הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Wholemount ב באתרו הכלאה עבור עוברי Astyanax

7.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59114

⸱

2 במרץ 2019

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Cincinnati

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מאפשר הדמיה של ביטוי גנים בעובריים Astyanax cavefish. גישה זו פותחה במטרה למקסם את אות של ביטוי גנים, תוך מזעור צביעת הרקע לא ספציפית.

תקציר

בשנים האחרונות, גנום טיוטה עבור מקסיקני עיוור cavefish (Astyanax mexicanus) שוחררה, לחשוף את זהותם רצף אלפי גנים. מחקר קודם במערכת מודל המתעוררים הזאת באותיות רישיות על חקירות הגנום כולו מקיף זיהו אינספור אתרים תכונה כמותית כמותיים המשויך פנוטיפים שונים הקשורים המערה. עם זאת, היכולת להתחבר הגנים של ריבית הבסיס heritable לשינוי פנוטיפי נשאר אתגר משמעותי. טכניקה אחת זה יכול להקל על הבנה עמוקה יותר של התפקיד של פיתוח באבולוציה troglomorphic הוא היברידיזציה כולה-הר. ניתן ליישם טכניקה זו כדי להשוות בין גנים בין המערה - ואת משטח המגורים טפסים, למנות מועמד גנים שבבסיס QTL הוקמה, לזהות את הגנים של עניין ממחקרים הדור הבא רצפי או לפתח את זה ישירות גישות מבוססות-גילוי. בדו ח זה, אנו מציגים פרוטוקול פשוט, הנתמך על-ידי רשימת תיוג גמיש, אשר ניתן להתאים באופן נרחב לשימוש הרבה מעבר למערכת המחקר הציג. יש לקוות כי פרוטוקול זה יכול לשמש משאב רחבה למען הקהילה Astyanax ומעבר.

מבוא

היברידיזציה באתר היא שיטה נפוצה עבור צביעת רקמות קבוע להמחיש דפוסי ביטוי גנים1. טכניקה זו בוצעה שנים אחרים מסורתי2 שגרתיים3 דגם מערכות, למגוון רחב של מחקרים ביולוגיים. עם זאת, מספר צעדים, ריאגנטים נחוצים לבצע הליך זה בהצלחה. עבור חוקרים אשר מעולם לא ביצע בטכניקה זו, מפעיל את התהליך יכולה להיות מאיימת בשל הצעדים רבים הכרוכים עוד יותר, מהות ההליך ממושך משאיל את עצמו על שגיאות טכניות, אשר עשויה להיות מאתגרת כדי לפתור בעיות.

המטרה הכוללת של מאמר זה היא להציג שיטה פשוטה שיעבד טכניקה זו הכלאה נגיש לקהל רחב. כדי לצמצם את המבוא של שגיאות, אנו מציגים בגישה ישירה התשואות באיכות גבוהה ג'ין ביטוי מכתים, ממזער את האות רקע שאינם ספציפיים. הליך זה דומה גישות אחרות שפותחה במערכות דגם מסורתיים, כגון רזבורה rerio4. כאן, אנו שואפים לקדם יישום זהיר של כל שלב באמצעות רשימת פעולות לביצוע להורדה (1 קובץ משלים), כדי לקדם את יישום זהיר של הפרוטוקול. הרציונל לביצוע פעולה זו היא להקל על הארגון בשלבים רבים הכרוכים בהליך זה. מאמר זה מתאים מהחוקרים המעוניינים בביצוע היברידיזציה כולה-הר בפיתוח עוברי, אך עדיין לא ביצעתי את ההליך. היתרון של הגישה שבחרת עבור חוקרים Astyanax הוא כי זה יש נבדק והוכח cavefish והן morphs דגים השטח, ובכך להקל ביטוי השוואתי ניתוחים. ניתן להשתמש בשיטת שהוצגו על ידי חוקרים מחקרים על Astyanax ומערכות אחרות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) באוניברסיטת סינסינטי (פרוטוקול #10-01-21-01).

