הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הדמיה של לימפוציטים אנושיים יונת ריאות ב ניסיוני במודל Vivo של דלקת אלרגית בהתבסס על מיקרוסקופ אור גיליונות מתקדמות

7.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59043

⸱

16 באפריל 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine 1, University Hospital of Erlangen, 2Department of Medicine 3, University Hospital of Erlangen

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול שהוצג כאן מאפשרת אפיון ריאות ביות של לימפוציטים אנושיים הראשי תחת תנאים דלקתיים ויוו. יכול להיות עם תמונה, לכמת על-ידי קרינה פלואורסצנטית אור גיליונות מיקרוסקופיה של רקמת הריאה כימית שנוקה ריאתי חדירה של תאים חיסוניים האנושי הועבר adoptively במודל של עכברים של דלקת אלרגית.

תקציר

מהמם הצטברות רקמה של תאים חיסוניים מופעל מאוד מייצג סימן היכר של מחלות דלקתיות כרוניות שונות, הגיח יעד אטרקטיבי טיפולית בתחום ניהול קליני של חולים מושפעת. כדי לייעל עוד יותר אסטרטגיות מכוון טיפולית רגולציה של רקמות באופן פתולוגי מאוזנת חדירה של תאים חיסוניים הפרו דלקתיים, זה יהיה בעל חשיבות מיוחדת כדי להשיג שיפור תובנות לתוך המחלה איברים ספציפיים או תכונות ביות של לימפוציטים היקפיים. פרוטוקול הניסוי המתואר כאן מאפשר לעקוב אחר ריאות הצטברות של לימפוציטים אנושיים fluorescently שכותרתו, הועבר adoptively בהקשר של דלקת ריאות הנגרמת פפאין. בניגוד מבחני הפריה רגילה תכוף לניתוח של נדידת תאים חיסוניים ו כימוטקסיס, ההגדרה ויוו עכשיו הציג לוקח בחשבון ספציפי ריאות היבטי בארגון רקמות ואת ההשפעה של המתחם דלקתיות תרחיש מתרחשים האורגניזם החי מאתר. יתר על כן, קרינה פלואורסצנטית אור גיליונות חתך תלת מימדי הדמיה מיקרוסקופיים אינם מספקים נתונים כמותיים על הסתננות התאים החיסוניים, אבל גם מציג את הדפוס של תאים חיסוניים לוקליזציה בתוך הריאה מודלק. בסך הכל, אנו מסוגלים להכיר טכניקה חדשנית בעלת ערך גבוה עבור אימונולוגי במחקר בתחום מחלות ריאה דלקתיות כרוניות, אשר יכול להיות מיושם בקלות על ידי ביצוע פרוטוקול צעד אחר צעד שסופקו.

מבוא

הפרעות דלקתיות קלאסי של הריאות, כגון אסטמה אלרגית, מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), ידועים היטב כדי להיות מונע על ידי גיוס מוגבר לימפוציטים מופעל לתוך רקמת הריאה1,2. ציטוקינים שפורסמו לימפוציטים (למשל, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IFN-γ ו- TNF-α) לקדם כימוטקסיס של תאים חיסוניים מולדת, גמישים, זירוז שיפוץ שהותירה דרכי הנשימה או ישירות לנזק parenchyma הריאה2. עד כה, המנגנון הבסיסי אחראי הצטברות פתולוגי של לימפוציטים בתוך רקמת הריאה אינם עדיין לגמרי מובנים. בהשוואה כדי החתמה תא T סלקטיבי רקמות המתוארות עבור יונת במעיים, עור, ריאות תאים דנדריטים (Dc) מסוגלים כמובן פריים היקפיים בתאי T ריאות מועדף חדירה, לפחות חלקית דרך אינדוקציה הביטוי CCR4 על פני השטח של לימפוציטים3. חוץ CCR4, הסתננות דרכי הנשימה תאי T מאופיינים גם ביטוי מוגבר במיוחד של קולטני כימוקין CCR5, CXCR3 לעומת תאי T בתוך4,1,5דם היקפיים. באופן כללי, קיימים נתונים עקביים עם הרעיון כי הריאות יונת של לימפוציטים מסוג T בתנאים פיזיולוגיים או דלקתיים כרוך במספר רצפטורים שונים כימוקין ליגנדים בהתאמה שלהם, ובכך מכרעת תלוי מקרוב נשלט שיתוף פעולה בין תאים חיסוניים מולדת, מסתגלת1. במיוחד, בשלב הראשוני של חשיפה פתוגן או אלרגן, תאים של מערכת החיסון המולדת להגיב TLR גירוי או cross-linking בתיווך IgE על ידי שחרור מיידי של chemoattractants שונים, כמו LTB4, CCL1, CCL17, CCL22, CCL20, CXCL10 ו- PGD21,6,7. בתור דוגמה, האינטראקציה בין PGD2 הקולטן chemoattractant CRTh2 ידוע שיש חשיבות מיוחדת עבור כימוטקסיס תאי Th2 והופיע ובכך מבטיח כמו מטרה טיפולית ניהול קליני של אסטמה. אכן, חולי אסטמה מתונה הראה שיפור בסימפטומים, עלייה משמעותית של אמצעי האחסון expiratory בכפייה בשנייה אחת (FEV1) לאחר הטיפול עם אנטגוניסט CRTh2 סלקטיבית לעומת פלסבו קבוצה8 ,9. במצב יותר שהתמשכו של תגובת דלקתית, תאי T וגייסנו כבר מסוגלים להגביר עוד יותר לימפוציטים ריאתי הצטברות באמצעות השחרור של IL-4 ו- IL-13 בתור לגירויים חזק עבור בקרי התחום ריאתי. לאחר מכן, אלו תאים מולדת מיאלואידית נגזר למעלה-לווסת את הביטוי של CCL17, CCL22 STAT6 תלויית האופן1,10,11.  למרות המורכבות של התרחיש המתואר מעכבת עדיין הבנה מלאה של תא T ריאות ביות, המלון מציע שפע של מטרות מולקולריות עבור פקד טיפולית פוטנציאל אופטימיזציה של מחלות דלקתיות או אלרגיות. לכן, יש צורך דחוף של טכניקות חדשניות ניסיוני, אשר מסוגלים להעמיק עוד יותר ולהשלים את הידע שלנו בתחום של תא T כימוטקסיס, יונת ריאות.

