העברת רטרוגרדית חלבונים מהמשטח תא גולג'י הוא חיוני כדי לשמור על הומאוסטזיס ממברנה. כאן, אנו מתארים שיטה לנתח מבחינה ביוכימית תא השטח-כדי-גולג'י הובלה של חומרים באמצעות functionalized nanobodies בתאים הלה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ניתוח של ספיגת Endocytic ותעבורה רטרוגרדית לרשת הטרנס-גולג'י באמצעות Functionalized Nanobodies בתאים בתרבית
במאמר זה
סיכום
תקציר
הובלה של חלבונים וממברנות מהמשטח תא גולג'י ומעבר חיוני הומאוסטזיס, זהות אברון, פיזיולוגיה. ללמוד תנועה רטרוגרדית חלבון, לאחרונה פיתחנו ערכת כלים מגוונים מבוססי nanobody לנתח תחבורה מהמשטח תא למתחם גולג'י, או על ידי תא קבוע ולחיות הדמיה, באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים, או מבחינה ביוכימית. אנחנו מהונדסים חלבון פלואורסצנטי ירוק אנטי functionalized (GFP) nanobodies — חלבון קטן, monomeric, גבוהה-זיקה קלסרים — כי ניתן להחיל על שורות תאים לבטא קרום חלבונים עניין עם moiety-GFP חוץ-תאית. Nanobodies derivatized קשור הכתבים GFP במיוחד הם הפנימו והועברו קמח לאורך נתיבי המיון של הכתבים. Nanobodies היו functionalized עם fluorophores בצע תחבורה רטרוגרדית על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ ולחיות הדמיה, עם ascorbate peroxidase 2 (APEX2) לחקור לוקליזציה ultrastructural של מתחמי כתב-nanobody על ידי אלקטרון מיקרוסקופ, ועם טירוזין מוטיבים sulfation (TS) כדי להעריך קינטיקה של טרנס-גולג'י רשת (TGN) הגעה. במאמר מתודולוגי, אנחנו חלוקה לרמות ההליך כללי bacterially אקספרס ולטהר functionalized nanobodies. אנו מדגימים את השימוש כלי שלנו באמצעות את nanobodies mCherry - ו TS-השתנה כדי לנתח ספיגת endocytic ואת ההגעה TGN של חלבונים מטען רב עוצמה.
מבוא
תנועה רטרוגרדית של חלבונים ושומנים מפני השטח תא אל תאי תאיים שונים הוא קריטי עבור תחזוקה של הומאוסטזיס ממברנה לאזן את הפרשה, למחזר מרכיבי anterograde תחבורה machineries1 , 2. בעקבות הפנמה דרך אנדוציטוזה clathrin תלוית או - עצמאית, חלבונים, שומנים בדם מטען קודם לאכלס מוקדם endosomes מהיכן שהם נמצאים רחוק הופנה גם לאורך מערכת אנדו-lysosomal, ממוחזר כדי קרום פלזמה, . או יישוב לרשת הטרנס-גולג'י (TGN). מיחזור endosomes ו/או על פני התא כדי TGN זה חלק מהמחזוריות פונקציונלי של מספר anterograde מטען transmembrane רצפטורים, כגון הקטיון תלוית ועצמאי הקטיון מנוז-6-פוספט הקולטנים (CDMPR ו- CIMPR) אספקת לאחרונה מסונתז hydro....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. חיידקי טרנספורמציה עם Functionalized Nanobodies
הערה: פרוטוקול זה הותאם עבור הביטוי, טיהור, ניתוח של nanobodies נגד functionalized-GFP כפי שתואר לעיל30. Derivatization עם moieties חלבונים אחרים עשויים לדרוש שינוי של הפרוטוקול הסטנדרטי.
- להפשיר חיידקים chemocompetent (~ 100 µL) מתאים ביטוי חלבון (כגון Escherichia coli רוזטה BL21 (DE3) תאים) על-ידי הצבתם על קרח.
