונעת חוקרים שינוי התנאים עבור יישומים ספציפיים. לבסוף, הם מוגבלים למספר שימושים, עשוי להיות יקר מדי עבור ניסויים בקנה מידה גדול יותר. ערכות בסיס חומרי שאינם קיימים עבור בידודו של המיטוכונדריה, עם זאת, הם לא נועדו כדי לבודד קרום פלזמה, התשואה מדגם הוא משמעותית פחות מזה של צפיפות צנטריפוגה מבוסס בידוד פרוטוקולים6,7 .

שיטות לנצל ultracentrifugation להשיג שברים הם יותר זמן צריכת, אבל לעתים קרובות התוצאה בחלקים מזוכך יותר ערכות מבוססי דטרגנט. כדי לבודד ממברנות פלזמה מתאי ללא הראשון solubilizing אותם (וכתוצאה מכך זיהום עם קרום organelles) דורש מהם כדי להיות lysed על ידי שיטה ללא חומרי ואחריו ההפרדה של מרכיבי התא באמצעות דיפרנציאל צנטריפוגה — עם בידוד קרום פלזמה הדורשים מהירויות של × 100,000 g כדי להשיג. במקרים רבים, צנטריפוגה דיפרנציאלית חייב להיות במעקב על-ידי isopycnic צפיפות הדרגתיות צנטריפוגה להפרדה נוספת של שברים הסלולר או הסרה של מזהמים. בעוד ששיטות אלה הם יסודי ומשתנות, החסרונות כוללים עלות צריכת זמן, את הצורך ultracentrifuge על הפרדה בין שברים ומספרים נוספים טיהור באמצעות צפיפות הדרגתיות צנטריפוגה. צנטריפוגות במהירות גבוהה ביותר הן בעלות זה אוסרני עבור חוקרים בודדים ולעיתים קרובות משותף, ליבה של ציוד במוסדות אקדמיים. לפיכך, זמינות ultracentrifuge הופך אוסרני במצבים אלה.

ב פרוטוקול fractionation זה נדגים את ניתוקה של שברים subcellular ללא שימוש solubilizing דטרגנטים וללא צנטריפוגה במהירות גבוהה. שיטה זו תאפשר חוקרים לבודד את קרום פלזמה, המיטוכונדריה, cytoplasmic מרכיבי תא האיקריוטים עם זיהום מזערי בין שברים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. מכינים Buffers וראגנטים

הערה: ראה טבלה 1.

