מאמר שיטה

זיהוי לכל-כימית Polyfluorinated מינים בזרימת עבודה משולבת יישוב, שאינו ממוקד-סינון ברזולוציה גבוהה ספקטרומטר מסה

14.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59142

⸱

18 באפריל 2019

 , 
1Oak Ridge Institute for Science and Education, National Exposure Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, 2National Exposure Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול כימות יישוב רציף וניתוח שאינן ממוקדות של תרכובות fluorinated במים באמצעות ספקטרומטר מסה. מתודולוגיה זו מספק רמות כמותית של תרכובות שטיח ידוע ומזהה כימיקלים לא ידוע בדגימות קשורים עם הערכות כמותיות למחצה של שפע שלהם.

תקציר

היסטורית והעתידיים לאדם-, חומרים polyfluoroalkyl (PFASs) משכו עניין משמעותי ציבוריים, ממשלתיים סוכנויות הנסיעות מ המקומי לרמות הפדרלי. ההתפתחות המתמשכת של בדיקות PFAS, הביוכימיה מציג לאתגר ניטור סביבתי, איפה פיתוח מתמשך של שיטות יישוב בהכרח ומהפיתוח הגילוי של תרכובות כימיות חדשות. יש צורך, לכן, יש מתודולוגיות שפניה לעתיד יכולים לזהות תרכובות המתעוררים ובלתי צפויה, לפקח המינים הללו לאורך זמן, ולא לפתור את הפרטים של המבנה הכימי שלהם כדי לאפשר בעתיד לעבוד על בריאות האדם. למטרה זו, ממוקדות ללא ניתוח באמצעות ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה מציעה גישה זיהוי בסיס רחב זה יכול להיות משולב עם ערכת הכנה כמעט כל מדגם ומספק יכולות משמעותיות עבור זיהוי המורכב לאחר גילוי. במסמך זה, אנחנו תארו שיטה מדגם מיצוי מוצק-פאזי (SPE) המבוסס על ריכוז מכוון עבור שרשרת קצרה יותר, יותר הידרופילית PFAS בדיקות, הביוכימיה, כגון חומצות אתר fluorinated ו sulfonates,. ומתארות ניתוח לדוגמאות שהוכנו בצורה הזאת ב מצבי יישוב והן שאינן ממוקדות. שיטות יישוב לספק כימות מעולה בעת הפניה סטנדרטים זמינים אך מוגבלות מהותית לתרכובות הצפוי בעת ביצוע ניתוח. לעומת זאת, בגישה ממוקדות שאינם יכולים לזהות הנוכחות של תרכובות בלתי צפוי, לספק מידע מסוים אודות המבנה הכימי שלהם. מידע אודות תכונות כימיות ניתן לתאם תרכובות על פני מיקומי הדגימה ולעקוב אחר לשפע, מופע לאורך זמן.

מבוא

מחלקת לכל-חומרים polyfluoroalkyl (PFASs) הם מתמידים מזהמים אורגניים בדאגה לבריאות הציבור משמעותית. תרכובות ייעודיות perfluorooctanoic חומצה (PFOA) ואת perfluorooctanesulfonate (עמק חפר) יש מי שתייה בריאות המייעצת רמות שנקבעו על ידי המשרד לאיכות הסביבה1,2 , הייצור העיקריים שלהם בארה ב הפסיקה של שנות האלפיים3,4 . כדי להשיג הבנה משמעותית עבור המאפיינים של PFAS החומרים במוצר טקסטיל ומוצרי הצריכה ייצור הספירות, מאות, אם לא אלפים, של בדיקות PFAS חלופי, הביוכימיה פותחו כדי למלא נישות המוצר, כולל מחליפים תרכובות במצב deprecated5,6,7,8. יש צורך בניטור רמות איכות הסביבה של שרשרת ישר perfluorinated קרבוקסילית חומצות המתמשך, sulfonates כזה עמק חפר, PFOA, וסדרות שלהם קשורות הומולוגיים, אבל תרכובות כימיות המתעוררים שאינם מכוסים על ידי שיטות הוקמה כגון המשרד לאיכות הסביבה שיטת 5379 ולעיתים קרובות חוסר סטנדרטים אנליטיים לניתוח יישוב מסורתיים. כוונתו של פרוטוקול זה היא לפיכך כפולה. הוא מספק מסלול לניתוח LC-MS/MS יישוב של שטיח מינים במים שבו זמינות סטנדרטים אנליטיים, פרטים השילוב חלקה של שאינן ממוקדות ברזולוציה גבוהה מבוססי ספקטרומטר מסה גישה לניתוח נתונים המאפשרת זיהוי תרכובות לא ידוע או לא צפוי הדגימות באותו.