הערה: להכין chemocompetent תאים חיידקיים על פי הנהלים מעבדה סטנדרטיים. לחלופין, תאים חיידקיים כשיר מבחינה כימית ניתן לרכוש באופן מסחרי. - להוסיף 50 ng של פלסמיד קידוד functionalized nanobodies. כ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
לחקור חלבונים רטרוגרדית תחבורה ליעדים תאיים שונים, הקמנו לאחרונה כלי מבוסס-nanobody anti-GFP כדי תווית ובצע פיוז'ן רקומביננטי חלבונים מן השטח תא30. . הנה, נדגים לייצור חיידקים כגון derivatized nanobodies ומדגימים את היישום שלהם ללמוד ספיגת endocytic על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, immunoblotting, כמו גם השימוש שלהם כדי לחקור את ההגעה TGN על ידי ניתוח sulfation. היישום האחרון הוא המוקד מתודולוגי של פרוטוקול זה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
Nanobodies מייצג את שיעור המתעוררים של חלבון פיגומים קלסר עם יתרונות רבים על פני נוגדנים קונבנציונלי: הם קטנים, יציבה, monomeric, ניתן לבחור עבור דיסולפידי זיקה וחוסר גבוהה אג ח33,35, 44 , 45. הם משמשים במספר יישומים, כגון מערכות התרבות תאים, אורגניזמים ב ביולוגיה התפתחותית46,47,48,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי גרנט 31003A-162643 על ידי קרן המדע הלאומית השוויצרית. אנו מודים ניקול Beuret, את Biozentrum הדמיה הליבה מתקן (IMCF) לקבלת תמיכה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| נוגדן נגד GFP | Sigma-Aldrich | 118144600001 | המוצר מופץ על ידי Sigma-Aldrich, אך מיוצר על ידי Roche |
| Anti-His6 נוגדן | Bethyl Laboratories | A190-114A | |
| נוגדן נגד אקטין | EMD Millipore | MAB1501 | |
| עיזים נגד ארנב HRP | Sigma-Aldrich | A-0545 | |
| עז נגד עכבר HRP | Sigma-Aldrich | A-0168 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | מומס ב-1x PBS/1% BSA |
| דימתיל סולפוקסיד (DMSO) | Applichem | A3672 | |
| D-biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | מומס בסטרילי 500 מ"מ NaH2PO4 or DMSO |
| 5-aminolevuilnic acid (dALA) הידרוכלוריד | סיגמא-אולדריץ' | A3785 | מומס במים סטריליים |
| DNase I | Applichem | A3778 | מומס במים סטריליים |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | 18037059001 | המוצר מופץ על ידי Sigma-Aldrich, אך מיוצר על ידי Roche |
| Brefeldin A (BFA) | Sigma-Aldrich | B5936 | |
| Puromycin | Invivogen | ant-pr-1 | |
| פניצילין/סטרפטומיצין | Bioconcept | 4-01F00-H | |
| L-גלוטמין | Applichem | A3704 | |
| Dulbecco' s שונה Eagle' s בינוני (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| סרום עגל עוברי (FCS) | Biowest | S181B-500 | |
| גופרית-35 בצורת נתרן גופרתי | מוצר Hartmann Analytics | ARS0105 | מכיל 5 mCi |
| מלחים מאוזנים של ארל | תמיסת חומצות אמינו Sigma-Aldrich | E6267 | |
| MEM (50x) | Sigma-Aldrich | M5550 | |
| MEM תמיסת ויטמין (100x) | Sigma-Aldrich | M6895 | |
| cOmplete, קוקטייל מעכב מיני פרוטאז | מוצר Sigma-Aldrich | 11836153001 | מופץ על ידי Sigma-Aldrich, אך מיוצר על ידי Roche |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Applichem | A1008 | מומס במים סטריליים, המלאי הוא 1 M |
| מלח דיסודיום קרבניצילין | Applichem | A1491 | מומס במים סטריליים, המלאי הוא 100 מ"ג/מ"ל |
| קנמיצין סולפט | Applichem | A1493 | מומס במים סטריליים, המלאי הוא 100 מ"ג/מ"ל |
| Coomassie-R (כחול מבריק) | Sigma-Aldrich | B-0149 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Applichem | A3813 | |
| אלבומין בסרום בקר (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Ni Sepharose High Performance | GE Healthcare | 17-5268-01 | |
| עמודות GraviTrap שלו GE | Healthcare | GE11-0033-99 | |
| ערכת החיץ שלו | GE Healthcare | GE11-0034-00 | |
| עמודי התפלה חד פעמיים PD10 | Healthcare | GE17-0851-01 | |
| ג'ל Mini-Protean TGX, 4-20%, 15 בארות | ביו-ראד | 456-1096 | |
| דולבקו s תמיסת מלח חוצצת פוספט (DPBS) עם Ca2+/Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| צלחות 35 מ"מ | פלקון | 353001 | |
| 6 בארות | TPP | 92406 | |
| כיסויי זכוכית (מס' 1.5H) | VWR | 631-0153 | |
| פנילמתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF) | Applichem | A0999.0025 | מומס ב-40% DMSO 60% איזופרופנול, מלאי ב-500 מ"מ |
| טריפטון | Applichem | A1553 | |
| תמצית שמרים | Applichem | A1552 | |
| מגנזיום כלוריד הקסהידרט | Merck Millipore | 105833 | מומס במים סטריליים, המלאי הוא 1 M |
| סידן כלוריד דיהידרט | Merck Millipore | 102382 | מומס במים סטריליים, המלאי הוא 1 M |
| נתרן כלורי | Merck Millipore | 106404 | מומס במים סטריליים, המלאי הוא 5 M |
מקורות
- Johannes, L., Popoff, V. Tracing the retrograde route in protein trafficking. Cell. 135 (7), 1175-1187 (2008).
- Bonifacino, J. S., Rojas, R. Retrograde transport from endosomes to the trans-Golgi network. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 7 (8), 568-5....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