1. קיבוע

  1. לבודד את המספר הרצוי של Astyanax mexicanus עוברי מטנק הרבייה ותקן ~ 50 העוברים במועד. אם העוברים גדול וישן, ייתכן צורך לתקן 25 בכל פעם כדי להבטיח קיבוע אפילו.
  2. בהתאם לגיל של העובר, לנצל את השיטה שאושרו על-ידי IACUC של הרדמה. עבור עוברי בוגרים עם מערכת העצבים מתפקדת, להקריב את העוברים דרך יתר הרדמה. בהתאם לכך, מקום עוברי פתרון של tricaine ~ 1% (נאגר ל pH 7.4) כדי למזער את הכאב ואי נוחות עבור האורגניזם.
  3. ברגע העוברים אינם מגיבים למגע, להחליף את מערכת מים המכילים tricaine, וכן להוסיף מ ~ 1 ל 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS, pH 7.4).
  4. הסר את הפתרון PBS, ולהוסיף 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde (PFA). את העוברים בן לילה ב 4 º C.
    התראה: PFA מסוכנים (קרי, זה דליק והוא העור, הריאות מגרה), לטפל.

2. התייבשות

  1. מייבשים את העוברים, להסיר את הפתרון מקבע ולשטוף עם 1 מ"ל ל- PBS. במקום בקבוקונים המכילים העובר בזווית (בין 30° 45°), על פלטפורמה מטרף במהלך השטיפה. ממשיכים לשטוף את העוברים פעמיים, 5 דקות לכל לשטוף.
  2. אם העוברים יש עדיין chorion, למקם את כל העוברים 50 100 מ"מ x 25 מ"מ פטרי, בזהירות לבודד אותם מן chorions באמצעות שני זוגות מלקחיים של שען (למשל, מלקחיים #5) תחת מיקרוסקופ.
    הערה: במהלך השלבים המתוארים להלן, ואת לשארית של הפרוטוקול, בזהירות להסיר את כל נוזל מהשלב הקודם באמצעות נקי, זכוכית פסטר סיליקון לפני הוספת את הפתרון הבא
  3. מייבשים את העוברים בסדרה של שוטף יותר ויותר מרוכז של מתנול (MeOH) המתוארים להלן. דילולים מבוססים על הנפח הכולל 1 מ"ל עם 500 µL של פתרון נכנס כל בקבוקון זכוכית 4 מ"ל. לבצע כל השלבים התייבשות בטמפרטורת החדר (RT) על פלטפורמת בשייקר.
    1. הסר בזהירות את הפתרון PBS. להוסיף פתרון MeOH 25% (250 µL של MeOH) + µL 750 ל- PBS. מנערים בעדינות על מטרף פלטפורמה עבור 5 דקות.
    2. הסר בזהירות את הפתרון MeOH של 25%. להוסיף פתרון MeOH 50% (500 µL של MeOH) + µL 500 ל- PBS. מנערים בעדינות על מטרף פלטפורמה עבור 5 דקות.
    3. הסר בזהירות את הפתרון MeOH של 50%. להוסיף פתרון MeOH 75% (750 µL של MeOH) + µL 250 ל- PBS. מנערים בעדינות על פלטפורמה מטרף למשך 5 דקות.
    4. הסר בזהירות את הפתרון MeOH 75%. להוסיף פתרון MeOH 100% (1 מ"ל של MeOH). מנערים בעדינות על מטרף פלטפורמה עבור 5 דק. חזור על צעד זה 3 פעמים.
  4. בשלב זה, החנות מיובש עוברי, לפי הצורך, ב המבחנות זכוכית ב-20 ° C (לטווח ארוך). לחלופין, להמשיך ישירות יום 1 של הפרוטוקול.