בשל העובדה כי יונת ריאות של לימפוציטים בתוך גוף האדם מושפע על ידי פרמטרים הסלולר, ההורמונאלית והפיזי מספר1, מרבית השיטות ניסיוני הקיימים אינם מסוגלים דגם כל המורכבות של תהליך אימונולוגי. במקום זאת, רבים פרוטוקולים סטנדרטיים לניתוח של הריאה ביות באופן סלקטיבי להתמקד על היבט מסוים מעורב המפל של לימפוציטים משיכה, הדבקות, העברה ושמירה. מלבד החלטה תיאורי גרידא של הדפוס ביטוי mRNA או חלבון של רצפטורים אינטגרינים ו כימוקין על לימפוציטים היקפיים או ריאות הסתננות ומדידה משלימים המתאימים כימוקין רמות בדם. bronchoalveolar שטיפה (BAL) או רקמת הריאה12,13,14,15, מבחני תרבות תא במבחנה ומבוססת לאפשר אפיון פונקציונלי של לימפוציטים אדהזיה או כימוטקסיס על הגדרת תנאים ניסיוני16,17,18. בעקרון, מבחני אדהזיה במבחנה סטטי לפקח הקיבולת איגוד של לימפוציטים בתרבית של טפט אנדותל או שקופיות זכוכית מצופה מולקולות אדהזיה אנדותל רקומביננטי (כגון MAdCAM 1, VCAM-1), תוך גופית רגילה מבחני כימוטקסיס חלים בדרך כלל על מנת לכמת את היכולת של לימפוציטים להעביר לאורך הדרגתי כימוקין מערכת transwell19. שתי ההגדרות במבחנה לאפשר התאמה מבוקרת עם אפנון של תנאי הניסוי, אך מאידך חסר משתנים חשובים ידוע באופן ביקורתי את ההשפעה על כימוטקסיס ויוו והצמדות של לימפוציטים. בעיקר, מבחני תרבות תא סטטי להתעלם השפעת כוחות הטיה הנגרמת על ידי זרימת דם קבוע19 , פוטנציאל להזניח את המעורבות של חצרו אימונולוגי שמסביב תאים חיסוניים אינטראקציה אי-לימפוציטים, שניהם מציגים אורגניזם חי. כדי להתגבר על מגבלות אלה, הפרשנות של התוצאות שהושגו סטטי במבחנה מבחני כימוטקסיס או הדבקות צריך עוד יותר אימות בניסויים אדהזיה דינמי תחת זרימה תנאים20,21 וב ב מודלים vivo של פתולוגיה דלקתית איברים19. אכן, חשוב יכול ניתן להסיק מסקנות על התקנון של תא T ריאות ביות בתנאים דלקתית או אלרגי מחקרים בבעלי חיים ניתוח גנטית שונה עכברים מודלים מוגדרים של מחלות שונות3, 22 , 23. ההשוואה הכמותית הריאה שחדר לימפוציטים בין wildtype עכברים ועכברים עם מחסור עבור גנים ספציפיים עניין מייצג כלי ומבוססת ומשמש באופן נרחב עבור הגדרת את ההשפעה של סלולרי מסוים מסלולים או רצפטורים על התבנית מונחה-מחלה של התפלגות T cell. עם זאת, בניגוד ל לפני דנו תא במבחנה מבחני תרבות, עיצוב המחקר מבוסס על מודלים קלאסיים חסרה את היכולת לנתח ולנטר העיקרי בתאי T האדם נגזרת ישירות בדם או BAL של חולים הסובלים ריאה דלקתיות המחלה. לכן, זה עדיין נשאר מאתגר לאמת באופן פונקציונלי אם מחלת ריאות אבחונית שצוין הוא מסוגל להטביע לימפוציטים אנושיים tropism ריאות מועדף, עד כמה פרמטרים קליניים העלולים להשפיע על התרחיש הזה. לאחרונה, בגישה ויוו אלגנטי מאוד הוצג בהקשר של מחלות מעי דלקתיות (מחלת המעי הדלקתי), אשר היה מסוגל להתגבר על רוב מגבלות אלה ופתח אפיקים חדשה השתלמות translational על לימפוציטים מעיים ביות24 . תוך ניצול פרוטוקולים עבור ניקוי רקמות ממס מבוסס ואחריו קרינה פלואורסצנטית אור גיליונות חתך הרוחב מיקרוסקופ הדמיה ככלי רב עוצמה, זה היה אפשר לדמיין את חדירה והפצה של תאי T אדם הועבר adoptively במעי של עכברים immunodeficient colitic24. בפרט, הגדרה ניסויית זו מיושמת שני חידושים עיקריים: (1) ראשי תאים חיסוניים האנושי ניתן לנתח בתנאים ויוו השפעול מוגדרים; (2) שטח די גדול של האיבר הפגוע (כ 1.5 ס מ x 1.5 ס מ) יכול לדימות באיכות ברזולוציה גבוהה, ואחריו 3D-שיקום. יתר על כן, מחקרים שנעשו לאחרונה מספר בהצלחה הקים השימוש ממס מבוסס רקמות ניקוי מיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות ככלים חשובים ריאה מתקדם הדמיה25,26. על מנת להפיק תועלת זו התקדמות טכנולוגית בתחום אימונולוגיה ריאתי, אנחנו עכשיו אימצו את השיטה לניתוח של יונת ריאות.

פרוטוקול שהוצגו כאן מספק הקדמה צעד אחר צעד איך לטהר ותווית fluorescently T אנושיים ראשי תאים עבור העברת לתוך עכברים עם דלקת ריאות המושרה, יתר על כן, מתאר בפירוט את התהליך עוקבות של אור גיליונות קרינה פלואורסצנטית הדמיה מיקרוסקופיים, כולל עוגב הכנה ועיבוד תמונה. בסך הכל, אנו מקווים לתמוך מחקרים translational עתידיים בתחום מחלות ריאה דלקתיות או אלרגי על ידי החדרת שילוב מתוחכם, אבל בכל זאת ריאלי, ניסיוני דגם לניטור לימפוציטים אנושיים יונת ריאות על התנאים ויוו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הניסויים המערבות בעלי חיים בוצעו על פי פרוטוקולים שאושרו על-ידי הרשויות המקומיות הרלוונטיים בארלנגן (Regierung פון Unterfranken, וירצבורג, גרמניה). עכברים שוכנו בתנאים מסוימים ללא הפתוגן. האוסף של דם אנושי אושרה על ידי הוועדה המקומית אתית מוסדית מועצת המנהלים של אוניברסיטת ארלנגן-נירנברג. כל מטופל נתן הסכמה בכתב.

