הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

האטא ק-seq Assay עם זיהום נמוכה דנ א מיטוכונדריאלי של ראשי האדם CD4 + לימפוציטים מסוג T

12.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59120

⸱

22 במרץ 2019

 ,  , 
1Department of Biology, Boston University, 2Department of Computer Science and Engineering, University of California San Diego, 3Bioinformatics Program, Boston University

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבצע וזמינותו של כרומטין transposase נגיש רצף (האטא ק-seq)-מופעל CD4 + האדם לימפוציטים. הפרוטוקול שונתה כדי למזער מזהמים קריאות דנ א מיטוכונדריאלי מ 50% ל-3% דרך המבוא של מאגר פירוק חדש.

תקציר

האטא ק-seq הפך מתודולוגיה בשימוש נרחב במחקר של אפיגנטיקה בשל גישתה מהירה ופשוטה מיפוי הגנום כולו נגיש כרומטין. במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול seq האטא ק משופר אשר מפחית את זיהום קריאות דנ א מיטוכונדריאלי. בעוד פרוטוקולים האטא ק-seq הקודם נאבקו עם קורא ממוצע של 50% מזהמות דנ א מיטוכונדריאלי, המאגר פירוק ממוטבת הציג פרוטוקול זה מפחית את זיהום דנ א מיטוכונדריאלי ממוצע של 3%. פרוטוקול זה seq האטא ק משופר מאפשר ירידה 50% ליד העלות רצף. נדגים כיצד ניתן להכין ספריות האטא ק-seq אלה באיכות גבוהה מופעל CD4 + לימפוציטים, מתן הוראות שלב אחר שלב של CD4 + בידוד לימפוציט של דם דרך ניתוח נתונים. פרוטוקול seq האטא ק משופר זה אומתה במגוון רחב של סוגי תאים ויהיה תועלת מיידית והטייפונים נגישות כרומטין.

מבוא

וזמינותו של כרומטין transposase נגיש רצף (האטא ק-seq) הפך במהירות השיטה המובילה עבור חקירת ארכיטקטורת כרומטין. האטא ק-seq ניתן לזהות אזורים של כרומטין נגיש באמצעות התהליך של tagmentation מזימות, תיוג של ה-DNA על ידי האנזים, כדי לייצר ספריות אשר הרצף ניתן לקבוע כרומטין נגישות מעבר הגנום כולו. תהליך זה tagmentation מתווך על ידי היפראקטיבי Tn5 transposase, אשר רק חותך אזורים פתוחים של כרומטין עקב מכשול הסטריים nucleosomic. בזמן שזה חותך, transposase Tn5 מוסיף גם מתאמים רצף המאפשרים בנייה מהירה ספריה על ידי ה-PCR ורצף הדור הבא של הגנום כולו נגיש כרומטין1,2.

האטא ק-seq הפכה השיטה המועדפת כדי לקבוע אזורים של כרומטין נגישות עקב פרוטוקול יחסית פשוטה ומהירה, איכות ומגוון של מידע יכול להיקבע מן התוצאות שלה, ואת כמות קטנה של החל החומר הנדרש. בהשוואה DNase-seq3 (אשר גם מודד את נגישות כרומטין הגנום כולו), MNase-seq4 (הקובע נוקלאוזום עמדות באזורים פתוחים גנום), בתיווך פורמלדהיד שלהם-seq5, האטא ק-seq הוא מהיר יותר, יותר זול, יותר לשחזור1. זה גם יותר רגיש, עבודה עם החל חומר של מעטים כמו גרעינים 500, לעומת 50 מיליון גרעינים הדרושות DNase-seq3. האטא ק-seq יש גם את היכולת לספק מידע נוסף אודות אדריכלות כרומטין מאשר בשיטות אחרות, כולל אזורים של איגוד פקטור שעתוק, מיצוב נוקלאוזום כרומטין פתוח אזורים1. פרוטוקולים האטא ק-seq יעיל, תא בודד יש מאומת, המספקים מידע על האדריכלות כרומטין החד-תאיים ברמה6,7.