מיצוי מוצק-פאזי (SPE) היא טכניקת הוקמה כדי להפוך את הדגימה ניקוי ריכוז עם יישומים רבים analytes ודגימת מטריצות10,11. ניתוח PFAS, מרובות שלבים לפרטים מלאים כולל הלא קוטבי, functionalized הקוטב, יונים עמודות שימשו על היקף בדרגות שונות עבור מחלקות של מינים fluorinated במגוון רחב של מטריצות9,12, 13,14,15,16. ההתקדמות SPE דגימת באמצעות setups ופשוט מאוד להגדיל את התפוקה של הגישה ולשפר את הפארמצבטית הטיפול דגימה, אך התהליך הבסיסי נשאר עקבי17. גם שבוצעו ליצירת כמה ניסיונות כדי להסיר את ריכוז מנותק SPE באמצעות זריקות נפח גדול, אבל אלו דורשים שינויים כרומטוגרפיה שמעמידות אותם מחוץ לתחום ניתוח מזדמנים18,19 . ניתוח המדגם שלנו משתמשת שלב לפרטים של exchange (שעווה) אניון חלש פולימריים ביסודיות להפריד חומרים PFAS חומצי מזהמים אורגניים המסורתית תוך השגת דגימה משמעותי ריכוז גורמים. שלב שעווה זה חשוב ללכוד את חומצות perfluorinated קצרות שרשרת כגון perfluorobutane סולפונאט (PFBS) או קטונים perfluorinated כגון חומצה דיימר תחמוצת hexafluoropropylene (HFPO-DA) אשר הן פולריות יותר מאשר perfluorinated מדור קודם עוד השרשרת מינים20,21. כבר יש שינוי משמעותי לעבר אתר הכללה לנסתר fluorinated קצר יותר PFAS האחרונות כימיה5, זו בחירה שלב מאפשרת שחזור יסודית יותר של תרכובות הרומן לניתוח MS.

כימות LC-MS/MS ממוקד משתמש מאומת סטנדרטים, איזוטופ יציב עם התווית סטנדרטים פנימיים ומספק רמה ללא תחרות של ירידה לפרטים ורגישות לניתוח כמותי. גישה זו היא רצויה במצבים רבים, היא מעשית למצבים כל מדי נפוץ בניתוח. גישות יישוב עובד רק עבור מינים צפויים במדגם, ועבור אילו שיטות בעבר הוקמו. עבור תרכובות חדשים ומתפתחים, גישה זו הוא מסוגל אפילו גילוי מין זה יכול להיות מעניין, ללא קשר כימיה או ריכוז, ו ברזולוציה נמוכה ספקטרומטרים המוני אינם מסוגלים כמעט מתן מידע מספיק כדי לבצע חד-משמעית הקצאות הכימי של תרכובות לא ידוע. כתוצאה מכך, בתחום ניתוח שאינו ממוקד שצמחו, מינוף הכוח של ברזולוציה גבוהה ספקטרומטרים המונים מודרניים כדי לנתח דגימות ללא הנחה presupposed ולהקצות בדיעבד כימיקלים לתכונות לזיהוי במדגם. גישה זו כבר בשימוש נרחב בתחומי הביולוגיה22,23,24 ו מדעי הסביבה25,26,27 על שיעורים רבים של כימיקלים. Perfluorinated כימיקלים פשוטה במיוחד לזהות בשיטה זו עקב דפוסי המוני ספקטרלי הייחודי שלהם, מאות תרכובות תוארו רק העבר כמה שנים5,28.

פרוטוקול שנדונו כאן מיועדת ליישור כימות LC-MS/MS PFAS יישוב עם הצורך לזהות ולנטר באופן כמותי למחצה תרכובות המתעוררים עניין. השלב SPE מבחר, טכניקות להכנת הדגימה נועדו להבטיח לכידת של חומצות PFAS המתעוררים הידרופילית יותר מן המים, עשוי להיות פחות מתאים יותר שרשרת פולימריים מינים ומינים ללא יונית. עוד יותר, הנתונים שנוצרו על-ידי ניתוח שאינו ממוקד צפופה, של dimensionality גבוהה, אשר מחייבת שימוש תוכנה לניתוח נתונים. חבילות תוכנה כזו הם לעתים קרובות ספציפי לספק ודורשים שינוי לפעול בין פלטפורמות כלי נגינה. במידת האפשר, תהליך ניתוח שתיארנו באופן כללי מקור פתוח/freeware חלופות מוזכרים, אך היעילות והדיוק של כל גישה תוכנה חייב להיות מוערך על בסיס פרטני.