1. לגרום לדלקת ריאות אלרגית בעכברים

הערה: כפי שמתואר מחקרים קודמת27, בהליך ניסיוני הבא מאפשר וגורם לדלקת אלרגית דרכי הנשימה בעכברים, בהתאם, מעורר ההצטברות של תאים חיסוניים מולדת, מסתגלת ב הכדור. הפרוטוקול המתואר הוקם בשנת C57BL/6J עכברים, אבל אימוץ זנים המפגרים סטנדרטיים אחרים צריך להיות אפשרי.

ראה איור 1A עבור סיכום של ההליך ניסיוני ויוו.

  1. עזים ומתנגד עכברים באמצעות הזרקת בקרום הבטן של קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים.
    הערה:     להשתמש רק C57BL/6J עכברים בוגרים מאשר 6 שבועות, עם משקל הגוף לפחות 16 גרם.
    1. להכין קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים פתרון ב- PBS (12 מ"ג/מ"ל קטמין; חריגות השירותים הווטרינריים 1.6 מ"ג/מ"ל) ולקבוע את משקל הגוף המדויק של עכברים.
    2. להחדיר את העכבר הראשון 8 bodyweight µL/g של קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים פתרון intraperitoneally ואשר הרדמה עמוקה דרך היעדר רפלקס הפינצ כפת לפני שתמשיך לשלב 1.3.
  2. טרי להכין 5 מ"ג/מ"ל של פפאין ב- PBS. לאט לאט פיפטה 10 µL (50 µg) של הפתרון פפאין לתוך הנחיר. לפקח בקפידה על העכבר עד התעוררות.
  3. חזור על הצעדים 1.1 ו- 1.2 עכברים כל כלול את הניסוי. בצע צעדים 1.1-1.3 שלושה ימים רצופים.

2. לטהר ויסמנו Fluorescently האנושי CD4 דם היקפיים+ תאי T

הערה: תאים תהליך בתנאים סטריליים.

  1. לאסוף 18 מ של דם אנושי מלא וריד היקפיים. לבצע צנטריפוגה הדרגתיות Ficoll-Hypaque על מנת לבחור את השבר של תאי תאי דם היקפיים (PBMC).
    הערה: איסוף וניתוח של חומר אנושי הראשי צריך יאושרו על-ידי הרשויות המקומיות אתית. רק אדם בעל הכשרה רפואית נאותה מותר לאסוף דם מווריד היקפיים.
    1. לאסוף דם בחומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA)-המכילים monovettes (1.6 מ ג דם EDTA/mL) כדי למנוע קרישה.
      אופציונלי: להשתמש באפי המעיל דם, תוצר לוואי של תרומת דם מועשר בלויקוציטים, במקום מלא דם ורידי.
    2. העברת דם לתוך צינור חרוטי 50 מ ל ו לדלל 1:2 בתוך תמיסת מלח פוספט buffered (PBS). בזהירות להוסיף 10 מ של Ficoll-בינוני (צפיפות 1.077 g/mL) כשכבה תחתונה תחת דם מדולל. Centrifuge המדגם (800 x g למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, ללא בלמים).
    3. בזהירות להסיר את הצינור לצנטריפוגה ולהעביר את לאטמוספרה המכילות PBMC לתוך צינור חרוטי 50 מ. למחוק את העליונה ואת לשכבה התחתונה. ממלאים את הצינור המכיל PBMC PBS, צנטריפוגה (300 x g 10 דקות ב 4 ° C). הסר את תגובת שיקוע.
      הערה: באופן אופציונלי, במידת הצורך, לבצע פירוק של אריתרוציטים הנותרים. להוסיף בזהירות 3 מ"ל של אמוניום כלוריד-אשלגן מאגר של פירוק (ACP) (pH 7.27; 155 מ מ אמוניום כלוריד; 19 מ מ אשלגן מימן קרבונט ו מ מ 0.68 EDTA) התא resuspended צנפה ואת מערבולת המדגם. לנער את הצינורות במשך 3 דקות. כדי להסיר את המאגר פירוק ACP, להוסיף 40 מ"ל של PBS, צנטריפוגה (300 x g 10 דקות ב 4 ° C). למחוק את תגובת שיקוע.
  2. לטהר CD4+ T תאים באמצעות גרגרי CD4.
    הערה: באופן כללי, ישנם מספר מפיצים של גרגרי מגנטי לטיהור של CD4 האנושי+ תאים, אשר יביא רמות דומות של התא טוהר. מוצר הבחירה צריכה להתבסס על העדפות אישיות. השלבים הבאים של הפרוטוקול (2.2.2–2.2.7) מותאמים ל CD4 המוגדר microbead מוצר ועמודות ההפרדה המתאימים כפי שמצוין נוסף שולחן של חומרים. ייתכן שיהיה צורך מספר שינויים בפרוטוקול במקרה כי מוצר חלופי microbead CD4 נבחרה.
    1. Resuspend בגדר PBMC במינימום של PBS 80 µL המכילה 0.5% סרום שור עוברית (FBS) ו 2 מ מ EDTA (PBS/FBS/EDTA-מאגר) לכל 107 PBMC. שימוש אוכלוסיה ההתחלתי של בערך 30 x 106 PBMC על מנת מקצה את עם 3 x 106 6 x 106 מטוהרים CD4 האנושי+ T תאים.
    2. הוסף 20 µL של גרגרי CD4 לכל 107 PBMC, לערבב בעדינות, תקופת דגירה של 20 דקות ב 4 º C. ממלאים את הצינור PBS FBS/EDTA-מאגר / (מקורר עד 4 ° C), צנטריפוגה (300 x g 10 דקות ב 4 ° C). הסר את תגובת שיקוע.
    3. המקום עמודה ההפרדה לתוך שדה מגנטי. יש לשטוף את העמודה עם 3 מ"ל של PBS/FBS/EDTA-מאגר. Resuspend בגדר תא ב- 500 µL של PBS FBS/EDTA-מאגר / (מקורר עד 4 ° C) והעבר התליה תא אל העמודה ההפרדה שטופים ממוקם בתוך שדה מגנטי.
    4. לשטוף את העמודה ההפרדה שלוש פעמים עם 3 מ"ל של PBS FBS/EDTA-מאגר / (מקורר עד 4 ° C) וזורקים למסקנות.
    5. הסר את העמודה ההפרדה השדה המגנטי ולמקם אותו לתוך צינור 15 מ"ל. Elute של CD4+ תא שבר ב 5 מ של PBS/FBS/EDTA-מאגר באמצעות הבוכנה.
    6. ממלאים את הצינור PBS, צנטריפוגה (300 x g 10 דקות ב 4 ° C). הסר את תגובת שיקוע. חזור על שלב זה כביסה פעמיים.
    7. לקבוע את מספר התאים לא הניבה על ידי שיטה סטנדרטית של בחירה (למשל, נויבאואר קאמרית).
  3. תווית CD4+ T תאים עם צבע התפשטות תא פלורסנט.
    1. Resuspend CD4+ T תאים ב- PBS (עד 107 תאים למ"ל; אל תשתמש µL פחות מ-500 ל- PBS).
    2. להכין פתרון מיקרומטר 6 של שגשוג תאים אור אדום-טמפרמנט לצבוע (ראה טבלה של חומרים) ב- PBS (טרום להתחמם לטמפרטורת החדר). לערבב זה פתרון 1:2 עם לפני מוכן תא הבולם, מערבולת ביסודיות (3 ריכוז סופי מיקרומטר).
    3. תקופת דגירה של 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס (מוגן מפני אור). לאחר מכן, הוסף בחמישה כרכים בינוני RPMI המכיל 10% FBS דגירה למשך 5 דקות על קרח (מוגן מפני אור).
    4. שטיפת שכותרתו תאים שלוש פעמים ב RPMI בינוני המכיל 10% FBS (צנטריפוגה ב x 300 גר' 10 דקות ב 4 ° C). Resuspend תאים עם תוויות PBS, לאחסן בקירור, להגן מפני אור עד השימוש.
      הערה: ממושך אחסון של תאים (> 60 דקות) העלולים להשפיע לרעה על הישרדות cell.
      אופציונלי: לקבוע את הטוהר של CD4+ תא שבר והיעילות של ההליך תיוג על ידי cytometry זרימה. Resuspend 0.5 x 106 עונה 1 פרק 106 CD4+ תאי µL 100 מאגר (1% FBS, 2 מ מ EDTA ב- PBS) ולהוסיף נוגדן נגד CD4 בשילוב עם צבע פלורסנט של בחירה. תקופת דגירה של 30 דקות ב 4 º C. מוסיפים 1 מ"ל מאגר צנטריפוגה (300 x g 10 דקות ב 4 ° C). למחוק את תגובת שיקוע. להמשיך עם cytometric מדידת המדגם (תוצאה נציג מתואר באיור 1ב, ג).