3. יום 1: התייבשות

  1. להשיג עוברי מיובש של המקפיא-20 ° C (או להמשיך ישירות משלב 2.5).
  2. למיין את העוברים באמצעות פיפטה של פסטר. אחד ניתן למיין על בסיס morphotype (קרי, מערת ו/או משטח) ולאחר מספר גנים העריכו ניסוי. ישנם העוברים בדרך כלל לא יותר מ 12 לכל מבחנה פעם ממוינים. כדי לשמור על הארגון, אשתמש בקלטת מעבדה צבעוניים כדי לייעד בקבוקונים, פיפטות כל הגן. עוברי תישאר בבקבוקון אותו לאורך כל פרוטוקול כולו.
    הערה: המקום קצה פיפטה פסטר 100% EtOH לחטא אותה בין משתמש.
  3. הגדר באמבט מים חזק עד 70 ° C כדי לשמש בשלב מאוחר יותר. . בזהירות, למשוך החוצה את MeOH ב צלוחיות של העוברים מיון ולהחליף עם 500 µL של חדש 100% MeOH. לשטוף בקצרה (~ 1 דקות) על פלטפורמת בשייקר.
  4. נתרענן עוברי בריכוז גדל והולך של PBS x 1 עם Tween 20 (PBT, ראה להלן) על פלטפורמת בשייקר. דילולים מבוססים על אמצעי אחסון דילול הסופי של 1 מ"ל עם 500 µL נכנס לכל מבחנה.
    1. להוסיף פתרון PBT 25% (250 µL של PBT, 750 µL של MeOH). מנערים בעדינות על מטרף פלטפורמה עבור 5 דקות.
    2. הסר בזהירות את הפתרון PBT 25%. להוסיף פתרון PBT 50% (500 µL של PBT, 500 µL של MeOH). מנערים בעדינות על מטרף פלטפורמה עבור 5 דקות.
    3. הסר בזהירות את הפתרון PBT 50%. להוסיף פתרון PBT 75% (750 µL של PBT, 250 µL של MeOH). מנערים בעדינות על מטרף פלטפורמה עבור 5 דקות.
    4. הסר בזהירות את הפתרון PBT 75%. להוסיף פתרון PBT 100% (1 מ"ל של PBT). מנערים בעדינות על מטרף פלטפורמה עבור 5 דק. חזור על צעד זה 3 פעמים.

4. יום 1: לעיכול, קיבוע

  1. להכין proteinase של K (PK) פתרון על-ידי הוספת 1 µL של PK (20 מ"ג/מ"ל) 2 מיליליטר PBT.
  2. בציפייה והשלבים, להשיג aliquots הקפוא של מאגרי הכלאה (Hyb - ו Hyb +; ראה משלימה קובץ 2 ו- 3 קובץ משלים), כדורגלן של אחסון-20 ° C.
    1. לאפשר PFA להפשיר-RT.
    2. מקום aliquots של Hyb - ו Hyb + אמבט מים מסתובב של 70 מעלות צלזיוס. מקם כל ריאגנטים, בקבוקונים בתוך קטן "אטם" עם חלק תחתון עם רשת שינוי, בתוך המנגנון אמבט מים צף. פעולה זו מאפשרת תוספת פשוטה והסרה של צינורות, בקבוקונים מהאמבטיה מים של 70 מעלות צלזיוס מסתובב.
  3. בעדינות להוסיף פתרון PK vial(s) של העוברים להבטיח לכל רקמות יהיו מכוסים לגמרי פתרון. לעכל את העוברים ~ 12 דקות ב- PK הפתרון עובד על פלטפורמה ניעור.
    הערה: האורך של מערכת העיכול יכולים להיות מגוונים על-ידי החוקר כדי להבטיח תוצאות מיטביות.
  4. למשוך בעדינות את הפתרון PK, בקצרה להציף את המבחנה עם PBT לדלל כל הנותרים PK.
  5. לצייר את הפתרון PBT והחלף µL 500 של PBT חדש. לאפשר את הפתרון לשטוף על ניעור פלטפורמה עבור 5 דקות.
  6. להרחיק PBT ולהחליף µL 500% 4 המופשרים מחברים. לאפשר את העוברים על תקופת דגירה של 20 דקות על ניעור פלטפורמה ב- RT.
  7. להרחיק את % 4 מחברים, ויטביע בקצרה את המבחנה עם PBT לדלל כל כדורגלן הנותרים. להרחיק את PBT, והחלף µL 500 של PBT טריים. לאפשר עוברי לשטוף למשך 5 דקות על פלטפורמה ניעור. חזור על שלב זה 4 פעמים נוספות.