  1. להכין פתרונות של מאגר A, פירוק מאגר B, מאגר מדגם digitonin.
    1. להכין מאגר על-ידי הוספת 8.77 g של NaCl ו- 50 מ של HEPES (1 מ', pH 7.4) יונים 900 מל מים, לכוון עוצמת הקול הסופי כדי 1 ליטר עם מים יונים.
      הערה: ריכוזי הסופי הם 150 מ מ NaCl 50 מ מ HEPES.
    2. הכנת מאגר פירוק B על-ידי הוספת 20 מ של HEPES (1 מ', pH 7.4), 0.75 גר' אשלגן כלורי, 0.19 גר' MgCl2, 2 מ ל חומצה Ethylenediaminetetraacetic (0.5 M EDTA), 2 מ של-אתילן גליקול-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-חומצה tetraacetic (0.5 M EGTA) , 38.26 g של מניטול ו- g 23.96 של סוכרוז עד 900 מ"ל של מים יונים, לכוון עוצמת הקול הסופי כדי 1 ליטר מים יונים.
      הערה: ריכוזי הסופי הם 20 מ מ HEPES, 10 מ מ אשלגן כלורי, 2 מ מ MgCl2, 1 מ מ EDTA, 1 מ"מ EGTA, 210 מ מ מניטול וסוכרוז 70 מ"מ.
    3. להכין מאגר לדוגמה על-ידי הוספת 0.01 גר' נתרן גופרתי dodecyl (מרחביות) 10 מ ל תמיסת באגירה טריס (TBS) ריכוז סופי של 0.1% מרחביות.
    4. להכין פתרון מניות של digitonin על-ידי הוספת 25 מ ג של digitonin 100 מ של מים יונים (הריכוז הסופי הוא 250 µg/mL).
    5. אחסן את כל מאגר הפתרונות ב 4 ° C ו digitonin ב-20 ° C עד תחילת הניסוי.
  2. להכין טרי פתרונות של מעכבי פרוטאז, פוספטאז להוסיף מאגר פתרונות לפני תוספת לתאים.
    1. להכין פתרון מניות של פלואוריד phenylmethanesulfonyl (PMSF) על-ידי הוספת 17.4 מ"ג של PMSF 1 מ"ל אתנול 100% (הריכוז הסופי הוא 100 מ מ).
      התראה: ללבוש ציוד מגן מתאים וזהירות פעילות גופנית בעת טיפול PMSF. PMSF הוא מסוכנים אם בולעים אותם מעט מסוכן במקרה של מגע עם העור (גירוי), קשר עין (גירוי) או שאיפה; . זה שמשחית העיניים והעור.
    2. להכין קוקטייל מעכב פרוטאז זמינים מסחרית (100 ×) לפי הוראות היצרן (ראה את הטבלה של חומרים).
    3. להכין פתרון מניות של נתרן orthovanadate (SOV) על-ידי הוספת 92 מ ג SOV 1 מ"ל של מים יונים (הריכוז הסופי הוא 500 מ מ).
      התראה: ללבוש ציוד מגן מתאים, נהג בזהירות בעת הטיפול. SOV הוא מסוכן במקרה של קשר עין (גירוי), בליעה או שאיפה. חשיפת יתר חמורה יכולה לגרום למוות.

2. PBS לשטוף

  1. להתרכז ולשטוף תאים בתוך באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) לפני fractionation.
    1. צנטריפוגה תא ההשעיה במהירות המתאימה ליצירת גלולה. לדוגמה, centrifuge השעיה של תאים U937 ב × 400 g למשך 10 דקות.
    2. הסר את תגובת שיקוע, resuspend תא גלולה ב- PBS בטמפרטורת החדר-ריכוז סופי של 4 × 106 תאים למ"ל, פיפטה בעדינות כדי לשבור את הגושים.
    3. Centrifuge התליה תא ב × 400 g 10 דקות הצניפה תאים.
    4. הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend צנפה תא קר כקרח מאגר A-ריכוז סופי של 2 × 107 תאים למ"ל.
      הערה: כל השלבים הבאים צריך להתבצע ב 4 ° C או על קרח, כל מאגרי צריך להיות טרום מקורר.

3. בידוד חלבון cytosolic

  1. תמצית חלבונים cytosolic על ידי דגירה עם digitonin דטרגנט.
    1. מייד לפני resuspension של תאים (שלב 3.1.3) להוסיף µL 10 מניות PMSF (100 מ מ), 10 µL של מעכבי פרוטאז (100 ×), µL 2 מניות SOV (500 מ מ) ו- µL 100 של digitonin מניות (250 µg/mL) כדי µL 878 מאגר A (ריכוזים הסופי הם 1 מ מ PMSF , 1 × מעכב פרוטאז, 1 מ"מ SOV, digitonin µg/mL 25; לכוון את עוצמת הקול הסופי לפי מספר התאים בשימוש). לשמור את הפתרון על הקרח עד בנוסף תא גלולה.
    2. Centrifuge התליה תא ב × 400 g 10 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע.
    3. Resuspend בגדר תא ב בופר A המכיל מעכבי ו digitonin (להכין בשלב 3.1.1)-ריכוז סופי של 2 × 107 תאים למ"ל, פיפטה בעדינות כדי לשבור את הגושים.
    4. דגירה התליה תא על מסובב מעל קצה--4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
    5. Centrifuge התליה תא ב × 400 g עבור 10 דקות לאסוף את תגובת שיקוע ומניחים אותו בתוך שפופרת צנטרפוגה נקי.
    6. Centrifuge את תגובת שיקוע שנאספו ב × 18,000 g למשך 20 דקות הצניפה פסולת הסלולר.
    7. להעביר את תגובת שיקוע שפופרת צנטרפוגה נקי.
    8. חזור על שלבים ו 3.1.5 3.1.6 עד אין גלולה מתקבל לאחר צנטריפוגה.
    9. לאסוף את תגובת שיקוע המכיל חלבונים cytosolic ואחסן אותו ב 4 ° C (תקופות קצרות) או-20 ° C (לטווח ארוך).
  2. להסיר את עודף digitonin, חלבונים cytosolic על ידי צנטריפוגה.
    1. Resuspend בגדר תא digitonin-permeabilized (מתוך שלב 3.1.5) במאגר A-ריכוז סופי של 4 × 106 תאים למ"ל, פיפטה בעדינות כדי לשבור את הגושים.
    2. Centrifuge התליה תא digitonin-permeabilized ב × 400 g 10 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע.
      הערה: ניתן לבצע חוזרות שוטף במאגר A כדי להסיר עודפי מזהמים cytosolic.