האטא ק-seq שימש לאפיון אדריכלות כרומטין על פני קשת רחבה של סוגי תאים ומחקר, כולל צמחים8, בני9ו רבים אורגניזמים אחרים. הוא גם היה קריטי בזיהוי epigenetic רגולציה של המחלה הברית7. עם זאת, פרוטוקול האטא ק-seq הנפוצה ביותר כולל את החיסרון העיקרי של זיהום קריאות רצף של דנ א מיטוכונדריאלי. כמה ערכות נתונים, רמת זיהום יכול להיות גבוה ככל 60% של רצף תוצאות1. יש מאמץ בשדה כדי להפחית את קריאות מיטוכונדריאלי מזהמים אלה על מנת לאפשר ליישום יעיל יותר האטא ק-seq7,10,11. כאן אנו מציגים פרוטוקול seq האטא ק משופר אשר מפחית את שיעור הזיהום דנ א מיטוכונדריאלי רק 3%, המאפשר צמצום של-50% תוך רצף עולה10. זה התאפשר על ידי תהליך מיועל של לימפוציטים בידוד CD4 + ואת הפעלת מאגר פירוק משופרת שחיוני במטרה למזער את הזיהום דנ א מיטוכונדריאלי.

פרוטוקול modifiedATAC-seq זה אומתה עם מגוון רחב של ראשי תאים, כולל דם היקפיים ראשי אדם תאי תאים (PBMCs)10, ומונוציטים ראשי האדם העכבר תאים דנדריטים (לא פורסם). הוא גם שימש בהצלחה לחקור מלנומה שורות תאים במסך חזרה palindromic קצר באופן קבוע interspaced (CRISPR) באשכולות של רכיבים ללא קידוד11. בנוסף, חבילת ניתוח הנתונים המתוארים פרוטוקול זה וסיפק על GitHub מספק חוקרים חדשים ומנוסה עם כלים לניתוח נתונים האטא ק-seq. האטא ק-seq וזמינותו היעיל ביותר כדי למפות כרומטין נגישות מעבר הגנום כולו, שינויים בפרוטוקול הקיים אשר הציג כאן יאפשר החוקרים להפיק נתונים באיכות גבוהה עם זיהום נמוכה דנ א מיטוכונדריאלי, צמצום עלויות רצף ושיפור תפוקת האטא ק-seq.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול משופרת זה מספק הוראות מפורטות לביצוע האטא ק-seq של CD4 + לימפוציטים, מתוך החומר ההתחלתי של דם מלא באמצעות ניתוח נתונים (איור 1).

1. בידוד תאי CD4 + T של דם מלא

הערה: חומר המוצא עבור פרוטוקול זה הוא 15 מ"ל של דם מלא טריים נאסף באמצעות הליכים סטנדרטיים, לאפשר מקור חומר המוצא שייבחר בהתבסס על דרישות המחקר. קנה המידה הפרוטוקול כנדרש. לחמם buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) + סרום עגל העובר 2% (FCS) לטמפרטורת החדר (RT) ולהתאים לצנטריפוגה כדי RT לפני תחילת ההליך העשרה תאי CD4 + T.