5. יום 1: Prehybridization

  1. במקום 500 µL של Hyb-פתרון ומחוממת מראש לתוך הבקבוקון. בזהירות הכנס את המבחנה 70 מעלות צלזיוס המים אמבט (בתוך אטמים) מבלי לרעוד, במשך 5 דקות.
  2. לצייר את הפתרון Hyb, להציף את המבחנה עם 500 µL של טרום ומחוממת Hyb + פתרון. מניחים את הצנצנת בחזרה לתוך האמבט מים 70 מעלות צלזיוס ברעידות (40 סל ד). תקופת דגירה של גם 4 שעות, או למשך הלילה.
    הערה: דגירה 4 שעות תניב פרוטוקול באתרו מלאה יימשך 4 ימים בסך הכל. כאן, שלב זה מוצג הדגירה לילה, אשר תניב פרוטוקול שנמשך 5 ימים בסך הכל.

6. יום 2: הכלאה

  1. המקום aliquot של Hyb + מהמקפיא-20 ° C באמבט מים חמים חזק במשך 5 דקות.
  2. להרחיק את Hyb + מ המבחנה והחלף 500 µL של Hyb מראש ומחוממת +. על הפתרון הזה, בזהירות להוסיף 2 µL של RNA בדיקה לכל מבחנה. מערבולת בעדינות את הצנצנת כדי להבטיח הפצה אפילו של המכשיר.
  3. דגירה Hyb + (עם בדיקה נוספת) הפתרון באמבט מים חמים 70 ° C בלילה תוך כדי טלטול-40 סל ד.
    הערה: אפשר להיעזר מחדש Hyb + (עם המכשיר) פתרון. בשביל זה, סעו Hyb + עם החללית הראשונה לרוץ מקפיא-20 ° C, המקום אותו באמבט מים חמים במשך 5 דק החלף Hyb + מיום 1 פרוטוקול עם Hyb + עם בדיקה ולאפשר המקננת בן לילה באמבט מים חמים.

7. יום 3: פתרון הכנה

  1. להכין צינורות microcentrifuge Hyb + המסומנת החללית RNA "ג'ין-של-עניין". הכינו את סדרת דילולים ייעשה שימוש במהלך יום 3.
    1. באמצעות צינורות נפרדת 6, להכין את הבאים סדרת דילולים של Hyb - ו נתרן מלוחים ציטראט (האס, 0 ל- 100%) 1 מ"ל נפח, ובמקום אותם ב- 70 מעלות צלזיוס רועד רשמים: צינור 1 = 100% Hyb-(1 מ"ל של Hyb-): צינור 2 = 25% 2 x SSC (250 µL של 2 x SSC, 750 µL של Hyb-); צינור האס 2 x 3 = 50% (500 µL של 2 x האס, 500 µL של Hyb-); צינור האס 2 x 4 = 75% (750 µL של 2 x האס, 250 µL של Hyb-); צינור האס 2 x 5 = 100% (1 מ"ל של האס x 2); צינור 6 = 100% 0.2 x האס (2 מ"ל של 0.2 x האס).
      הערה: לעמוד על המשמר של הריכוז של האס, כפי שהוא משתנה מ- 2 x 0.2 x.
    2. באמצעות 4 להפריד בין צינורות להכין סדרת דילולים PBT, האס באמצעי אחסון 1 מ"ל הבאים, במקום בגיל RT: צינור 1 = 25% PBT (250 µL של PBT, µL 750 של 0.2 x SSC); צינור PBT 2 = 50% (500 µL של PBT, µL 500 של 0.2 x האס); צינור 3 = 75% PBT (750 µL של PBT, 250 µL של 0.2 x האס); צינור 4 = 100% PBT (1 מ"ל של PBT).
    3. הכן צינור 2 מ ל חומצה maleic מאגר המכיל הפתרון עובד Tween 20 (MABT).
    4. להכין שני צינורות חרוט 15 מ"ל של חסימת פתרון. כל צינור, להוסיף 0.2 גר' ריאגנט חסימה 10 מ"ל של MABT (ראה 4 קובץ משלים). מקום שני צינורות על מיקסר nutating (או פלטפורמה שאכר) עד התפרקה לחלוטין בתמיסה (עד 3 h).