4. תא המגון

  1. דגירה התאים על הקרח במאגר פירוק B ואת lyse אותם באמצעים מכניים.
    1. מייד לפני resuspension של תאים (שלב 4.1.2) להוסיף µL 10 מניות PMSF (100 מ מ) µL 2 מניות SOV (500 מ מ) µL 988 פירוק מאגר B (ריכוזים הסופי הם 1 מ PMSF ו 1 מ"מ SOV; להתאים את עוצמת הקול הסופי כדי להכיל את מספר התאים להיות lysed) ולשמור על solu tion על הקרח עד בנוסף תא גלולה.
    2. Resuspend בגדר תא (מתוך שלב 3.2.2) תוך קר כקרח פירוק B בופר המכילה PMSF ו SOV (להכין בשלב 4.1.1)-ריכוז סופי של 4 × 106 תאים למ"ל.
    3. דגירה התליה תא על קרח למשך 30 דקות.
    4. להעביר את המתלים תא מהמגן דאונס טרום מקורר (עם B ההדוקות כבעלי) על הקרח ולבצע עובר 40 עם איחדו מהמגן בתנועות איטיות, משיחות אפילו.
      הערה: לחלופין לנצל אמצעים אחרים של פירוק מכני תא כמפורט בסעיף הדיון.
    5. לאסוף את homogenate, להעביר אותו שפופרת צנטרפוגה נקי.
    6. לשטוף מהמגן איחדו את התחתית עם נפח קטן (1-2 מ ל) של פירוק מאגר B ולהוסיף אותו homogenate.
    7. Centrifuge את homogenate × 400 גרם (או את המהירות המינימלי הנדרש כדי הצניפה תאים רצופה) למשך 10 דקות.
    8. להעביר את תגובת שיקוע שפופרת צנטרפוגה נקי.
      הערה: אם גלולה משמעותי נותר חזור על שלבים 4.1.4 דרך 4.1.6 להגברת שברים כמו מפורט במקטע דיון. ניתן להשהות את הפרוטוקול פה, homogenate השמורים ב 4 ° C לטווח קצר (24 שעות).