פרוטוקול

1. אוסף של דגימות מים

  1. הכנה של מניות רגיל PFAS
    1. להכין תערובת סטנדרטי PFAS ב מתנול המכילה תרכובות יישוב כל עניין (למשל, PFOA, עמק חפר, HFPO-DA) ב 1 ng/µL. זוהי תערובת PFAS מקורי. תערובות מסחריים זמינים גם (קרי, מיקס PFAC A ו- B מיקס).
    2. להכין תערובת סטנדרטית המכילה מתאימים איזוטופ יציב עם התווית תרכובות (סיל) PFAS (למשל, 13C4- PFOA, 13ג8- עמק חפר, 13C3- HFPO-DA) 1 ng/µL. זוהי תערובת PFAS הוא. תערובות מסחריים זמינים גם (קרי, מיקס MPAFC A ו- B מיקס).
      הערה: אם גרסה סיל PFAS יישוב אינה זמינה, ממלא מקום עם אורך שרשרת ומבנה דומה יכול לשמש (למשל, 13C2- PFHxA עבור HFPO-DA)
  2. הכנה של שדה ריק (פנסיון מלא), דגימות ספייק ריק (SB)
    1. מילוי 2, פוליפרופילן נקי בעל צפיפות גבוהה (HDPE) או פוליפרופילן (PP) בקבוקים עם 1000 מ"ל של מעבדה יונים מים (DI), ידוע PFAS חינם.
      התראה: חומרים PFAS לעתים קרובות יש מוגדר רעילות ו/או carcinogenicity. צריך לקחת כדי למנוע חשיפה דרך הפה או העור סטנדרטים או פתרונות מניות.
    2. להוסיף כמות של תערובת סטנדרטי PFAS אחד הבקבוקים-ריכוז הסופית שווה ריכוזי מדגם הצפוי (למשל, 100 ng/L). זהו ספייק ריק (SB).
    3. הוסף 5 מ של 35% חומצה חנקתית משמר ריק ספייק.
    4. נושאים SB מדגם והן את השדה unspiked הריק למיקום דגימה כפקדים.
  3. שדה דגימה
    הערה: אספן המדגם צריך ללבוש nitrile כפפות ודגימת ממערכות זורם במידת האפשר. ברז דגימות צריך להיות מותר ושפע equilibrate לפני דגימה (2-3 דקות).
    1. לאסוף 500-1000 מ ל מים מהמיקום שדה בבקבוק נקי HDPE או PP.
    2. הוסף 5 מ של 35% חומצה חנקתית משמר מדגם בקבוקים, שדה ריק.
      התראה: חומצה חנקתית הוא מאכל מחמצן חזק

2. דגימה החילוץ

הערה: PFAS נמצא בכל מקום ומתמשך. ודא כל ממיסים של הציון הגבוה יש נותחו על זיהום PFAS ברמה נמוכה. שטפים היטב את כל הציוד במעבדה משתמשים להכנת תקנים לפני הכנת כדורי סרק ודוגמאות.

