מחקר זה מתאר של תפוקה גבוהה, assay מיקרו-ניטרול מבוססת הדמיה כדי לקבוע את כייל נוגדנים נטרול ספציפיות עבור הווירוס syncytial הנשימה (RSV). תבנית זו assay נבדקו על סוגי דגימה שונים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Assay מיקרו-ניטרול קצב העברת נתונים משופר וגבוה הווירוס Syncytial הנשימה (RSV)
במאמר זה
סיכום
תקציר
הנשימה syncytial וירוס ספציפיים נטרול נוגדנים (RSV NAbs) הם סמן חשוב של הגנה כנגד RSV. מספר תבניות assay שונים הם נמצאים כעת בשימוש ברחבי העולם כך שאין צורך שיטה מדויקת, תפוקה גבוהה עבור מדידת RSV NAbs. נתאר כאן assay מיקרו-ניטרול מבוססת הדמיה אחר נושאים ' נבדק על קבוצת משנה של RSV A, ניתן להתאים גם עבור קבוצת משנה של RSV B סוגי דגימה שונים. שיטה זו היא מאוד לשחזור, עם וריאציות הבין-assay בנסיוב הפניה להיות פחות מ 10%. אנו מאמינים ש-assay הזה ניתן להקים בקלות במעבדות רבות ברחבי העולם במחיר נמוך יחסית. התפתחות assay משופרת, תפוקה גבוהה המודד RSV NAbs מייצג צעד משמעותי קדימה התקינה של שיטה זו ברחבי העולם, כמו גם להיות ביקורתיים להערכת המועמדים חיסון RSV הרומן בעתיד.
מבוא
הווירוס syncytial הנשימה (RSV) הוא הגורם המוביל של זיהומים בדרכי הנשימה התחתונה אוכלוסיית ילדים ברחבי העולם1. למרות משאו גבוהה, יש עדיין אין חיסון או טיפול זמין. משנת 2013, ארגון הבריאות העולמי (WHO) הכריזה על פיתוח חיסון RSV כעדיפות המחקר העיקרי, עם2,פגישות ייעוץ העולמי השנתי3. המי שהסכים באמצעות RSV בנטרול מדידה נוגדנים (NAb) כדי לעקוב אחר חיסון immunogenicity, כפי זה מזוהה כמספר דה מרקר סרולוגית העיקריים של הגנה4. NAbs הוכחו להגן מפני זיהום חמור RSV במספר מחקרים, כמו גם ניסויים קליניים של palivizumab נוגדנים חד שבטיים אנטי-RSV, כיום אסטרטגיה מניעתי בלבד זמינים....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: כל השלבים צריך להתבצע בשכונה BSL2 אלא אם צויין אחרת. טיטור ויראלי נדרש מראש וזמינותו PRN כדי לקבוע ריכוז RSV אופטימלית בשימוש PRN וזמינותו. מומלץ aliquot את המניות וירוס באמצעי אחסון קטן להיות הקרת פעם, המשמש עבור כל assay NAb. מומלץ גם באמצעות המניה נגיפי זהה עבור כל מבחני NAb לבצע עבור כל דגימות מחקר אחד. ודא תרבות ומדיה באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) מחומם ב 37 מעלות צלזיוס לפני הוספת תא צלחות.