3. adoptively להעביר CD4 האנושי+ T תאים לתוך החשופים פפאין Mmice הנמען

הערה: ראה איור 1A עבור סיכום של ויוו לבצע ניתוח ניסיוני. לבצע העברה תא יום לאחר מתן תוך-אפי האחרונה של פפאין.

  1. להתאים את התליה של CD4 האנושי שכותרתו fluorescently+ T תאים (שלב 2.3.4) ריכוז עונה 1 פרק 107 תאים/מ ב- PBS. מילוי 100 µL של התליה תא לתוך 1 מ"ל/30 G-מזרק.
  2. בזהירות המקום הראשון החשופים פפאין C57BL/6J העכבר (שלבים 1.1-1.3) לתוך התקן ריסון להזרקה וריד הזנב. השתמש במזרק מוכן (שלב 3.1) כדי לנקב את הווריד הזנב ולהזריק לאט µL 100 של התליה תא המכיל 1 x 106 שכותרתו CD4 האנושי+ תאים. לא מיד להוציא את המחט לאחר ההזרקה, אך לחכות 5 שניות נוספות על מנת למנוע פריקה של התליה תא.
  3. שחרר את לחצן העכבר מהתקן ריסון והמשך עם החיה הבאה. לשמור על חיים חשופים פפאין אחד לפחות, אשר אינו עובר העברה עם תאים עם תוויות fluorescently לשמש בקרה שלילית של מיקרוסקופ אור גיליונות זריחה.

4. מכינים את רקמת הריאה של מיקרוסקופ אור גיליונות קרינה פלואורסצנטית

הערה: השלבים הבאים מבוצעות 3 h לאחר העברה של fluorescently שכותרתו תאים אנושיים (שלב 3.2). ניסיוני ההליכים המתוארים כולל קציר של רקמת הריאה, קיבוע ורקמות ממס מבוסס ניקוי היו ממאמרו של הפרוטוקולים כיום מתואר24,28.

  1. להקריב את העכבר על ידי שאיפת פחמן דו-חמצני (C02).
  2. Perfuse הריאה באתרו עם PBS המכיל 5 מ מ EDTA.
    1. לפתוח את בית החזה באמצעות חיתוך לאורך עצם החזה כדי לחשוף את הלב. Punctate החדר הימני עם בצינורית 21 G מחובר צנתר.
    2. פתח החדר השמאלי על ידי חיתוך, ובכך לאפשר את נוזל הדם זלוף לצאת. לאט לאט perfuse הריאה עם 20 מ של PBS קר כקרח המכיל 5 מ מ EDTA דרך הקטטר.
  3. על מנת לבצע קיבוע באתרו של הריאה, אל תסיר את הצנתר החדר הימני. לאט לאט perfuse הריאה עם 2 מ של paraformaldehyde 4% קר כקרח (PFA) נפתר ב- PBS. הסר את הצנתר את הצינורית.
    הערה: מבוסס-PFA קיבוע באתרו של רקמת הריאה מייצג טכניקה ומבוססת על מנת להתכונן רקמת הריאה מאתר לאחר מכן ניתוח מיקרוסקופי29,30.
    התראה: כדורגלן הוא רעיל ויש לטפל ברדס בזהירות.
  4. למלא את הריאות agarose 0.75% באתרו.
    1. להכין agarose 0.75% ב- PBS ולשמור אותו מוצק ב 50 מעלות צלזיוס ב התרמו-שייקר עד השימוש. הסרת בלוטות הרוק של העכבר, לחתוך את השריר sternohyoid ולחשוף את קנה הנשימה על ידי הזזה של מלקחיים מתחת.
    2. תנקד את קנה הנשימה חשוף עם מחט 30 G ולהחליף אותו על ידי צנתר 30 G בוטה כדי למנוע נזק נוסף של קנה הנשימה וכתוצאה מכך זליגת רצויה של agarose. חותם הצומת בין הקטטר שנוספו קנה הנשימה באמצעות בעל מחט.
      אופציונלי: לשלב הכאן את תיאר נוהל עם אוסף BAL לנתח הסתנן תאים אנושיים ב BAL לאחרונה שמתואר לפרטים31 (ראה איור 2E לתוצאות נציג).
    3. בזהירות למלא את דרכי הנשימה עם agarose 0.75% (התקררה לטמפרטורת הגוף) דרך הקטטר עד התפתחות מלאה של הריאות; לחכות עד ייבוש מלא של agarose. להסיר את הצנתר ולקצור בקפידה את הריאה בשפופרת החשוך mL 2 מלא עם 4% מחברים.
  5. עבור קיבוע נוסף דגירה המדגם ב 4% PFA נפתר ב- PBS עבור 2 h ב 4 ° C תחת סיבוב רציף (31 סל ד).
  6. מייבשים רקמות על ידי לאחר מכן המקננת הדגימה תחת סיבוב רציף (31 סל ד) ב 4 ° C ב- 50% אתנול (pH 9), 70% אתנול (pH 9) ו- 100% אתנול; כל שלב במשך לפחות 4 שעות. בסוף, ביצוע של דגירה השני אתנול 100% טריים במשך 4 שעות.
  7. לבצע סליקה ממס מבוסס של הרקמה באמצעות אתיל cinnamate (ECi). לכן, להעביר את הדגימה ECi. דגירה לילה בטמפרטורת החדר (תחת סיבוב קבוע) להופעת רקמת שקוף (ראה איור 1D עבור להחליפן בתמונות).
    הערה: דוגמאות המאוחסן ב- ECi בטמפרטורת החדר (מוגן מפני אור) יציבים במשך מספר שבועות עד חודשים.