  1. להוסיף µL 750 האנושי CD4 + תא T העשרה קוקטייל 15 מ"ל של דם מלא צינור חרוטי 50 מ"ל ומערבבים בעדינות על-ידי היפוך. תקופת דגירה-RT של 20 דקות. בתום דגירה, להוסיף 15 מ"ל של PBS + 2% FCS הצינור ומערבבים בעדינות על-ידי היפוך.
  2. הכן צינור חרוטי מ"ל עם 15 מ"ל של צפיפות בינונית. שכבת בקפידה את דגימת הדם מדולל על החלק העליון של המדיום צפיפות, להיות בטוח שלא לשבש את הממשק צפיפות בינונית/דם צורות. צנטריפוגה במשך 20 דקות ב- 1,200 x g ו- RT עם האצת מוגדר 1 ובלם יורד את.
    הערה: זה חיוני כדי להגדיר את ההאצה בלם את 1 וירידה לצנטריפוגה כדי למנוע שיבוש שכבת תאים המדיום צפיפות.
  3. איסוף תאי CD4 + T מועשר מממשק בינוני/פלזמה צפיפות באמצעות פיפטה העברה של גזע צר. העבר את התאים שנאספו צינור חרוטי מ"ל. Centrifuge תאי CD4 + T שנאספו במשך 8 דקות ב- 423- g ו- RT.
    הערה: ודא לחזור ההאצה צנטריפוגה בלם 9 ו יורד כ- ON עבור שלב 1.3 ואת כל השלבים הבאים.
  4. למחוק את תגובת שיקוע לשטוף בגדר תא פעמיים עם 50 מ של PBS + 2% FCS, צריך שתוציאו במשך 8 דקות ב 423 x g ו- RT. להשליך את תגובת שיקוע הסופי וקונטה להשעות בגדר תא שטף ב 2 מ"ל של PBS + 2% FCS.
  5. ספירת תאים באמצעות של hemocytometer. כדי להמשיך עם האטא ק-seq, המשך לשלב 2.3. כדי להקפיא תאים עבור עיבוד מאוחר יותר, להמשיך לצעוד 1.6.
  6. להוסיף 1 מ"ל של מדיום קפוא טרי (FCS 90% + 10% דימתיל סולפוקסיד) לכל 1 מיליון תאים. Aliquot 1 מ"ל של תאים קפואים בינוני צינורות בטוח ההקפאה. הצב צינורות ב-80 מעלות צלזיוס למשך הלילה במיכל קירור איטי. למחרת, העברת צינורות חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
    הערה: 1 מיליון תאי CD4 + T יהיה מבודד לכל 2 מיליליטר לאמצעי האחסון המקורי של דם מלא. הקפאת תאים 500,000 aliquots 1 מ"ל של מדיום מקפיא. הופך בינוני קפוא טרי-כל שימוש.

2. להפעיל ולטהר CD4 + T תאים

הערה: פרוטוקול מהיר זה לשם הפעלת וטיהור תאי CD4 + T רק דורש 48 שעות ותוצאות 95% קיימא, מופעלים תאי CD4 + T. מגניב לצנטריפוגה עד 4 ° C לפני תחילת בפרוטוקול.