8. יום 3: בדיקה להסרת

  1. לצייר את Hyb + (עם המכשיר) פתרון עם זכוכית פיפטה פסטר והנח אותו לתוך סטרילי, הנקרא צינור microcentrifuge. שומרים על הצינורית הזאת במקפיא-20 ° C לשימוש עתידי (אם תיוג-בדיקה מוצלחת).
  2. להוסיף בזהירות µL 500 של חמה האס/Hyb-דילולים (מסומן להלן). דגירה בכל הפתרונות הבאים למשך 10 דקות כל באמבט מים חזק 70 מעלות צלזיוס.
    1. דגירה ברצף עם 100% Hyb-(1 מ"ל של Hyb-), 25% 2 x SSC (250 µL של 2 x SSC, 750 µL של Hyb-), 50% 2 x SSC (500 µL של 2 x SSC, 500 µL של Hyb-), 75% 2 x SSC (750 µL של 2 x SSC, 250 µL של Hyb-), 100% 2 x SSC (1 מ"ל של 2 x SSC) , 100% 0.2 x SSC (2 מ של 0.2 x SSC).
  3. בעקבות הצעד האחרון, דגירה בכל הפתרונות הבאים למשך 10 דקות. כל incubations הבא יתקיים ב RT על פלטפורמה ניעור: 25% PBT (250 µL של PBT, µL 750 של 0.2 x SSC), 50% PBT (500 µL של PBT, µL 500 של 0.2 x SSC), 75% PBT (750 µL של PBT, 250 µL של 0.2 x SSC) , 100% PBT (1 מ"ל של PBT).
  4. לאחר דגירה 10 דקות, להסיר את 100% PBT, ולהוסיף 500 µL של MABT לתוך כל מבחנה. חזור על שלב זה פעמיים במשך 5 דקות.

9. יום 3: חסימת

  1. הסר MABT כל מבחנה, הצפה עם פתרון חסימה מעורבבים מראש מאחד הצינורות (להכין בשלב 7.1.4). במקום המבחנה על מיקסר nutating עבור ~ 4 h-RT.
  2. להוסיף 2 µL של אנטי-DIG-AP Fab קטעים למבחנה השני של 10 מ"ל חסימת פתרון (להכין בשלב 7.1.4) ו בקצרה מערבולת.
  3. למלא כל בקבוקון כמעט לחלוטין עם חסימת פתרון (~ 5 מ"ל) ומניחים על מיקסר nutating בין לילה במקרר-4 מעלות צלזיוס.

10. יום ד'-MABT שטיפות

  1. להכין בקבוקון מניות של 10% עז נורמלית בסרום (הגדרות) ב MABT (להוסיף 100 µL של המיתרים µL 900 של MABT).
  2. להרחיק את הפתרון חסימה ב כל בקבוקון ולהוסיף 500 µL תערובת המיתרים/MABT לתוך כל מבחנה. לאפשר את העוברים על תקופת דגירה של 25 דקות ב RT על פלטפורמה ניעור.
  3. החלף את התערובת המיתרים/MABT µL 500 של 100% MABT. תקופת דגירה של 30 דקות ב- RT-ניעור פלטפורמה. לבצע שטיפה זו 11 פעמים נוספות במהלך היום כל 30 דקות.
  4. ממלאים את הצנצנת עם 100% MABT, ובמקום על מיקסר nutating לילה ב תא במקרר או ללא הזמנה ב 4 º C.