5. ביצוע מיקרוסקופ אור גיליונות זריחה של אונות הריאה מאתר Wwhole

הערה: נא עיין טבלה של חומרים לפרטים על מיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות, התוכנה המתאימים, שעליו מבוססים בשלבים הבאים. מערכות דומות על ידי יצרנים אחרים, עם זאת, ניתן להשתמש גם עם שינויים ספציפיים מפתח של פרוטוקול הבאים. לפני שמתחילים, עירכו היכרות עם מדריכי הפעלה ספציפית מיקרוסקופ ובצע את ההוראות טכני על ידי האדם אחראי באתר.

  1. בצע כיוונון מיקרוסקופ אור גיליונות.
    1. הפעלת מיקרוסקופ אור גיליונות ופתח המתאימה imaging התוכנה במחשב. למלא את התא מדגם ECi מסוננים (מסנן 100 מיקרומטר) ומקם אותה במיקומה בין הקורות לייזר.
    2. השתמש טיפה קטנה של דבק יציב הממס האורגני מקל הריאה אל המחזיק לדוגמה. כדי לשמור את עומק החדירה נדרש הסדינים האור קטן ככל האפשר, הגדר האונה ריאות זקוף. בשלב הבא, מקום בעל מדגם בחדר שלה.
    3. הגדר את מקדם שבירה של המטרה 3.5 בעת שימוש ECi כמו ניקוי מגיב.
  2. לכוונן הגדרות במיקרוסקופ אור גיליונות כדי לזהות תאים אנושיים בהקשר של האיבר כולו.
    1. בחר לייזרים הנדרש (מסנן עבור מדידה > להפעיל את תיבות הסימון של לייזרים נדרש) ובחר עוצמות המתאים תוכנת שליטה (לייזר בקרת שידור > השתמש במחוון כדי להגדיר לייזר בעוצמה > החל). השתמש של גל עירור של 488 ננומטר (מסנן 525/50) כדי לזהות רקמת הריאה autofluorescent, 640 nm (מסנן 680/30) כדי לעורר תאים אנושיים המסומנת fluorophore פולטות בספקטרום אדום.
    2. להתמקד המדגם מתרגשים לקראת 488 ננומטר ולהתאים את המוקד באמצעות הכלי 'תיקון כרומטי'-אורך הגל עירור של 640 nm (השתמש במחוון כדי להגדיר תיקון כרומטית > להחיל).
    3. בחר גורם זום המתאים; השתמש סקירה הגדלה נמוכה (למשל, 6.3 x) כדי לקבוע את חלוקת תאים עם תוויות בתוך רקמת הריאה ותמונות מוגדל (למשל, 32 x) הכוללת בלוקאליזציה מפורט.
    4. בחר רוחב הגיליון בצורה אחידה שחקרתי את כל האיבר או מקטע מסוים עניין (אופטיקה > השתמש במחוון כדי להגדיר רוחב גיליון; בדרך כלל בין 20-40%). הגדר את גליון מספרי הצמצם (NA) עם נה גבוהה יותר ביצירת תמונות חדות יותר (אופטיקה > השתמש במחוון כדי להגדיר NA גיליון; עבור האונה מאתר הריאה התרחב לגודלו פיזיולוגיים נה של 0.025% יכול לשמש לעתים קרובות).
    5. בחר את מספר גליונות אור כדי לשמש תחת 'הגדרות מדידה מתקדמים'. במקרה של דו-כיווניות תאורה, מיזוג ימינה ושמאלה גליונות אור כדי ליצור תמונה למשל מואר (מתקדמים > מיזוג lightsheets > בחר למזג מצב > להשתמש במחוונים כדי להגדיר החפיפה בין שני גליונות אור).
      הערה: מומלץ לנצל ההארה דו-כיווני המדגם עם שלושה אור גליונות בכל.
      אופציונלי: כדי להגביר עוד יותר את איכות התמונה, השתמש בפעולה מיקוד דינמי. זה מאפשר להעביר את המוקד x-כיוון במהלך ייבוא תמונות.
    6. להגדיר עמדות התחלה וסיום של z-המחסנית להיות נמדד, קבע את גודל שלב 5 מיקרומטר (Z xyz-טבלה > סרוק טווח).
      הערה: עמדות התחלה וסיום של z-מחסנית תלויים בגודל ובמיקום של האונה ריאות בתוך תא הדגימה. עם זאת, בערך 800 300 z-במחסן נרכשים בדרך כלל עבור האונה ריאה בודדת (5 µm גודל צעד).
    7. שמירת קבצים בעזרת 'שמירה אוטומטית הגדרות' ולהתחיל מדידה כדי ללכוד תמונות. לאחר ייבוא נתונים גימור, לנקות את ECi שזוהמו בעל מדגם והרכבים תחת מים זורמים.
      הערה: להשתמש באותן ההגדרות תמונה מספר אונות הריאה שאמורים להיות מושווה לאחר מכן.

6. פוסט תמונה עיבוד של כימות של צבר-ריאות תאים אנושיים

הערה: נא עיין טבלה של חומרים לקבלת פרטים על תוכנת הדמיה שלאחר ניתוח תלת-ממד, שעליו מבוססים בשלבים הבאים. עם זאת, חלופה פוסט-הדמיה תוכנות יכול לשמש גם כן.