1. RSV טיטור ויראלי
הערה: בהתאם את מספר המניות וירוס מספר הכפילויות, הצלחת assay ניתן להגדיר על פי איור 1. כל מניה וירוס, צריך להיות טיטרציה שהפקידים למט....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
טיטרציה של מלאי וירוס בוצעה מ 1:10 עד 1:108 דילול כדי לקבוע ריכוז מניות וירוס לפני וזמינותו PRN (נציג תוצאות המוצג באיור5). איור 5, PFU ניתן לספור באופן אמין-דילולים של 1:104 ו- 1:105. המספר הממוצע של PFU מבארות triplicate-הדילול באותו מחושב. מאז המספר הממוצע של נקודות ב- 1:105 דילול בת 14, כייל ויראלי של מלאי ויראלי זה נקבע כדלקמן:
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
יש שפותחה ואנו ממוטב פשוטה ויעילה RSV מיקרו-ניטרול assay זה ניתן להתאים בקלות במעבדות רוב. זה וזמינותו הוא היכולת למדוד את היכולת זיהום נגיפי, כמו גם מדידת עיכוב של זיהום נגיפי מאת NAb ברמה התאית באמצעות סריקת תמונה ממוחשב. השימוש של פלטפורמה מבוססת הדמיה של מערכות מבוססות נוגדן ספציפי גדל ירידה לפרטים, ורגישות של זיהוי ספוט בהשוואה פלאק מסורתי איתור שיטות6,7. פעולה זו מאפשרת אפיון RSV זנים עם infectivity נמוך ומספק גם של כימות מדויק של RSV ריכוז לפני השימוש ב- P.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
המחברים תודה לכל המשתתפים מעורבים. אנו להכיר תוכנית תמיכה תשתיות מבצעיות של הממשלה ויקטוריאני. PVL היא נמען מלגת פיתוח הקריירה NHMRC.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>קו תאים | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | מסופק על ידי ד"ר קית' צ'אפל, אוניברסיטת קווינסלנד |
| <זנים חזקים>ויראליים | |||
| RSV A2 | ATCC | VR-1540 | מספר אצווה 60430286 |
| <חזקים>ריאגנטים | |||
| Acetone | Merck | 1000142511 | |
| Alexa-Fluor חמור נגד עזים IgG (מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; ג) | Life Technologies | A11055 | |
| CMC אבקת מלח נתרן | Sigma-Aldrich | C5678-500G | |
| DMEM (ללא סרום, 3.7 גרם/ליטר NaHC, P/S) (מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; ג) | שירותים מדעיים – תרבית | MCRI באספקה ביתית | |
| סרום עגל עוברי (מאוחסן ב-50 מ"ל ב-20 מעלות; ג) | נוגדן | Interpath SFBS-F | |
| Goat X RSV | Merck | AB1128 | |
| אנטי-סרום רב-שבטי אנושי לנגיף סינציאלי נשימתי (RSV) (מאוחסן ב-45 ומיקרו; L aliquots ב-20 & deg; ג) | משאבי BEI | NR-4022 | הזמנה חינם דרך משאבי BEI בעת ההרשמה. סרום זה שייך לפאנל של אנטי-סרום אנושי וגלובולין חיסוני לאבקת RSV (NR-32832) |
| M199 Life | Technologies | 31100035 | |
| תמיסת חסימת חלב מדלל (מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C) | Australian Biosearch | 50-82-01 | |
| פניצילין/סטרפטומיצין (מאוחסן ב-6 מ"ל ב-20 מעלות; ג) | Life Technologies | 15140122 | |
| s.d.H2O ממתקן Milli-Q | Merck | In-house dispensation | |
| סטרילי 1x PBS לתרבית (מאוחסן ב-4 מעלות; ג) | שירותים מדעיים – תרבית | MCRI באספקה ביתית | |
| Tween 20 פוליסורבט | סיגמא-אולדריץ' | 9005-64-5 | |
| <חזק>חומרים מתכלים כלליים | |||
| צינורות בז חרוטי (50 מ"ל) | Invitro Technologies | FAL352070 | |
| יחידת סינון 0.22 μ m (500 מ"ל) | Thermo Fisher | NAL5660020 | |
| Eppendorf סטריליים (1.5 מ"ל) | Australia PL | AM12400 | |
| צלחות סטריליות עם תחתית שטוחה (96 בארות עם מכסה) | Interpath | 655180 | |
| צלחות U-bottom סטריליות (96 בארות עם מכסה) | Interpath | 650180 | |
| 5 מ"ל פיפטה סרולוגית | Sigma-Aldrich | CLS4487-200EA | |
| פיפטה סרולוגית 10 מ"ל | אינטרפת' | 607180 | |
| 25 מ"ל פיפטה סרולוגית | סיגמא-אולדריץ' | CLS4251-200EA | |
| פיפטת קצה 1-200 ומיקרו; L Clear Maxymum Recovery מתלה מעוקר מראש 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-200-L-R-S | |
| TIP פיפטה 5-20 ומיקרו; L Clear Maxymum Recovery מתלה מעוקר מראש 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-20-L-R-S | |
| TIP פיפטה 100-1,000 ומיקרו; LClear Maxymum Recovery מתלה מעוקר מראש 10RACKS x 100TIPS PKG1000 | Fisher Biotec | TF-1000-L-R-S | |
| TIP פיפטה 1-10 ומיקרו; L Clear Maxymum Recovery Racked מעוקר מראש 10RACKS x 100TIPS PKG1001 | Fisher Biotec | TXLF-10-L-R-S | |
| Equipments and softwares | |||
| ELISpot מערכת קורא | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, שטרסבורג, גרמניה | ||
| AID ELISpot תוכנה גרסה 5.0 | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, שטרסבורג, גרמניה | ||
| מיקרוסופט אקסל 2007 |
מקורות
- Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
- Modjarrad, K., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