  1. לדוגמה רעלני
    1. שופכים את כל מדגם לתוך נפרדת, מראש נקי 1 ליטר HDPE בוגר צילינדר ולהקליט עוצמת הקול המדויק.
    2. להוסיף 10 מ של מתנול של הבקבוק התרוקן מדגם, וחוץ מזה, לנער היטב כדי לשטוף PFAS הספוחה מן הפנים בקבוק.
    3. לחזור דגימת מים מדוד הבקבוק שטופים עם רינס methanolic.
  2. עקומת סטנדרטי עבור כימות
    1. למלא 8, 1 L HDPE/PP בקבוקים עם מים DI PFAS-חופשית.
    2. בחר שמונה ריכוזים שמפוזרות מכסים את הטווח הרצוי כימות. לדוגמה: 10, 25, 50, 100, 250, 500, ng 750 ו 1000/L עבור טווח של 10-1, 000 ng/ל'
    3. להוסיף כמות של PFAS יליד לערבב כל בקבוק להניב את ריכוזי PFAS הסופי ב- 2.2.2 (למשל, 100 µL PFAS מיקס א-1 ליטר של מים DI = 100 ng/L).
  3. הוספה סטנדרטית פנימי
    הערה: תוספת של איזוטופ יציב עם תוויות תקן פנימי (IS) היא הכרחית רק אם תוצאות כמותיות הם הרצויה בנוסף ניתוח שאינן ממוקדות.
    1. להוסיף את התערובת PFAS הוא כל דגימה-ריכוז קירוב נקודת האמצע של עקומת כיול (למשל, 250 µL של PFAS הוא תערובת = 250 ng/L)
  4. סינון
    1. לסנן דגימות דרך זכוכית GF/A סיבים מסננים (47 מ מ, 1.6 גודל הנקבוביות מיקרומטר) תחת ואקום עדין לתוך 1 ליטר מראש נקי HDPE תרמוס.
    2. אם חלקיקי החומר נשאר בבקבוק, לשטוף עם מים יונים נוספים לתוך המסנן. לחזור מים מסוננים הבקבוק מדגם או מיכל חדש לחילוץ מעבדתי.
  5. מיצוי מעבדתי (SPE)
    הערה: ריכוז מחסנית המתוארים כאן משתמשת משאבה בוכנה זרימה מתמדת. שיטות אלטרנטיביות של ריכוז באמצעות ואקום סעפת20 או באמצעות התקנה17 SPE-LC-MS ופשוט הם אפשרי אבל לא נדונה.
    1. מצב מחסנית exchange (שעווה) אניון חלש עם 25 מ של מתנול.
    2. מצב המחסנית שעווה עם אוטם 25 נוספים של מים יונים.
    3. מיקום משאבת לצייר אבובים בבקבוקי מדגם מסוננים, תווית SPE מחסניות עם שמות דוגמת המתאימים.
    4. משאבה 500 מ"ל של דגימת מים דרך המחסנית בקצב זרימה קבועה של 10 mL/min (סה כ 500 מ"ל), השמטת זרימה דרך נוזל לבזבז.
      הערה: אמצעי אחסון גדול או קטן יותר יכול להיות מרוכז בהתאם לדוגמה הצפוי ריכוזים.
    5. הסר את מיכל הדיו משאבת בוכנה עבור • תנאי.
      הערה: אם ריכוז דוגמאות נוספות באמצעות המשאבה אותו, משאבת בוכנה צריך להיות ריקון 25 מ של מתנול לפני התקנת המחסנית הבא עבור equilibration.
    6. להעביר SPE מחסנית יריעה ואקום ולצייד עם מאגר הזכוכית החיצונית.
    7. לרוקן מחסנית SPE עם 4 מ של 25 מ מ, pH 4.0 סודיום אצטט מאגר תחת ואקום עדין. למחוק את הזרימה. מחסנית SPE לשטוף עם 4 מיליליטר מתנול נייטרלי.
      הערה: לשטוף נייטרלי ניתן לאסוף שבר אם צפויים ספציפי nonionic analytes הקוטב. אחרת, למחוק לבזבז
    8. המקום שפופרת צנטרפוגה פוליפרופילן 15 מ"ל מתחת בכל מחסנית SPE כדי לאסוף את eluent. Elute מדגם עם 4 מ של 0.1% אמוניום מימה ב מתנול.
    9. הסר שפופרת • תנאי, לצמצם את נפח eluate 500-1, 000 µL על ידי אידוי תחת חנקן יבש זרם באמבט מים בטמפרטורה מעט יותר גבוהה מהרגיל (40 ° C).
    10. מרוכז מדגם ניתן לאחסן תמציות לפני ניתוח בטמפרטורת החדר.
  6. כימות LC-MS/MS יישוב
    1. µL 100 שתדללו מדגם לחלץ עם 300 µL של 2 מ מ אמוניום אצטט מאגר לתוך המבחנה מדגם HPLC.
    2. לכייל, equilibrate של מערכות HPLC ו- MS בהתאם להוראות היצרן.
      הערה: רקע PFAS מזוהים בדרך כלל עקב השימוש של רכיבים fluoropolymer של רוב המערכות LC, דוגמת המבחנה septa. לאשר רמות לגילוי החסר הוא זניח לפני השימוש. שינוי של מערכת LC להחליף רכיבים טפלון הוא הציע במידת האפשר. השימוש של עמודת "למטה" אנליטי בסמוך לשסתום ערבוב LC הוא גם הציע29.
    3. הכן של worklist אנליטית המורכב של העקומה סטנדרטי, דגימות של שכפול נוסף של העקומה סטנדרטי כדי להעריך את הסחף פלייבק לאורך המרוץ. Worklist למשל מוצג בטבלה 1.