  1. לטעון את התמונה הראשונה של z-מחסנית (הפעילו את כפתור surpass, קובץ > פתח > בחר תמונה) על מנת ליזום הפתיחה של כל תמונות אחרות של הערימה-z שבחרת ושחזור אוטומטיים 3D שלהם.
  2. כדי להבטיח תצוגה תקינה של x, y ו- z מידות, לבדוק voxel גדלים ולהתאים אותם במידת הצורך (עריכה > תמונה מאפיינים > להזין באופן ידני voxel בגודל). עבור גודל voxel z, הזן את גודל הצעד שבחרת בין שתי תמונות (כאן 5 מיקרומטר).
  3. להציג לכל ערוץ צבע ברורים (עריכה > הצג תצוגה התאמה). לחץ על כל ערוץ אחד אחרי השני כדי להגדיר צבע של בחירה ( איור 2A, B, C, D האות autofluorescence הוא מוצג באפור ומתויגים CD4 האנושי+ תאים בצבע אדום).
  4. כוונון עוצמת, רמת השחור והחדות לכל ערוץ (לערוך > הצג תצוגה התאמה) באמצעות המשולשים בברים ערוץ או הזנת מספרים מדוייקים בהגדרות של הערוץ. התאמת עוצמת, להשתמש של משולש ישר-זווית. עבור התאמת רמת השחור, להשתמש המשולש השמאלי, החדות, להשתמש המשולש האמצעי.
    הערה: שימוש הריאה נגזר שליטה בעכבר ללא מעבר תאים (שלב 3.3) כדי להבדיל בין אותות מסוימים נגזר התא האנושי ואת הרקע לא ספציפי.
  5. כדי לכמת תאים עם תוויות בתוך רקמת הריאה להשתמש 'להוסיף נקודות חדש' בסרגל הכלים, בחר 'דלג על יצירה אוטומטית, לערוך באופן ידני' לספירת תא ידנית.
    הערה:     לחילופין, להשתמש התא אוטומטי ספירת כלי תחת 'מקומות'. עם זאת, ספירה ידנית מאפשרת להבחין בין סימנים ספציפיים, לא ספציפי בצורה מדויקת יותר.
    1. כדי להשוות את הצטברות תאים אנושיים מדגמים שונים, הגדרת קוביה ריאות עם אחסון מסוים באמצעות הכלי חיתוך תלת-ממד (עריכה > חיתוך תלת-ממד) (כאן 813 μm x 813 μm x 1,000 μm).
    2. כדי לספור תאים שהצטברו בחר בערוץ nm 640 ולהגדיר מידה רדיוס של 10 מיקרומטר. לאחר מכן, לחץ על 'ערוך', בדוק 'בחר' בתפריט מצביע ולסמן כל תא עם נקודה באמצעות shift-לחץ עם לחצן העכבר השמאלי. למצוא את המספר הכולל של תאי שנספרו מוצגים הנתונים הסטטיסטיים.
      הערה: מומלץ מאוד כדי לספור את מספר קוביות לכל ריאה האונה (חמישה כאן) כדי להבטיח אמינות התוצאות וכדי לפצות לבחירה מדען תלויי נפח הריאות שנספרו (כימות אסטרטגיה ונציג תוצאות מתוארים ב- איור דו-ממדי).
  6. לכידת תמונה באמצעות הכלי 'תצלום בזק' ו/או לקחת וידאו באמצעות הכלי 'הנפשה'. שמור מותאם קבצים כקבצי .ims (קובץ > ייצוא).
    הערה: למטרות נציג, להציג או להסתיר את המסגרת על-ידי בדיקת או ביטול הסימון של המסגרת בסרגל הכלים. בנוסף, תצוגת תמונות כמו הטלה בעוצמה מירבית (MIP) גם (הכלים > נפח > מצב > בדוק MIP) או להשתמש את 'מצב השטח' (הכלים > להוסיף משטחים חדשים). 'מצב השטח' חייב להיות מופעל בנפרד לכל ערוץ לסמן רקמות אדריכלות ו/או גוף התא (להחליפן בתמונות מוצגות באיור 2C).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פרוטוקול הציג מתאר מודל העכבר ניסיוני, אשר מאפשר ניטור וכימות ההצטברות של לימפוציטים T אנושיים הועבר adoptively בריאה באמצעות מיקרוסקופ אור גיליונות זריחה. איור 1 א מעניק סקירה סכמטי של השלבים ויוו של לוח הזמנים ניסיוני. על מנת להבטיח תוצאות אמינות, הוא בעל חשיבות משמעותית כדי להבטיח באיכות טובה מבודד, fluorescently שכותרתו CD4 האנושי+ T תאים, אשר לאחר מכן יועברו לתוך עכברים. כמו representatively מתוארים איור 1ב, ג, ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ההגדרה ניסיוני שתואר כאן מספק ההזדמנות כדי לפקח על ביות ריאות של תאים חיסוניים האנושי הראשי תחת התנאים דלקתית ויוו, ובכך relevantly משלים בסגנון קלאסי הופיעה אדהזיה במבחנה כימוטקסיס מבחני. כדי לקחת בחשבון מאפיינים איבר אנטומי ספציפי של הריאה, היבטים חשובים של תאים חיסוניים ביות (כולל הפצה כימוטקסיס ותא בתוך איבר היעד) כמו גם הרלוונטיות הקלינית ואת transferability של הנתונים שהושגו, לקחנו היתרון של שלוש תכונות מרכזיות טכני: (1) הניתוח של תאים אנושיים העיקרי בתוך אורגניזם חי מאתר; (2) בתיווך פפ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

M.F. נוירת שימש כיועץ עבור Pentax, ג'וליאני, MSD, Abbvie, ינסן, טקדה ו- Boehringer. המחברים הנותרים לא יחשוף בכל סכסוך.