  1. להפשיר את מבחנה 1 (500,000) של תאי CD4 + T באמבט מים 37 ° C עד הקרח נמס פשוט. בעדינות להעביר תאים צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 9 מיליליטר מראש ומחוממת מדיה רוזוול פארק אנדרטת המכון-1640 (RPMI-1640) בתוספת 10% FCS, ןלהל RPMI מלאה.
    הערה: אל תתנו תאים להפשיר לחלוטין כדי להימנע מחשיפה דימתיל סולפוקסיד.
  2. צנטריפוגה במשך 6 דקות ב-1500 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. למחוק את תגובת שיקוע, בעדינות להשעות את צניפה ב 2 מ של RPMI מלאה. חזור על הספין למטה, למחוק את תגובת שיקוע ולאחר בעדינות להשעות את התאים ב- 0.5 מ של RPMI מלאה.
  3. לספור את התאים באמצעות hemocytometer. להתאים את הצפיפות של התליה תא עם RPMI מלאה על צלחת 50,000 תאים µL 200 לאדם טוב של צלחת תחתית עגולה 96-ובכן.
    הערה: מהצינור קפוא אחד של 500K CD4 + T תאים, צלחת 10 בארות של 50,000 CD4 + T תאים ב- µL 200 לכל טוב.
  4. להכין beads מגנטי מצומדת עם נוגדנים אנטי CD3 ו- anti-CD28 T-מפעיל אנושי.
    1. µL 12.5 aliquot של חרוזים T-מפעיל CD3/CD28 אנושי לכל האטא ק-seq הדגימה כדי צינור 1.5 מ. לשטוף את החרוזים עם 1 מ"ל של 1 x PBS ומניחים את הצינורית על מגנט 1 דקות.
    2. בזהירות להסיר, למחוק את תגובת שיקוע ברורה להסיר את הצינורית של מגנט, להשעות את החרוזים 13 µL להשלים את RPMI עבור דגימה האטא ק-seq.
      הערה: לחשב את כמות החרוזים הדרושים לפי מספר דוגמאות האטא ק-seq המעובדות. פרוטוקול זה דורש µL 12.5 של CD3/CD28 חרוזים לכל התאים 500,000, המהווה דוגמא אחת האטא ק-seq.
  5. להפעיל את תאי CD4 + T. איסוף תאים 500,000 מ 2.1 ל RPMI מלאה, במדיום צינור חרוטי 15 מ"ל ולהוסיף µL 12.5 של טרום שטף חרוזים T-מפעיל אנושי. מערבבים בעדינות על-ידי היפוך ברכבת התחתית.
  6. בעדינות העבר את התאים עם חרוזים סטרילי מאגר וצלחת 200 µL של תאים עם חרוזים לכל טוב של צלחת 96-ובכן התחתון עגול באמצעות פיפטה של רב ערוצית. תקופת דגירה של 48 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 מיכלים.
  7. פוסט דגירה, centrifuge את הצלחת 96-ובכן במשך 8 דקות ב- 423- g ו- 100 להסיר RT. µL בינוני לכל טוב מהצלחת 96-ובכן, איסוף זה צינור חרוטי לפני השלכת כדי להבטיח ללא אובדן חרוז. Resuspend בגדר תא ב µL 100 הנותרים ולאסוף כל בשפופרת 1.5 mL.
    הערה: בארות 10 תאי T מופעל ייאספו באמצעי אחסון 1 מ"ל.
  8. לבצע CD4 + בידוד. הוסף µL 50 של חרוזים CD4 מצומדת טרום שטף לתאים 500,000 מ 1 ל RPMI מלאה. לשלב חרוזים ותאים באמצעות פיפטה. תקופת דגירה של 20 דקות ב 4 ° C במקרר. להתסיס ושרשרות תא תערובת כל 6 דקות.
    הערה: פרוטוקול זה נועד לשמש דוגמא אחת של תאים 500,000. להתאים ככל הדרוש עבור שניים או יותר דוגמאות 500,000.
  9. עם השלמת הדגירה, מניחים את הצינורית על המגנט עבור 2 דק להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע כאשר ברור. לשטוף את התאים מאוגד-חרוז על ידי הסרת את הצינור המגנט, השעיית התאים חרוז מכורך 1 מ"ל של PBS + 2% FCS, החלפת הצינור על המגנט עבור 1 דקות השמטת את תגובת שיקוע ברורה. חזור על תהליך זה סה"כ 3 מנקי.
    הערה: יש להיזהר לא למחוק את כל החרוזים במהלך שוטף.
  10. לאחר השטיפה הסופית במקום הצינור על המגנט עבור 1 מינימלית להסיר, למחוק את תגובת שיקוע ומניחים על בגדר על קרח. המשך סעיף 3 (האטא ק-seq).

3. האטא ק-seq

הערה: בשלב זה, גרעינים מבודדים מתאי CD4 + T מופעל עבור האטא ק-תת סעיף. המאגר פירוק בשימוש פרוטוקול זה שופר להיות עדינה על הגרעינים, וכתוצאה מכך לעיכול יעיל יותר, תוצאות באיכות גבוהה יותר. כל השלבים צנטריפוגה בסעיף 3 מבוצעות באמצעות צנטריפוגה קבוע-זווית ומתוחזק על 4 מעלות צלזיוס. מגניב לצנטריפוגה לפני תחילת פרוטוקול.