    4. לנתח את הדגימות באמצעות שיטות LC ו- MS הקים את compound(s) יישוב עניין. מעבר הצבע LC לדוגמה מוצג בטבלה מס ' 2 , פרמטרים של פעולות שירות MS מוצגים בטבלה 3 ו- 4 בטבלה. בהמשך ניתן למצוא דיון מפורט מק'קורד et al.21.
    5. ליצור עיקול רגיל בין דגימות רגיל באמצעות היחס באזור שיא של analyte על תקן פנימי לעומת הריכוז של analyte. ליצור נוסחה רגרסיה ריבועית עם 1 / x שקלול ריכוז חיזוי9.
    6. Quantitate analytes יישוב בכל מדגם באמצעות עקומות סטנדרטי מוכן יחס שטח (באזור סטנדרטי / אזור) עבור כל אחת מהמידות.
    7. אם הריכוז עולה על הטווח כיול, לדלל את הדגימה המקורית עם מים DI מתובל את הריכוז הוא המתאים ואת לחלץ מחדש כדי להביא את הריכוז לתוך הטווח המתאים.
  7. ממוקדות ללא איסוף נתונים LC-MS/MS
    1. µL 100 שתדללו מדגם לחלץ עם 300 µL של 2 מ מ אמוניום אצטט מאגר לתוך המבחנה מדגם HPLC.
    2. לכייל, equilibrate, HPLC ו MS ברזולוציה גבוהה על פי הוראות היצרן.
    3. הכן של worklist אנליטי כמו 2.6.2.
    4. באמצעות כלי תוכנה, איסוף נתונים LC-MS עם סריקה רחב MS1 במצב הנתונים תלויי לאסוף MS/גב' דוגמה LC הדרגתי בטבלה5. דיון נוסף של הגדרות המכשיר ניתן למצוא Strynar et al.30 , ניוטון et al.31.
      הערה: עבור MS/MS משופרת ניתוח נתונים תלויי באיכות יכול להתבצע עם רשימה יון המועדפת של קבוצת משנה של תכונות שנותרו לאחר עיבוד הנתונים ב- 2.8.1-2.8.8.
  8. ממוקדות ללא עיבוד נתונים
    הערה: ניתוח נתונים שניתן לבצע עם מגוון רחב של תוכנות, שיטות אלה אינן משקפות את השיטה היחידה, או הכי טוב עבור הנתונים (dataset) שרירותי. במידת האפשר, צעדים לספק תיאור כללי זה יכול להתבצע בתוכנה חלופי. עיבוד של הנתונים לדוגמה המשמשים בכתב יד זה בוצע באמצעות ספק תוכנה ספציפית (תוכנה 1 ו- 2 תוכנה) כמפורט בניוטון ואח.31.
    1. לבצע הדמיה מולקולרית של תכונות כימיות באמצעות אחד מספר קוד פתוח תוכנה חבילות32,33 או ספק תוכנה לזיהוי גושים monoisotopic, השמירה פעמים ואזורי שיא משולב של חומר כימי תכונות.
      1. תוכנה 1, בחר קבצים לדוגמה הוספה/הסרה > להוסיף קבצי , לבחור את הנתונים הגולמיים הניסוי שאינן ממוקדות, לאחר מכן אישורכניסות.
      2. בחירת תוכנה 1 אצווה רקורסיבית הדמיה > שיטה פתוחה. כדי לטעון שיטה preestablished, או לערוך באופן ידני את הגדרות התוכנה. הגדרות profinder עבור הדמיה ניתן למצוא טבלה 6.
      3. תוכנה 1, לאחר החילוץ תכונה, בחר קובץ > לייצא כקובץ CSV..., קובץ > לייצא CEF., או קובץ > ייצוא בתור כדורגלן. עיבוד נוסף. CEF קבצים מנועות למשך שארית התיאור.
      4. תוכנה 2 (MPP) ליצור התנסות חדשה עם סוג בלתי מזוהה , סוג זרימת העבודה אשף ייבוא הנתונים ' ולחץ על ' אישור'.
      5. MPP בחר את קבצי הנתונים ולאתר את התוצאות תוכנה 1 שיוצאו (CEF או PFA) לייבוא; לאחר מכן לחץ על הבא עד מופיעות אפשרויות יישור פרמטר .
      6. ב. MPP, להגדיר את הערכים יישור מורכבים 0.0 (יישור כבר בוצעה ב החילוץ תכונה של תוכנה 1, שלב 2.8.1.2) ולאחר מכן לחץ על הבא דרך השלבים עד סיום זמין.
    2. לסנן ההזדהויות בהתבסס על הפארמצבטית אנליטית. איפה דגימות שכפל מרובים זמינים, תכונות צריך להיות נוכח בחדר > 80% של הפרט משכפל ויש של מקדם אנליטית של וריאציה (CV) של < 30%
      1. בחר MPP הגדרת הניסוי > ניסוי קיבוץ ולהקצות כל קובץ raw קבוצה המייצגים מדגם המוצא שלו (קרי, משכפל מאותו המקור צריך להיות באותה קבוצה). ניתן ליצור קבוצות מרובות המתאים מקוננים משתנים (למשל, פלייבקים לעומת משכפל טכני).
      2. MPP, בחר באפשרות הגדרת הניסוי > ליצור פרשנות מכן בחר בפרמטר הניסוי (קרי, לקבץ) ולחץ על הבא עד סיום זמין. פעולה זו תיצור קטגוריה זה סינון בעתיד יכול לנתח.
      3. בחר באפשרות MPP בקרת איכות > סנן לפי תדירות. הגדר ישות רשימת כל הישויות ואת הפרשנות לדגימת Group(non-averaged) שנוצרו ב- 2.8.2.2, ואז תלחץ הבא.