תודות

המחברים להכיר בהכרת תודה מימון על ידי 1181 SFB של מרכזי מחקר DFG שיתופי trr ב 241. אופטי הדמיה מרכז ארלאנגן (OICE) ואת מסוים ראלף Palmisano, פיליפ Tripal, טינה Fraaß (פרוייקט Z2 של 1181 CRC DFG) הם הכירו עבור מומחה תמיכה טכנית עבור הדמיה מיקרוסקופי אור גיליונות זריחה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Agarose NEEO UltraCarl Roth GmbH + Co. KG, קרלסרוהה, גרמניה2267.4
AlexaFlour594 נוגדן CD45 אנטי אנושיBioLegend, סן דייגו, ארה"ב304060
אמוניום כלורידCarl Roth GmbH + Co. KG, קרלסרוהה, גרמניהK2981
צינורית 21 Gבקטון, דיקינסון ושות', פרנקלין לייקס, ארה"ב301300
צבע שגשוג תאים eflour670eBioscience Inc., סן דייגו, ארה"ב65-0840-85
CD4 MicroBeads, humanMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, גרמניה130-045-101
EDTA (חומצה אתילנדיאמינטטראצטית)Carl Roth GmbH + Co. KG, קרלסרוהה, גרמניה8043.1
צינור איסוף דם אשלגן-EDTA, 9 מ"לSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, גרמניה21066001
Ethly cinnamate (ECi)Sigma-Aldrich, Steinheim, גרמניה112372-100G
אתנול ≥ 99.5% (EtOH)Carl Roth GmbH + Co. KG, קרלסרוהה, גרמניה5054.3
FBS (סרום בקר עוברי) Good FortePAN-Biotech GmbH, Aidenbach, גרמניהP40-47500
מסנן 100 ומיקרו; מ VWR International גרמניה GmbH, דרמשטדט, גרמניה732-2758
Imaris תוכנת ניתוח תמונה 9.0.2Bitplane AG, ציריך, שוויץn.a.ImspectorPro
softwareAbberior Instruments GmbH, Gö ttingen, גרמניהn.a.Ketamin
 Inresa Arzneimittel GmbH , פרייבורג, גרמניה3617KET-V
LaVision UltraMicroscope IILaVision BioTec GmbH, בילפלד, גרמניהn.a.MACS
MultiStandMiltenyi Biotech GmbH, ברגיש-גלדבאך, גרמניה130-042-303
צינורית Multifly 20 GSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, גרמניה851638035
מחט 30 GB. Braun Melsungen AG , Melsungen , הסן, גרמניה9161502
תא הספירה של נויבאוארneoLab Migge GmbH , היידלברג, גרמניהC-1003
Pattex GlueHenkel AG & ושות', Dü סלדורף, גרמניהPSK1C
LS columnMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, גרמניה130-042-401
אמצעי הפרדת לימפוציטים (צפיפות 1,077 גרם/מ"ל)anprotecAC-AF-0018
PapainMerck1,071,440,025
PBS Dulbecco (מי מלח חוצץ פוספט)Biochrom GmbH, ברלין, גרמניהL182-10
PerCP/Cy5.5 אנטי-אנושי CD4BioLegend, סן דייגו, ארה"ב317428
עכבר PerCP/Cy5.5 IgG2b, κ איזוטיפ CtrlBioLegend, סן דייגו, ארה"ב400337
PFA (פרפורמלדהיד)Carl Roth GmbH + Co. KG, קרלסרוהה, גרמניה0335.1
אשלגן מימן פחמתיCarl Roth GmbH + Co. KG, קרלסרוהה, גרמניהP7481
פיפטה סרולוגית 10 מ"לSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, גרמניה86.1254.001 
מזרק 1 מ"לB. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, גרמניה9166017V
מזרק 5 מ"לBecton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA260067
מזרק 20 מ"לBecton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USAצינור 260069
1.5 מ"לSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, גרמניה72,706,400
Tube 2 mLSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, גרמניה72.695.400 
צינור 2 מ"ל, חוםSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, גרמניה72,695,001
שפופרת 15 מ"לSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, גרמניה62.554.502 
צינור 50 מ"לSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, גרמניה62.547.254 
QuadroMACS SeparatorMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany(130-090-976
Xylazin (Rompun 2%)Bayer Vital GmbH, Leverkusen, GermanyKPOBD32