5. צנטריפוגה דיפרנציאלית

  1. Centrifuge את homogenate בהגברת מהירויות להסרת פסולת הסלולר, המיטוכונדריה ולבודד ושברים ממברנה.
    1. Centrifuge את תגובת שיקוע (מתוך שלב 4.1.8) ב × 500 g עבור תגובת שיקוע העברת 10 דקות כדי שפופרת צנטרפוגה נקי, ולמחוק את כל גלולה.
    2. Centrifuge תגובת שיקוע (מתוך שלב 5.1.1) ב × 1000 גרם במשך 10 דקות להעביר את תגובת שיקוע על שפופרת צנטרפוגה נקי, ולמחוק את כל גלולה.
    3. Centrifuge את תגובת שיקוע (מתוך שלב 5.1.2) ב × 2,000 g עבור 10 דקות להעביר תגובת שיקוע על שפופרת צנטרפוגה נקי, ולמחוק את כל גלולה.
    4. Centrifuge את תגובת שיקוע (מתוך שלב 5.1.3) ב × 4,000 גרם במשך 15 דקות העברה תגובת שיקוע על שפופרת צנטרפוגה נקי, לשמור על גלולה המכילה המיטוכונדריה.
    5. Resuspend בגדר המיטוכונדריה באמצעי אחסון קטן (0.5\u20121 מ"ל) פירוק מאגר B.
    6. Centrifuge בגדר תנאי ב × 4,000 גרם במשך 15 דקות להסיר את תגובת שיקוע ואת resuspend מיטוכונדריאלי צניפה בהיקף הסופי הרצוי של מאגר מדגם (למשל, 250 עד 500 µL, בהתאם לגודל בגדר והרצוי ריכוז).
    7. צנטריפוגה תגובת שיקוע (מתוך שלב 5.1.4) ב × 4,000 גרם במשך 15 דקות להעביר את תגובת שיקוע שפופרת צנטרפוגה נקי. חזור על שלב זה עד אין גלולה מתקבל לאחר צנטריפוגה.
    8. לסובב את תגובת שיקוע ב × 18,000 g עבור 3 שעות.
    9. הסר את תגובת שיקוע, ולשמור את גלולה המכילה חלבונים ממברנה. Resuspend בגדר ממברנה באמצעי אחסון קטן (0.5-1 מ ל) של פירוק מאגר B.
    10. Centrifuge בגדר תנאי ב × 18,000 g עבור 1 h.
    11. הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר ממברנה באמצעי הסופי הרצוי דוגמת המאגר (250 עד 500 µL, בהתאם לגודל של גלולה, הריכוז הרצוי).
  2. Sonicate כדורי מדגם 3 s באמבט קרח בקביעה כוח של 5 (50% של 125 כוח מרבי W ב-20 קילו-הרץ, ראה טבלה של החומרים).
  3. אחסן את הדגימות ב 4 ° C (תקופות קצרות) או-20 ° C (לטווח ארוך).
  4. לבחון את הדגימות טוהר של fractionation על ידי ביצוע של תספיג ניצול נוגדנים נגד סמני חלבונים נמצאו בתאים ציטופלזמה, המיטוכונדריה, הממברנה של התא (עיין בסעיף התוצאות נציג).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

Fractionation מוצלחת של U937 מובחן8 תאים גדל ההשעיה הושג באמצעות פרוטוקול שתוארו לעיל, מאויר באיור1. הדגימות שהושג עם שיטה זו היו נענשים המערבי סופג9 ניצול שיטת העברה רטוב כדי קרום פלואוריד (PVDF) polyvinylidene. הקרום נבדקה לאחר מכן עם נוגדנים נגד cytoplasmic, מיטוכונדריאלי, ממברנה מקומי סמני חלבונים (איור 2, איור 3, איור 4

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפיתוח של פרוטוקול זה עלתה מחוסר היכולת להפריד מיטוכונדריאלי ודוגמאות ממברנה, באמצעות ערכות זמינים מסחרית, לניתוח של חלבון לוקליזציה במהלך necroptosis14. המגבלות העיקרי של ערכות premade הם היכולת שלהם להתאים את הצרכים של חוקרים בודדים, שלהם עלות לדוגמה, מספר מצומצם של דוגמאות מסוגל להיות מעובד. השיטה המוצגת כאן יכול להתבצע ללא שימוש ריאגנטים יקר וללא הצורך של ציוד יקר. בשיטה זו וניתן לשנותם כדי להכיל כל מספר של תאים, והוא מסוגל להיות משתנה בהתאם לצרכים של חוקרים. פעולה זו מאפשרת את התשואה של כל שב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים אין ניגוד אינטרסים