      4. עבור פרמטרים של קלט, להגדיר ישויות השמירה ב- 80% של מצב אחד לפחות שנדגמו ב ולאחר מכן לחץ על הבא עד סיום זמין. שם רשימת תכונות סינון תדר
      5. בחר באפשרות MPP בקרת איכות > מסנן על השתנות מדגם. להגדיר את הרשימה ישות לתכונות סינון תדר מ 2.8.2.4 והפרשנות של Group(non-averaged), ולאחר מכן פגע הבא.
      6. בחר בלחצן האפשרויות עבור נתונים גולמיים , טווח של הריבית מקדם של וריאציה < 30%. לחץ על הבא > לסיים ולשמור את רשימת תכונות סינון קורות חיים.
    3. להסיר תכונות שבו אין דוגמאות יש גבוה יותר באופן משמעותי (> קיפול 3) שפע מאשר המדגם שדה ריק (פנסיון מלא).
      1. בחר באפשרות MPP ניתוח > שינוי לקפל. הגדר ישות רשימת תכונות סינון קורות חיים , הפרשנות לדגימת שקבוצה ואז פגע הבא. בחר באפשרות שינוי הקיפול נגד תנאי יחיד , בחר בתנאי פנסיון מלא או מה שם הקבוצה עבור המדגם מעובד ריק היה.
      2. במסך הבא, מוגדר החיתוך קיפול-שינוי 3.0, לחץ על דרך בסוף פי ההנחיות. לשמור את הרשימה ברשימה מסוננת FC.
    4. לבצע השוואות בינאריות של דוגמאות בודדות עניין נגד דוגמה רקע מתאימה (למשל, במעלה נגד הזרם של המקור) לקבוע קיפול-שינויים עבור תכונות בודדות כימי.
      1. בחר באפשרות MPP ניתוח > מסנן על מגרש הר הגעש. הגדר את הרשימה ישות רשימה מסוננת FC , הפרשנות לקבוצה.
      2. עבור התנאי לשינוי קיפול זוג לבחור שני מדגמים להשוואה (למשל, לזווג ויוצאת מדגם), בחר מבחן אינטראקצית מאן-ויטני.
      3. עבור ניתוח ראשוני, לא בחר ערך עבור תיקון מבחן מרובים במסך הבא, לחץ על דרך לעלילה תוצאה.
      4. על המסך תוצאות בחר ניתוק קיפול-שינוי של 3.0 על קיצוץ ערך-p ל 0.1. אז נסיים , ייצוא הרשימה כתוצאות מוקדם.
    5. עבור כל תכונה שנותרו לאחר סינון, הפקת formula(s) כימי החזוי מן המסה המדויקת ספקטרום המוני ללא הפרדות צבע.
      1. . MPP, בחר התוצאות פרשנות > זיהוי IDBrowser ורשימת תוצאות מוקדם ישות.
      2. IDBrowser בחר לזהות כל תרכובות באמצעות גנרטור נוסחה מולקולרית (MFG) כמו שיטת זיהוי.
      3. אפשרויות ליצור נוסחה להוסיף F עמודת אלמנטים להגדיר המרבי ל- 50, ולאחר מכן בחר באפשרות סיום. בעקבות דור נוסחה בחר לשמור ולחזור לחזור MPP .
      4. . MPP, קליק ימני מסוננים, MFG מתאימים רשימת ישויות ולבחור ייצוא רשימה. שמור את התוצאות.
    6. לבחון את המסה monoisotopic של מינים ברשימה מופחת משמעותית תכונה כימית עבור אלה המכילים מסה פגמים מעידה על fluorination; לראות איזה סוג של Fiehn34.
    7. שימו לב סדרה כימית המכילה polyfluorination נפוצות מוטיבים (CF2 (m/z 49.9968), CF2O (m/z 65.9917), CH2CF2O (m/z 80.0074), וכו ') תוך שימוש באלגוריתם מגרש או תוכנה פגם בנפח גדול; ראה סעיף לדיון, ליו ואח17, לוס ואח35 ו- Dimzon et al.36.
    8. חיפוש החזוי נוסחאות כימיות או גושים נייטרלים נגד המאגר המחוונים כימיה EPA ו/או אחרים מסדי נתונים כדי להחזיר את מבנה כימי פוטנציאלי.
      1. פתח את הכלי EPA Comptox כימיקלים לוח המחוונים אצווה חיפוש (https://comptox.epa.gov/dashboard/dsstoxdb/batch_search) ולהדביק את רשימת מזהי (נוסחאות או גושים) לתוך תיבת מזהה, לאחר בחירת סוג המזהה (קרי, MS-מוכן הנוסחה או מסה Monoisotopic).
      2. בחר להוריד כימית נתונים. ובחר גם את כל הנתונים פיזיקלית/כימית/רעלים הרצויים עבור התאמות פוטנציאליות מהרשימה הנפתחת.
    9. באמצעות האינטואיציה כימי ונתונים הפניה זמין, להסיר גפרורים לא סביר מהרשימה מבנה כימי פוטנציאלי עבור כל נוסחה המבוססת על היתכנות עקב יציבות כימית, מאפיינים פיזיים כגון ionizability או hydrophobicity, נוכחות של ייצור כימיקלים ממקורות הסמוך, וכו '. בהיעדר נתונים נוספים, היתכנות ספקטרלי יכול ובכללה על בסיס הספרות שכיחות; ראה McEachran et al.37.
    10. לאשר מבנים באמצעות התקנים זמינים ו/או יישוב ברזולוציה גבוהה MS/MS תואם של קטעים נגד ספקטרה מסדי נתונים, סיליקו ספקטרה תיאורטי או curation ידנית.