11. יום 5: בדיקה ויזואליזציה

  1. להכין את aliquot 50 מ של מאגר phosphatase אלקליין (AP) (ראה 5 קובץ משלים). לשלב הבא 50 מ ל צינור חרוטי עטוף בנייר אלומיניום להגביל את החשיפה אור: 5 מ של 1 מ' טריס (pH 9.5), 5 מ של 50 מ מ MgCl2, 5 מ של 1% Tween 20, 5 מ של 1 M NaCl, 30 מ של ddH2O.
  2. להסיר MABT והחלף 1 מ"ל של מאגר AP (הצינור עטופה בנייר כסף). . תן לזה להציף במשך 5 דקות. עושים זאת פעמיים כדי להבטיח הסרה מלאה של MABT.
  3. להסיר את מאגר AP והחלף 1 מ"ל של AP מאגר עם 3.5 μL 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate (BCIP) ו 4.5 μL של ניטרו-כחול tetrazolium (NBT). החלף הטרי AP מאגר/NBT/BCIP לאחר סיום כל שעה עד התגובה. לפקח מקרוב, בדיקת כל 15 דקות, כדי לאפשר את התגובה הגיוון להתקיים עד הרמה הרצויה של צביעת הושגה. אם התמיסה מתחילה להיווצר, להחליף את הפתרון מוקדם יותר.
  4. לעצור את התגובה הגיוון על ידי שטיפה העוברים במאגר AP 100% טריים (ללא NBT/BCIP) 5 דק המשך שטיפות ב- PBT עד רמות אופטימלית של האות (עם כמות מינימלית של צביעת הרקע) מושגות. ממשיכים לשטוף דגימות עם הגדלת דילולים של PBT במאגר AP כדלקמן: 25% PBT (250 μL של PBT, μL 750 מאגר AP), שטיפה עבור 5 דקות; 50% PBT (500 μL של PBT, 500 μL מאגר AP), שטיפה עבור 5 דקות; 75% PBT (750 μL של PBT, μL 250 מאגר AP), לשטוף במשך 5 דקות.
  5. לשטוף עוברי ב ~ 5 מ ל 100% PBT-nutating מיקסר עד רצוי רקע מינימלי מכתים מתמלאת. מעבר החוצה עם PBT טרי מספר פעמים. זה יכול לקחת מספר ימים.
  6. כאשר שטיפה מלאה, תשטוף עוברי ב μL 500 ל- PBS סטרילי על פלטפורמה מטרף. לבצע שטיפה זו פעמיים במשך 5 דקות. לאחר PBS שוטפים, פוסט-לתקן את דגימות μL 500 של 4% מחברים עבור h 1 RT על פלטפורמה מטרף. לחלופין, את בן לילה ב 1 מ"ל של 4% PFA במקרר-4 מעלות צלזיוס.
  7. החלף מקבע את רענן, PBS סטרילי. לבצע שטיפה זו לפחות פעמיים במשך 5 דק המקום העוברים ב ~ 4 מ ל 100% PBS סטרילי, ולאחסן לטווח ארוך ב 4 º C.

