מאמר שיטה

זרימת עבודה פשוטה הגירה/הפלישה באמצעות Imager אוטומטיות של תאים חיים

DOI:

10.3791/59042

⸱

2 בפברואר 2019

 ,  ,  , 
1Medical Genetics, Hunter Medical Research Institute, 2Priority Research Centre for Cancer Research, Innovation and Translation, School of Biomedical Sciences and Pharmacy, Faculty of Health and Medicine, University of Newcastle, 3Pathology North, John Hunter Hospital

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה משולבת חוקרים נדידת תאים סרטן ופלישה על פלטפורמה אחת בזמן אמת, מתן אפשרות היעילה הדירים בקלות ללמוד ניידות תא ו מורפולוגיה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סרטן התא ניידות חיונית אתחול של גרורות. לכן, חקירה של תנועת התא, קיבולת פולשנית היא משמעות רבה. העברת מבחני לספק תובנה בסיסית של תנועת התא ברמה 2D, ואילו מבחני הפלישה רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית, מחקה סרטן ויוו dislodgment תא מהאתר המקורי, פולשים באמצעות מטריצות. בפרוטוקול הנוכחי מספק זרימת עבודה יחידה עבור מבחני ההעברה ואת הפלישה. יחד עם משולב אוטומטי מיקרוסקופיים המצלמה עבור ניתוח מובנה מודול ותמונות בזמן אמת HD, זה נותן חוקרים היעילה, האפשרות ניסיוני פשוטה לשחזור. פרוטוקול זה כולל גם החלפות הגיוניות מתכלים ושיטות ניתוח חלופי עבור משתמשים לבחירה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נדידת תאים הפלישה חשוב תהליכים ביולוגיים המאפשרים פונקציות נורמלית בגוף האדם, כגון סגירת הפצע, הפלישה של השליה לתוך הרחם ואת עטין מורפוגנזה1,2,3בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. בגוף האדם יש שליטה קפדני ומדויק של אירועים אלה ביולוגי; עם זאת, ישנם כמה חריגים. גידולים ממאירים, למשל, מסוגלים לברוח הגנה זו, מוצג התפשטות חריגה, לפלוש לתוך רקמות שכנות, אשר נקרא גרורות. גרורות הוא הגורם העיקרי של תמותה מסרטן4.

סרטן השד הוא הכי נפוץ אובחן סרטן אצל נשים, הוא הגורם השני-הגבוה של מוות מסרטן בקרב נשים במדינות מפותחות ברחבי העולם

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: שתי שורות תאים צריך להיות מטופל בנפרד. ההליכים הבאים צריך להיות מוחל על קו תא בודד אחד אם לא צוין.

1. למטב את צפיפות התאים לפני פציעתו

  1. התרבות תאים חסיד ב T75 ס מ2 תרביות רקמה מבחנות עד כ 80% למפגש ב Dulbecco חינם של פנול אדום שונה נשר בינוני (DMEM) בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS), 200 מ מגלוטמין ו- 2 µg/mL אינסולין ב 37 ° C עם 5% CO2 ( הדגירה סטנדרטי עבור רוב שורות תאים סרטן, תרבות ניסוחים התנאים תא תלויי-קו).
  2. להסיר את המדיה התרבות על ידי pipetting לתוך מיכל פסולת. Pipet 2 מיליליטר מראש ומחוממת 0.1% טריפסין-EDTA בקצרה לשטיפה תא טפט של pipet. להוסיף עוד 2 מ"ל של 0.1% טריפסין-E....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Assay הגירה/הפלישה הזו מבוססת על וזמינותו ריפוי הפצע, הבודקת את הקצב של התאים נעה לתוך אזור נטול תאים שנוצרו על-ידי הכלי מאפס 96 פינים. ההבדל בין מבחני ההעברה ופלישה הם מבחני ההעברה כי תאי מידות עובר בתאי רקמת-תרבות מטופלים פלסטיק משטח ופלישה אמצעים העברת ECM ג'ל.

בכלי גירוד נועד לגרום עקבי פצעי הזמני בצלחת המיועד, םלצה לחיות תאים מתוכנן לקחת תמונות ברזולוציה גבוהה בזמן אמת עם הפצעים מאפס באמצע. השניים השד סרטן קווים המשמשים את .......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההעברה הפלישה פרמטרים חשובים כדי להעריך את הניידות של תאי הסרטן בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. על-ידי שימוש בכלי גירוד 96 פינים, זה אפשרי לערוך ריפוי מבחני ב 2D and 3D בו זמנית הפצע. מלבד בהנחיה בסריקה אוטומטית באמצעות סביבת התרבות התא יציב עם הפרעה מינימלית, וזמינותו מאפס נערך באמצעות הכלי מאפס 96 פינים מספק עקבי פצעי הזמני, הפעלת ניסויים כי הם עמידים יותר, לשחזור. התבנית 96-ובכן צלחת נותן אפשרויות נוספות של הגדלת מספר שורות תאים או טיפולים תרופות שונות. בנוסף, שינויים מורפולוגיה תאים ותנועה דינמי ניתן לרשום לצורך ניתוח .......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות תמיכתנו מימון על ידי קרן קבוצת בלומפילד דרך צייד המכון למחקר רפואי (HMRI 13-02). X.Z נתמך על ידי מלגת APA דרך האוניברסיטה של ניוקאסל את המלגה לתואר שלישי HCRA הדגל סמנים ביולוגיים.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.5% תמיסת טריפסין-EDTA (10x)ThermoFisher Scientific30028-02מדולל ל-2x ב-DPBS
Countess II FL מונה תאים אוטומטיThermoFisher ScientificAMQAX1000אוטומטי נגד תאים
1 (Alconox)Sigma-Aldrich2429850.5% ריכוז עבודה
חומר ניקוי 2 (Virkon S)Vetמוצר ישיר1% עובד ריכוז
Dulbecco' s Modified Eagle Medium, ללא פנול אדוםThermoFisher Scientific21063-045מועשר ב-10% FBS, 200 מ"מ L-גלוטמין, 2 μ גרם/מ"ל אינסולין
ECM ג'ל (מטריג'ל)Sigma-AldrichE6909גורם גדילה מופחת, ללא פנול אדום
Essen ImageLock צלחת 96 בארות, תחתית שטוחהEssen4379
EVE שקופיות ספירתBioToolsEVS-50
סרום בקר עוברי (FBS)Bovogen BiologicalsSFBS-F-500ml
IncuCyte 96-well שריטות פלישת תאים פצוע אביזריםEssen4444כולל CoolBox, 2x CoolSink
IncuCyte Cell Migration KitEssen4493כולל בלוק סיכות 96 בארות, 2x סירות שטיפה והתוכנה
IncuCyte ZOOMEssenמערכת ניתוח תאים חיים
תמיסת אינסולין אנושיתSigma-Aldrich19278-5ML
תמיסת L-גלוטמין (100x)ThermoFisher Scientific25030-091
בקבוק תרבית רקמה, 75 ס"מ2 אזור גידולגריינר ביו-וואן658175
חומר ניקוי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Graham, C. H., Lala, P. K. Mechanisms of placental invasion of the uterus and their control. Biochemistry and Cell Biology. 70, 867-874 (1992).
  2. Affolter, M., Zeller, R., Caussinus, E. Tissue remodelling through branching morphogenesis. Nature Reviews Mo....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Cell MigrationInvasion AssayLive cell ImagingScratch Wound AssayExtracellular Matrix GelAutomated MicroscopeWound Healing AnalysisCell Proliferation CurveConfluence MaskHigh throughput Screening

מאמרים קשורים