תוצאות

התוצאות LC-MS/MS כמותיים הן בצורה של יון-chromatograms את chromatogram יון סה כ (טיק) ו chromatograms שחולצו יון (EIC) של מעברים כימי מסוים נמדד כימיקלים (איור 1). האזור שיא משולב של מעבר כימי קשורה תרכובת שפע והוא יכול לשמש כדי לחשב את הריכוז המדויק באמצעות עקומת כיול מנורמל ל תקן פנימי (איור 2). התגובה נמוך או שטוח של הפרט analytes מציין כי הטווח כיול הוא מחוץ לטווח ליניארי ספקטרומטר מסה, או כי המכשיר דורש כוונון/כיול. דיוק המסכן של משכפל מצביע על בעיה עם הזרקה מדגם או לא עקבי כרומטוגרפיה הדורש שינוי של פרמטרים LC.

ממוקדות ללא ניתוח באמצעות סריקה מלאה MS1 מניב סוכריית טיק עבור דגימות (איור 3), אשר מאפשר לדור אד הוק של EICs עבור יונים בודדים (איור 4). בכל נקודת זמן כרומטוגרפי נתון מכיל אותות צורון כימי, וכן כאשר באמצעות ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה, טביעת האצבע איזוטרופי של המתחם. זיהוי תרכובות מהסריקה MS1 מתבצע באופן תוכניתי, על ידי אלגוריתם שיא-איסוף באמצעות אחת של מספר גישות38,39,40. שיא האיסוף התשואות תכונות כימיות עם מסה מדויק נמדד זמן השמירה כרומטוגרפי, כמו גם את הספקטרום המונית של יונים לבין אזור הפסגה כרומטוגרפי. מידע זה מאוחסן בדרך כלל תבנית מסד נתונים דיגיטלי בעיבוד נוסף וסינון, אבל מקוננים ובעלת אופי הנתונים ניתן להבין מבחינה מושגית (איור 5).

הרשימה תכונה סינון תרכובות להכיר את אחד מספר קריטריונים שייבחר עבור חקירה נוספת. הראשון, הברור ביותר הוא סינון על-ידי פגם מסה (ההבדל בין המסה המדויקת של תכונה המסה נומינלי). תרכובות PFAS יש מסה שלילית פגמים (איור 6) עקב שלהם שנגדו אטומי פלואור, תרכובות polyfluorinated יש פגמים מסה חיובי, אבל קטנים יותר באופן משמעותי מאשר חומרים אורגניים הומולוגי31,34 . שיטה שנייה סינון שלב היא לזהות הומולוגי סדרה המכילה יחידות חוזרות נפוצות PFAS מינים, כגון CF2 או CF2O. זיהוי אלה יכול להיעשות באמצעות מסה קנדריק פגם מגרשים17,36, או חבילות תוכנה כגון של R nontarget חבילת35 (איור 7).