12. הדמיה

  1. לפצות צלחת הדמיה בצלחת פטרי באמצעות 3% agarose וטה מאגר.
    הערה: כמויות תלוי כמה לוחות הדרושים. צלחות חוזר מספר פעמים. מומלץ כי תבנית מלבנית רדוד ימוקם הפטרי בזמן הג'ל הוא קירור על מנת ליצור גומה להכללת העוברים על הצלחת.
  2. מקם את העוברים על הצלחת ב-, טוב, מגניב.
    הערה: מומלץ לשפוך בעדינות העוברים על צלחת במקום pipetting אותם כי זה נמצא כי הם ידבק הפנימי של פיפטות פלסטיק.
  3. השתמש מיקרוסקופ אור על מנת להמחיש כל העובר. השתמש בדיקה בוטה לתמרן עוברי למיקום הרצוי.
  4. לקחת תמונה כאשר העובר נמצא במיקום הרצוי. שימו לב כי חשוב לקחת תמונות של העוברים בתוך כמה שבועות של צביעת שהושלמו כדי למנוע השפלה פוטנציאלי של כתם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בדו ח זה, אנו מספקים גישה פשוטה וישירה לביצוע תיוג של דגימות Astyanax עובריים לניתוח ביטוי גנים איכותיים. טכניקה זו יכולה להתבצע או ארבעה או חמישה ימים, כל שלב העיקריות בהליך מיוצג בתרשים זרימה מקודדות לפי צבעים (איור 1). עם סיום, מוכתם עוברי צריך הנמל תווית כרומטית סגול כהה ברקמות לבטא את גן מסוים של עניין. בהצלחה יישמנו פרוטוקול זה Pachón cavefish (איור 2A–B, E) והן עוברי דגים פני השטח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בשל הפגיעות של RNA כדי השפלה, אחד הצעדים הקריטיים ביותר בפרוטוקול נוגע הסינתזה סטרילי של החללית ה-RNA. עם זאת, אם בדיקה מופק היטב, מספק תוצאות טובות, זה יכול לעשות שימוש חוזר בתגובות מכתימים עוקבות. צעד מכריע השני הוא ייצור זהיר של כל ריאגנטים בשימוש בכל רחבי בפרוטוקול. מאז פרוטוקול זה כרוך מספר ימים של צעדים קטנים רבים, זה הכרחי כי כל ריאגנטים במדויק המיוצרים הינם מאוחסנים באופן סטרילי. יתר על כן, חשוב באופן מהותי כי החוקר ממשיך בזהירות אחר כל שלב בפרוטוקול. מצאנו כי הרשימה שסופקה מדרגות יכול להיות שימושי ביותר להבטיח ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

המחברים רוצים להודות חברי המעבדה ברוטו עבור הערות מועילות על כתב היד הזה. ברצוננו להודות ארבעה תלמידי תיכון אשר מנוצל פרוטוקול זה במהלך התמחות קיץ בחודשים 2017 2018, לרבות כריסטין סאו, מייקל וורדן, אקי Li נוואנקוו דוד. HL נתמכה על ידי מלגת UC ביולוגיה גזע במהלך קיץ 2017. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי הקרן הלאומית למדע (דב-1457630 כדי JBG), נבחרת מוסדות של שיניים ואת ואסטתיים מחקר (NIH; DE025033 אל JBG).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10 מ"ל פיפטה סרולוגיתVWR89130-888
יחידת סינון 1000 מ"לVWR89220-698
15 מ"ל פיפטה חרוטיתVWR-Greiner82050-278
25 מ"ל פיפטה סרולוגיתVWR89130-890
יחידת סינון 250 מ"לVWR89220-694
5 מ"ל פיפטה סרולוגיתVWR89130-886
50 מ"ל חרוטיVWR-Falcon21008-940
יחידת סינון 500 מ"לVWR89220-696
אנטי-דיגוקסיגנין-AP, שברי פאבסיגמא-רוש11093274910
BCIPסיגמא-אולדריץ'B8503-1G1 גרם
תמיסת חסימהסיגמא-רוש11 096 176 00150 גרם
חומצת לימוןפישר סיינטיפיקA104-500500 גרם
DIG RNA ערכת תיוג (SP6 / T7)צינורות סיגמא-רוש11175025910
אפנדורףVWR20170-577
אתנולפישר-דקון04-355-2231 גל
פורממידתרמו פישר סיינטיפיק17899100 מ"ל
VWR66011-0411 ד"ר
זכוכית פיפטספישר סיינטיפיק13-678-8A
HClתרמי-מדעיפארמקו-AAPER284000ACS500 מ"ל
הפריןסיגמאH3393-25KU
מגנזיום כלוריד-גבישיפישר מדעיM33-500 500גרם
חומצה מאליתסיגמאM0375-100גרם 100 גרם
מתנולפישר סיינטיפיקA452-44 ליטר
מים בדרגה מולקולרית (ללא RNase)VWR7732-18-5500 מ"ל
NaClFisher ScientificS271-33 ק"ג
כדורי NaOHפישר סיינטיפיקS318-500 500גרם
אבקת מצע NBTThermoFisher Scientific340351 גרם
סרום עיזים רגילFisher-Invitrogen31873
מערבל אגוזיםVWR82007-202
ParaformaldehydeSigma158127-500 גרם500 גרם
PBS 10xFisher ScientificBP399-2020L
Proteinase K (200 מ"ג/10 מ"ל)Qiagen1913310 מ"ל
פיפטות פלסטיקVWR-Samco14670-147
RNAseSigmaR2020-250 מ"ל250 מ"ל
אמבט מים רועדים 12 ליטרVWR10128-12612 ליטר
שייקר אנלוגי סטנדרטיVWR89032-092
TrisSigma Millipore-OmniPur9210-500GM500 גרם
tRNA שמריםפישר-Invitrogen1540101125 מ"ג
טווין 20סיגמאP9416-50 מ"ל50 mL
Vortex-Genie 2פישר תעשיות מדעיות-מדעיות, בע"מ50-728-002
ליתיום כלוריד (LiCl)סיגמא-אולדריץ'203637-10G10 גרם
בקבוקוני דראם זכוכית