  1. לבצע בידוד רב-קוטבי. Resuspend חרוזים והתאים עם פירוק קר מאגר (10 מ מ טריס-HCl, pH 7.4, 10 מ מ NaCl, 3 מ מ MgCl2, polysorbate 0.03% 20). צנטריפוגה מיד ב x 500 g 10 דקות ב 4 º C. להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע.
  2. לבצע את התגובה transposase. להשעות בגדר גרעינים מבודד עם 50 µL של Tn5 transposase מיקס (טבלה 1). דגירה ב thermocycler במשך 30 דקות ב 37 ° C עם מכסה 40 ° צלזיוס, מחזיק ב 4 ° C בסיום.
  3. לאחר thermocycling, מיד לבצע סיבוב צנטריפוגה מהירה benchtop למטה ומניחים את הצינורית על המגנט עבור 1 דקות להסיר את החרוזים של המוצר.
  4. העבר את תגובת שיקוע ברור מהצינור על המגנט על עמודה טיהור DNA. לשטוף את העמודה פעם 250 µL של המאגר PB, פעמיים עם 750 µL של המאגר PE. Elute הדגימה ב µL 10 • תנאי המאגר. המשך ישירות לשלב 3.5.
    הערה: שלב זה מגביר את שברי DNA עם מתאמים מחוברים, המכונים כאן הספרייה האטא ק-seq. כדי מגה-פלקס מספר ספריות האטא ק-seq להתנהל אחד המיתרים ליין, להשתמש מדד פריימר 1 עבור כל דוגמאות ו- 2 פריימר אינדקס שונים לקבלת דוגמאות בודדות (טבלה 2). תחל משמשים עובד ריכוזים של 1.25 מיקרומטר.
  5. להגדיר את התגובה הראשונית של הגברה PCR בשפופרת נטולת נוקלאז PCR, שילוב הרכיבים השונים ההזמנה ואת אמצעי האחסון שצוין ב- טבלה 3- למקם את צינור ה-PCR thermocycler ולהפעיל את התוכנית הגברה PCR עם תנאי הרכיבה כמפורט בטבלה4.
  6. נטר את התגובה על ידי qPCR. להגדיר את התגובה qPCR בשפופרת נטולת נוקלאז PCR, שילוב הרכיבים השונים ההזמנה ואת הסכום הנקוב בטבלה 5. המקום המכונה qPCR, מחזור כמו שצוין ב טבלה 6.
    1. כדי לקבוע את שהמספר האופטימלי של הגברה נוספת מחזורים עבור התגובה 45 µL הנותרים, ליצור מגרש עם מחזור מספר על ציר ה-x ואת יחסי קרינה פלואורסצנטית (RFU) בציר ה-y. המספר האופטימלי של מחזורים נוספים הגברה הוא שליש מספר מחזורים שלוקח את התגובה qPCR להגיע אל הרמה.
      הערה: ניטור התגובה על ידי qPCR מאפשרת קביעה של מספר מחזורים PCR הרצוי כדי לקבל הגברה פרגמנט ספריית אופטימלית תוך מזעור GC תוכן ודעות קדומות גודל אופטימלי.
  7. להשלים הגברה PCR הסופי של µL 45 הנותרים של תגובת ה-PCR. מקום ברכבת התחתית PCR עם התגובה הגברה מהשלב 3.5 חזרה thermocycler ולהפעיל את התוכנית כפי שמתואר בטבלה 7.
    הערה: לקבלת דוגמאות מעובד כפי שמתואר פרוטוקול זה, המספר הכולל אופטימלית של PCR הגברה מחזורים היה נחוש בדעתו להיות 12.
  8. בתום ההגברה, לטהר את ספריות באמצעות ערכת ניקוי PCR הפרוטוקול של היצרן, eluting ב- 25 µL של המאגר • תנאי.
    הערה: ספריות מוגבר יכול להיות מאוחסן ב 4 ° C עבור עד 48 שעות או קפוא ב-20 ° C לאחסון לטווח ארוך.

4. האטא ק-seq ספריית ותמרוקים

הערה: חשוב לאמת את האיכות והכמות של ספריות האטא ק-seq לפני הדור הבא רצפי. וצריך להעריך את האיכות והכמות של הספריות באמצעות ערכות זמינים מסחרית (ראו טבלה של חומרים).