תודות

עבודה נתמכה על ידי NIH-1R15HL135675-01 כדי טימותי ג' רוקה

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
DigitoninTCI ChemicalsD0540למיצוי ציטופלזמה
D-מניטולסיגמא-אולדריץ'M4125עבור מאגר ליזה B
Dounce הומוגנייזרVWR22877-282להומוגניזציה
מסובב קצהעל הקצה BarnsteadN/Aלמיצוי ציטופלזמה
אתילן גליקול-ביס(&בטא;-אתר אמינואתיל)-N,N,N' ,N'-tetraacetic acid (EGTA)Alfa AesarJ61721עבור מאגר ליזה B
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma-AldrichE7889עבור מאגר ליזה B
GAPDH (14C10)Cell Signalling Technologies2118לזיהוי שברים ציטופלזמיים על כתם מערבי, דילול: 1:10000
HEPESVWRJ848עבור מאגרי ליזה A ו-B
KClSigma-AldrichP9541עבור מאגר ליזה B
MgCl2Alfa Aesar12315עבור מאגר ליזה B
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)טכנולוגיות איתות תאים23565לזיהוי שברי קרום פלזמה על כתם מערבי, דילול: 1:1000
NaClSigma-Aldrich793566עבור מאגר ליזה A
פנילמתאן סולפוניל פלואוריד (PMSF<חזק>)VWRM145למיצוי ציטופלזמה והומוגניזציה
סוניקטור בדיקהמאגר QsonicaQ125-110לדגימות סופיות
קוקטייל מעכב פרוטאז, שימוש כלליVWRM221-1MLלמיצוי ציטופלזמה
צנטריפוגה מקוררתבקמן-קולטרN/A
נתרן דודציל סולפט (SDS)VWR227עבור מאגר מדגם
נתרן אורתוואנדאט (SOV)450243 סיגמא-אולדריץ'עבור מאגרי ליזה A ו-B
סוכרוזסיגמא-אולדריץ'S0389עבור מאגר ליזה B
תמיסת מלח עם חוצץ טריס (TBS)VWR788עבור מאגר מדגם
VDAC (D73D12)טכנולוגיות איתות תאים4661לזיהוי שברים מיטוכונדריאלים בכתם מערבי, <דילול u>: 1:1000

מקורות

  1. Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, e440-e445 (2015).
  2. Hwang, S. II, Han, D. K. Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility. Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).
  3. Song, Y., Hao, Y., et al. Sample preparation project for the subcellular proteome of mouse liver. Proteomics. 6 (19), 5269-5277 (2006).
  4. Lenstra, J. A., Bloemendal, H. Topography of the total protein population from cultured cells upon fractionation by chemical extractions. European Journal of Biochemistry. 135 (3), 413-423 (1983).
  5. Michelsen, U., von Hagen, J. Chapter 19 Isolation of Subcellular Organelles and Structures. Methods in Enzymology. 463 (C), 305-328 (2009).
  6. Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses). Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).
  7. Williamson, C. D., Wong, D. S., Bozidis, P., Zhang, A., Colberg-Poley, A. M. Isolation of Endoplasmic Reticulum, Mitochondria, and Mitochondria-Associated Membrane and Detergent Resistant Membrane Fractions from Transfected Cells and from Human Cytomegalovirus-Infected Primary Fibroblasts. Current protocols in cell biology. 68, 3.27.1-3.27.33 (2015).
  8. Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
  9. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  10. Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).
  11. Hodge, T., Colombini, M. Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels. Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).
  12. Therien, aG., Blostein, R. Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology. Cell physiology. 279 (3), C541-C566 (2000).
  13. Devarajan, P., Stabach, P. R., De Matteis, M. A., Morrow, J. S. Na,K-ATPase transport from endoplasmic reticulum to Golgi requires the Golgi spectrin-ankyrin G119 skeleton in Madin Darby canine kidney cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 10711-10716 (1997).
  14. McCaig, W. D., Patel, P. S., et al. Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis. Cell Death Discovery. 4, 55(2018).
  15. Simpson, R. J. Homogenization of Mammalian Tissue. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

תא Fractionation של תאים U937, בהעדר צנטריפוגה במהירות גבוהה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.