מקורות

  1. Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. In situ hybridization: Application to neurobiology. , Oxford University Press. Oxford. (1987).
  2. Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as revealed by in situ hybridization. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1325-1335 (1988).
  3. Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. Early cranial patterning in the direct‐developing frog Eleutherodactylus coqui revealed through gene expression. Evolution & Development. 12 (4), 373-382 (2010).
  4. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
  5. Cheung, M., Briscoe, J. Neural crest development is regulated by the transcription factor Sox9. Development. 130 (23), 5681-5693 (2003).
  6. Knight, R. D., Nair, S., Nelson, S. S., Afshar, A., Javidan, Y., Geisler, R., Rauch, G. J., Schilling, T. F. lockjaw encodes a zebrafish tfap2a required for early neural crest development. Development. 130 (23), 5755-5768 (2003).
  7. Yang, J. W., Jeong, B. C., Park, J., Koh, J. T. PHF20 positively regulates osteoblast differentiation via increasing the expression and activation of Runx2 with enrichment of H3K4me3. Scientific Reports. 7 (1), 8060(2017).
  8. Ganju, R. K., Brubaker, S. A., Meyer, J., Dutt, P., Yang, Y., Qin, S., Newman, W., Groopman, J. E. The α-chemokine, stromal cell-derived factor-1α, binds to the transmembrane G-protein-coupled CXCR-4 receptor and activates multiple signal transduction pathways. Journal of Biological Chemistry. 273 (36), 23169-23175 (1998).
  9. Cai, Y., Xin, X., Yamada, T., Muramatsu, Y., Szpirer, C., Matsumoto, K. Assignments of the genes for rat pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (Adcyap1) and its receptor subtypes (Adcyap1r1, Adcyap1r2, and Adcyap1r3). Cytogenetic and Genome Research. 71 (2), 193-196 (1995).
  10. Stolt, C. C., Rehberg, S., Ader, M., Lommes, P., Riethmacher, D., Schachner, M., Bartsch, U., Wegner, M. Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10. Genes & Development. 16 (2), 165-170 (2002).
  11. Kimura, T., Takehana, Y., Naruse, K. pnp4a is the causal gene of the Medaka Iridophore mutant guanineless. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (4), 1357-1363 (2017).
  12. Monsoro-Burq, A. H. A rapid protocol for whole-mount in situ hybridization on Xenopus embryos. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4809(2007).
  13. Schulz, C. In situ hybridization to Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4764(2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ניתוח ביטוי גניםעיכול באמצעות Proteinase Kבאפר היברידיזציהתמיסת חסימהצביעה בבאפר APדימוי במיקרוסקופיה של אורדגיCavefish ודגי פני שטחזיהוי גששי RNA
Wholemount ב באתרו הכלאה עבור עוברי Astyanax
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.