  1. להעריך את האיכות והכמות של ספריות האטא ק-seq באמצעות פלטפורמה מבוססת מיקרופלואידיקה אחיזה לשינוי גודל, כימות של בקרת איכות של ה-DNA. ראה איור 2 תוצאות הערכת איכות נציג.
    הערה: בטח הריכוז ATAC-seq ספריות > 1 ng/µL כדי להשיג תוצאות איכותיות רצף. בממוצע, 30 nM, 25 µL הושג.

5. רצף וניתוח נתונים

הערה: צינור ניתוח זה מאפשר למשתמשים לשלוט באיכות של קריאות מיפוי הליך, להתאים את קואורדינטות עבור תכנון ניסויים, אקרא פסגות לניתוח במורד הזרם. להלן פקודות קווים והסבר על ביצוע. חבילת ניתוח הנתונים זמין (https://github.com/s18692001/bulk_ATAC_seq).

  1. רצף של ספריות מוכן על ברצף הדור הבא עומק קריאה ממוצע של 42 מיליון קריאות עבור דגימה.
  2. להעריך את האיכות של רצף פעולות הקריאה על-ידי בדיקת קבצים שנוצרו על ידי FastQC12 חבילת תוכנה באמצעות הפקודה:
    fastqc -o < output_directory >< fastq_file >
  3. לקצץ הבסיסים של קריאות על ידי תוכנה13 Trimmomatic, אם יש צורך, כפי שנקבע על ידי בדיקת איכות FastQC, בעזרת הפקודה ' ' (עבור זוג הסתיימה):
    java-צנצנת < נתיב לקובץ jar trimmomatic > PE < input1 >< input2 >< output1 לזווג >< אינטראקצית output1 >< לזווג output2 >< output2 אינטראקצית > HEADCROP: < לחתוך בסיסים >
  4. ליישר שאוחזרו כדי הגנום האנושי הפניה (hg38) על-ידי תוכנת14 Bowtie2:
    bowtie2 - x < הפניה הגנום >-1 < קלט זוג 1 >< קלט זוג 2 > -S < קובץ הפלט סאם >
    הערה: ארגומנט ה - x עבור basename של האינדקס עבור הגנום הפניה, -S לפלט בתבנית סם.
  5. בדוק ופיתחתיאיכות הקריאות ממופים באמצעות Samtools15 flagstat החבילה:
    samtools flagstat < באם הקובץ >
  6. למיין את קובץ ממופה קריאות, להסרת כפילויות בכלי16 פיקרד:
    java-ג'אר picard.jar SortSam קלט = < שם קובץ סאם קלט > פלט = < שם קובץ באם פלט ממוין > SORT_ORDER = קואורדינטות "ו" java-ג'אר picard.jar MarkDuplicates קלט = < ממוינים באם קובץ > פלט = < באם פלט קובץ ללא כפילויות > REMOVE_DUPLICATES = TRUE
  7. קובץ אינדקס בם, לקצץ את קריאות כרומוזום שאינם בשימוש ולהזיז את הקואורדינטות מהסיבה ניסיוני האטא ק-seq17:
    java-ג'אר picard.jar BuildBamIndex קלט = < באם הקובץ >
    samtools idxstats < Input באם קובץ > | לחתוך -f 1 | grep - v chrY | grep - v chrM | grep - v chrUn | xargs samtools להציג -b < קובץ הקלט BAM >>< פלט גזוז באם הקובץ >
    bedtools bamtobed -i < Input גזוז באם הקובץ >>< פלט גזוז מיטה קובץ >
    אתה תקבל את המגיע ' להתחיל {שבטוב = "\t"}; {אם (6 דולר = = "+") הדפס $1, 2 + 4 דולר, 3 + 4 דולר, 4 דולר, 5, 6; הדפסה אחר $1, 2-5, 3-5, 4 דולר, 5 דולר, 6 דולר}' < Input גזוז מיטה קובץ >< Trimmed העביר את המיטה קובץ >
  8. מחק את הקורא את יוזזו כדי תיאום שלילי:
    אתה תקבל את המגיע '{אם (2 דולר > 0) הדפסה $1 "\t" 2 "\t" 3 דולר "\t" 4 דולר "\t" 5 "\t" 6 דולר}' < Input מיטה קובץ >< קובץ הפלט לא שלילי תיאום מיטה >.
  9. להמיר את הקובץ מיטה לקובץ באם לניתוח18 DiffBind הבאים:
    bedtools bedtobam -i < קובץ הקלט מיטה > -g < הפניה הגנום >< באם פלט קובץ >
  10. לבצע שיא הביקור על-ידי חבילת תוכנה18 DiffBind:
    macs2 callpeak -t < Input באם קובץ > -f בום -g hs - nomodel - nolambda - שמור-dup כל - קריאה-פסגות - outdir < נתיב הספריה פלט > - n < שם פלט > -B - q 0.01..--bdg - shift-100 - extsize 200
    הערה: לאחר סינון, מצפה החציוני של 37 מליון קריאות עבור דגימה. זיהום דנ א מיטוכונדריאלי ינוע מ 0.30% – 5.39% (1.96% בממוצע). יהיו קצב נמוך של קריאות להכפיל ממופה (6.7% – 56%, 19% בממוצע) וקורא אחוז גבוה יחסית של שמיש גרעינית (60% – 92%, 79% בממוצע).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מ- 15 מ"ל של דם טרי, פרוטוקול זה יוצר ממוצע של 1 מיליון תאי CD4 + T. אלה יכולים להיות קפוא לעיבוד מאוחר יותר או שימוש באופן מיידי. הכדאיות של תאי CD4 + T, טריים או המופשרים, היה עקבי > 95%. שיטה זו של בידוד תאי CD4 + T מאפשר גמישות בזמן חומר ואוסף מקור. פרוטוקול seq האטא ק משופר זה מייצר ספרייה הסופי של יותר מ 1 ng/µL עבור רצף. בקרת איכות המבוצעת באמצעות מערכות זמינים מסחרית צריך להפגין שברי DNA בין 200 ל 1,000 bp (איור 2). רצף צריכה להתבצע רק עם ספריות בא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול האטא ק-seq ששונה שהוצגו במאמר זה מספק תוצאות לשחזור עם זיהום דנ א מיטוכונדריאלי מינימלי. הפרוטוקול כבר להתרגל בהצלחה לאפיין כרומטין הארכיטקטורה של האדם העיקרי PBMCs10, ומונוציטים אנושי, העכבר תאים דנדריטים (לא פורסם), ו מלנומה בתרבית תאים קווים מספר11. אנו צופים זה פירוק משופרת מצב יש פוטנציאל לעבוד עבור סוגי תאים אחרים גם כן. זה צפוי גם כי פרוטוקול בידוד זה גרעינים יהיה תואם עם גרעינים יחיד האטא ק-seq פרוטוקולים, צמצום זיהום דנ א מיטוכונדריאלי לשיפור רצף תוצאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