מקורות

  1. Medoff, B. D., Thomas, S. Y., Luster, A. D. T cell trafficking in allergic asthma: the ins and outs. Annual Review of Immunology. 26, 205-232 (2008).
  2. Baraldo, S., Lokar Oliani, K., Turato, G., Zuin, R., Saetta, M. The Role of Lymphocytes in the Pathogenesis of Asthma and COPD. Current Medicinal Chemistry. 14 (21), 2250-2256 (2007).
  3. Mikhak, Z., Strassner, J. P., Luster, A. D. Lung dendritic cells imprint T cell lung homing and promote lung immunity through the chemokine receptor CCR4. Journal of Experimental Medicine. 210 (9), 1855-1869 (2013).
  4. Thomas, S. Y., Banerji, A., Medoff, B. D., Lilly, C. M., Luster, A. D. Multiple chemokine receptors, including CCR6 and CXCR3, regulate antigen-induced T cell homing to the human asthmatic airway. Journal of Immunology. 179 (3), 1901-1912 (2007).
  5. Katchar, K., Eklund, A., Grunewald, J. Expression of Th1 markers by lung accumulated T cells in pulmonary sarcoidosis. Journal of Internal Medicine. 254 (6), 564-571 (2003).
  6. Wu, Z., et al. Mast cell FcepsilonRI-induced early growth response 2 regulates CC chemokine ligand 1-dependent CD4+ T cell migration. Journal of Immunology. 190 (9), 4500-4507 (2013).
  7. Hart, P. H. Regulation of the inflammatory response in asthma by mast cell products. Immunology, Cell Biology. 79 (2), 149-153 (2001).
  8. Bice, J. B., Leechawengwongs, E., Montanaro, A. Biologic targeted therapy in allergic asthma. Annals of Allergy & Asthma & Immunology. 112 (2), 108-115 (2014).
  9. Barnes, N., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled study of the CRTH2 antagonist OC000459 in moderate persistent asthma. Clinical & Experimental Allergy. 42 (1), 38-48 (2012).
  10. Medoff, B. D., et al. CD11b+ myeloid cells are the key mediators of Th2 cell homing into the airway in allergic inflammation. Journal of Immunology. 182 (1), 623-635 (2009).
  11. Oeser, K., Maxeiner, J., Symowski, C., Stassen, M., Voehringer, D. T. T cells are the critical source of IL-4/IL-13 in a mouse model of allergic asthma. Allergy. 70 (11), 1440-1449 (2015).
  12. Freeman, C. M., Curtis, J. L., Chensue, S. W. CC chemokine receptor 5 and CXC chemokine receptor 6 expression by lung CD8+ cells correlates with chronic obstructive pulmonary disease severity. The American Journal of Pathology. 171 (3), 767-776 (2007).
  13. Kallinich, T., et al. Chemokine-receptor expression on T cells in lung compartments of challenged asthmatic patients. Clinical & Experimental Allergy. 35 (1), 26-33 (2005).
  14. Vasakova, M., et al. Bronchoalveolar lavage fluid cellular characteristics, functional parameters and cytokine and chemokine levels in interstitial lung diseases. Scandinavian Journal of Immunology. 69 (3), 268-274 (2009).
  15. Campbell, J. J., et al. Expression of chemokine receptors by lung T cells from normal and asthmatic subjects. Journal of Immunology. 166 (4), 2842-2848 (2001).
  16. Halwani, R., et al. IL-17 Enhances Chemotaxis of Primary Human B Cells during Asthma. PLoS One. 9 (12), 114604(2014).
  17. Agostini, C., et al. Cxcr3 and its ligand CXCL10 are expressed by inflammatory cells infiltrating lung allografts and mediate chemotaxis of T cells at sites of rejection. The American Journal of Pathology. 158 (5), 1703-1711 (2001).
  18. Ainslie, M. P., McNulty, C. A., Huynh, T., Symon, F. A., Wardlaw, A. J. Characterisation of adhesion receptors mediating lymphocyte adhesion to bronchial endothelium provides evidence for a distinct lung homing pathway. Thorax. 57 (12), 1054-1059 (2002).
  19. Radeke, H. H., Ludwig, R. J., Boehncke, W. H. Experimental approaches to lymphocyte migration in dermatology in vitro and in vivo. Experimental Dermatology. 14 (9), 641-666 (2005).
  20. Miles, A., Liaskou, E., Eksteen, B., Lalor, P. F., Adams, D. H. CCL25 and CCL28 promote alpha4 beta7-integrin-dependent adhesion of lymphocytes to MAdCAM-1 under shear flow. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 294 (5), 1257-1267 (2008).
  21. Zundler, S., et al. The alpha4beta1 Homing Pathway Is Essential for Ileal Homing of Crohn's Disease Effector T Cells In vivo. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 379-391 (2017).
  22. Verbist, K. C., Cole, C. J., Field, M. B., Klonowski, K. D. A role for IL-15 in the migration of effector CD8 T cells to the lung airways following influenza infection. Journal of Immunology. 186 (1), 174-182 (2011).
  23. Kopf, M., Abel, B., Gallimore, A., Carroll, M., Bachmann, M. F. Complement component C3 promotes T-cell priming and lung migration to control acute influenza virus infection. Nature Medicine. 8 (4), 373-378 (2002).
  24. Zundler, S., et al. Three-Dimensional Cross-Sectional Light-Sheet Microscopy Imaging of the Inflamed Mouse Gut. Gastroenterology. 153 (4), 898-900 (2017).
  25. Mzinza, D. T., et al. Application of light sheet microscopy for qualitative and quantitative analysis of bronchus-associated lymphoid tissue in mice. Cellular & Molecular Immunology. , (2018).
  26. Erturk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. Journal of Visualized Experiments. (89), 51382(2014).
  27. Morita, H., et al. An Interleukin-33-Mast Cell-Interleukin-2 Axis Suppresses Papain-Induced Allergic Inflammation by Promoting Regulatory T Cell Numbers. Immunity. 43 (1), 175-186 (2015).
  28. Mann, L., Klingberg, A., Gunzer, M., Hasenberg, M. Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (123), 55450(2017).
  29. Mercer, R. R., et al. Extrapulmonary transport of MWCNT following inhalation exposure. Particle and Fibre Toxicology. 10, 38(2013).
  30. Minton, C., et al. Demonstration of microvessel networks and endothelial cell phenotypes in the normal murine lung. Journal of Nippon Medical School. 72 (6), 314-315 (2005).
  31. Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), 55398(2017).
  32. Fischer, A., et al. Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
  33. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).
  34. Brehm, M. A., Jouvet, N., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Humanized mice for the study of infectious diseases. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 428-435 (2013).
  35. Wege, A. K. Humanized Mouse Models for the Preclinical Assessment of Cancer Immunotherapy. BioDrugs. , (2018).
  36. Jespersen, H., et al. Clinical responses to adoptive T-cell transfer can be modeled in an autologous immune-humanized mouse model. Nature Communications. 8 (1), 707(2017).
  37. Schloder, J., Berges, C., Luessi, F., Jonuleit, H. Dimethyl Fumarate Therapy Significantly Improves the Responsiveness of T Cells in Multiple Sclerosis Patients for Immunoregulation by Regulatory T Cells. International Journal of Molecular Sciences. 18 (2), (2017).
  38. Murdoch, C., Finn, A. Chemokine receptors and their role in inflammation and infectious diseases. Blood. 95 (10), 3032-3043 (2000).
  39. Rivera-Nieves, J., Gorfu, G., Ley, K. Leukocyte adhesion molecules in animal models of inflammatory bowel disease. Inflammatory Bowel Diseases. 14 (12), 1715-1735 (2008).
  40. Zundler, S., Neurath, M. F. Novel Insights into the Mechanisms of Gut Homing and Antiadhesion Therapies in Inflammatory Bowel Diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (4), 617-627 (2017).
  41. Halim, T. Y., Krauss, R. H., Sun, A. C., Takei, F. Lung natural helper cells are a critical source of Th2 cell-type cytokines in protease allergen-induced airway inflammation. Immunity. 36 (3), 451-463 (2012).
  42. Kamijo, S., et al. IL-33-mediated innate response and adaptive immune cells contribute to maximum responses of protease allergen-induced allergic airway inflammation. Journal of Immunology. 190 (9), 4489-4499 (2013).
  43. Milne, J., Brand, S. Occupational asthma after inhalation of dust of the proteolytic enzyme, papain. British Journal of Industrial Medicine. 32 (4), 302-307 (1975).
  44. Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
  45. Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. The International Journal of Biochemistry, Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
  46. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  47. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
  48. Looney, M. R., Bhattacharya, J. Live imaging of the lung. Annual Review of Physiology. 76, 431-445 (2014).
  49. Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).
  50. Headley, M. B., et al. Visualization of immediate immune responses to pioneer metastatic cells in the lung. Nature. 531 (7595), 513-517 (2016).
  51. Hammad, H., et al. House dust mite allergen induces asthma via Toll-like receptor 4 triggering of airway structural cells. Nature Medicine. 15 (4), 410-416 (2009).
  52. Bose, O., et al. Mast cells present protrusions into blood vessels upon tracheal allergen challenge in mice. PLoS One. 10 (3), 0118513(2015).
  53. Galkina, E., et al. Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

TT CD4
הדמיה של לימפוציטים אנושיים יונת ריאות ב ניסיוני במודל Vivo של דלקת אלרגית בהתבסס על מיקרוסקופ אור גיליונות מתקדמות
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.