אנו מודים Atsede Siba לקבלת תמיכה טכנית. C.S.C. נתמך על ידי NIH גראנט 1R61DA047032.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1x PBS,גיבקו10010023יכול להשתמש במוצרים דומים אחרים.
5810/5810  R דלי נדנדה צנטריפוגה מקוררת עם דליי צינור של 50 מ"ל, 15 מ"ל ו-1.5 מ"לEppendorf22625501יכול להשתמש במוצרים דומים אחרים.
96 צלחת תחתונה עגולה היטבThermo Scientific163320יכול להשתמש במוצרים דומים אחרים.
Agilent 4200 Tape Station SystemAgilentG2991AAמוצע להערכת איכות.
CryotubesThermo Scientific374081יכול להשתמש במוצרים דומים אחרים.
DMSOSigmaD8418יכול להשתמש במוצרים דומים אחרים.
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28Invitrogen Life Technologies11131Dרכיב קריטי
Dynabeads ערכת תאי CD4 T אנושיים שלא נגעובהם Invitrogen Life Technologies11346Dרכיב קריטי
DynamagnetInvitrogen Life Technologies12321Dרכיב קריטי
FCSמוצרי ביו Gemini100-500יכול להשתמש באחרים דומים מוצרים.
ערכת DNA ברגישות גבוההAgilent50674626מוצעת להערכת איכות.
מגנזיום כלוריד, הקסהידרט, ביולוגיה מולקולרית כיתהסיגמאM2393יכול להשתמש במוצרים דומים אחרים.
ערכת טיהור PCR MinElute (מאגר PB, מאגר PE, מאגר אלוטיון)Qiagen28004רכיב קריטי
מר פרוסטיתרמו סיינטיפיק5100-0001יכול להשתמש במוצרים דומים אחרים.
NaCl, ביולוגיה מולקולרית בדרגהSigmaS3014יכול להשתמש במוצרים דומים אחרים.
NEBNext High Fidelity 2x PCR Master MixNew England BioLabsM0541ספריית DNA Nextera Critical Component
(2x TD Buffer, Tn5 Enzyme)IlluminaFC1211030רכיב קריטי
ללא נוקלאז dH20Gibco10977015יכול להשתמש במוצרים דומים אחרים.
פוליסורבט 20 (Tween20)SigmaP9416יכול להשתמש במוצרים דומים אחרים.
PowerUp SYBR Green Master MixApplied BiosystemsA25780רכיב קריטי
אמבט מים מדויקThermo ScientificTSGP02יכול להשתמש במוצרים דומים אחרים.
ערכת טיהור PCR מהירה QIAGEN28104רכיב קריטי
Qubit dsDNA HS InvitrogenLife TechnologiesQ32851מוצעת להערכת איכות.
Qubit FlouroMeterInvitrogen Life TechnologiesQ33226מוצע להערכת איכות.
רוזטה ספטמבר אנושי CD4+ צפיפותבינונית טכנולוגיות תאי גזע15705רכיב קריטי
רוזטה ספטמבר אנושית CD4+ העשרה קוקטיילטכנולוגיות תאי גזע15022רכיב קריטי
RPMI-1640Gibco11875093יכול להשתמש במוצרים דומים אחרים.
Sterile ResevoirThermo Scientific8096-11יכול להשתמש במוצרים דומים אחרים.
T100 Thermocycler עם מכסה מחומםBioRad1861096יכול להשתמש במוצרים דומים אחרים.
Tris-HCLSigmaT5941יכול להשתמש במוצרים דומים אחרים.
סטרילי ערכת הכנת ערכת בדיקה של

מקורות

  1. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  2. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide. Current Protocols in Molecular Biology. 21, 1-29 (2015).
  3. Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harbor Protocols. (2), (2010).
  4. Pajoro, A., Muiño, J. M., Angenent, G. C., Kaufmann, K. Profiling Nucleosome Occupancy by MNase-seq: Experimental Protocol and Computational Analysis. Methods in Molecular Biology. 1675, 167-181 (2018).
  5. Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).
  6. Rosenberg, A. B., et al. Single-cell profiling of the developing mouse brain and spinal cord with split-pool barcoding. Science. 360 (6385), 176-182 (2018).
  7. Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).
  8. Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes. Nucleic Acids Research. 45 (6), e41(2017).
  9. Lara-Astiaso, D., et al. Chromatin state dynamics during blood formation. Science. 345 (6199), 943-949 (2014).
  10. Gate, R. E., et al. Genetic determinants of co-accessible chromatin regions in activated T cells across humans. Nature Genetics. , (2018).
  11. Sanjana, N. E., et al. High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome. Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).
  12. Andrews, S. FastQC A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data. Babraham Bioinformatics. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc (2018).
  13. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  14. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  15. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  16. Broad Institute. Picard Tools. , Available from: http://broadinstitute.github.io/picard/ (2018).
  17. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  18. Stark, R., Brown, G. DiffBind: Differential Binding Analysis of ChIP-Seq Peak Data. , Available from: http://bioconductor.org/packages/devel/bioc/vignettes/DiffBind/inst/doc/DiffBind.pdf (2018).
  19. Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
  20. Wu, J., et al. The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos. Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ATAC seqTn5
האטא ק-seq Assay עם זיהום נמוכה דנ א מיטוכונדריאלי של ראשי האדם CD4 + לימפוציטים מסוג T
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.