לאחר סינון, הקצאה של זהות כימית על קצרה של נצפתה באופן מאוד שונה ו/או באופן לא סופי לכל / מינים polyfluorinated יכול להתחיל. מסה מדויק מספק רשימה קטנה יחסית של פוטנציאל כימי נוסחאות עבור התאמה אך אינה מספיקה עבור זיהוי ללא התוספת של ההתאמה ספקטרלי לתבנית איזוטופ של ספקטרום המוני41. מ ברזולוציה גבוהה MS1 נתונים, אחד או יותר נוסחאות כימיות בשם ה"שאילתה איזוטרופי טביעת האצבע של הספקטרום המוני, הבקיע (איור 8). נוסחאות עבור התאמה יכול להיווצר ab initio באמצעות בריכת מוגדרים של אטומים או יכול להיות הטרייה שילוב של ספרות דיווח תרכובות ואת התוכן של מסדי נתונים אחד או יותר. המארחים אותנו EPA כימיה לוח מחוונים (https://comptox.epa.gov/dashboard/) רשימה המתעדכנת כל הזמן של תרכובות PFAS המזוהה על-ידי הסוכנות, וכן רשימות שנאספו על ידי ארגונים אחרים כגון רשת נורמן42.

נוסחאות כימיות יכול להיות מאושרות יותר, חלק מהמידע מבניים יכולים להיות שנלמדו לפי MS/MS ספקטרה (איור 9). המועמד מבנים זמינים כימי מסדי נתונים גדולים כגון לוח המחוונים כימיה של המשרד לאיכות הסביבה, Pubchem, מספר סידורי, וכו '. ספקטרה החזוי יכול להיווצר או רכשה באמצעות מגוון של תוכניות פיצול, מוקצה,43 או MS/MS ספקטרה יכול להתפרש באופן ידני.

מטריצת נתונים לדוגמה הוא זמין במידע משלים הכולל מטריצה תכונה כל מדגימות עשר (5 במעלה הזרם, 5 במורד הזרם) שנאספו במעלה הזרם במורד הזרם של שטיח המקור. כל שורה מייצגת תכונה כימית עם זמן השמירה משויך, מסה נייטרלי, ספקטרום המונית ושפע raw עבור כל דגימה. (טבלה משלימה, גיליון 1). הראשונית סינון (טבלה משלימה, גיליון 2) פגם מסה שלילית, מובהקות סטטיסטית במבחן t אינטראקצית בין הזרם ויוצאת מפחיתה את מספר תכונות כימיות "מעניינות" ל ~ 120. נוסחות כימי החזוי היו המתקבל Agilent IDBrowser וערכו נגד המחוונים כימיקלים Comptox המשרד לאיכות הסביבה, והחזירו האפשר תואם (טבלה משלימה, גיליון 3). "טופ-להיט" עבור כל נוסחה כימית בהתבסס על מקורות נתונים37 הוצב (טבלה משלימה, גיליון 4). שימו לב כי יותר ממחצית התכונות הנותרות אין לי גפרורים באיכות גבוהה. תכונות מזוהה עם גפרורים יכול להיות התוצאה של היווצרות קוד בפיצול/adduct, הקצאה נוסחה עני, או הזיהוי של PFASs לא נמצאה במסד נתוני המקור. פרשנות של ספקטרום גלם על מנת לאמת את הקצאות מעבר להיקף של כתב יד זה אבל ניתן למצוא מידע נוסף עבודות מצוטט15,30,31,44, 45.

מזההלדוגמה שםסוג המדגםריכוז או משחק Stdבקבוקוןשיטת LCשיטת MS
1DB_001ריק1:A, 1PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
2DB_002ריק1:A, 1PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
3DB_003ריק1:A, 1PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
4DB_004ריק1:A, 1PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
5DB_005ריק1:A, 1PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
6פנסיון מלאריק1:A, 2PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
710 stdתקן101:A, 3PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
825 stdתקן251:A, 4PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
950 stdתקן501:A, 5PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
10100 stdתקן1001:A, 6PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
11250 stdתקן2501:A, 7PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
12500 stdתקן5001:A, 8PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
13750 stdתקן7501:B, 1PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
141000 stdתקן10001:B, 2PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
15DB_006ריק1:B, 3PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
16SB_DUP1Analyte1:B, 4PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
17SB_DUP2Analyte1:B, 5PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
18אתר SW 03Analyte1:B, 6PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
19SW באתר 16Analyte1:B, 7PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
20SW האתר 30Analyte1:B, 8PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
21DB_007Analyte1:C, 1PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
22אתר SW 19Analyte1:C, 2PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
23SW האתר 48Analyte1:C, 3PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
24אתר SW 49Analyte1:C, 4PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
25SW האתר 05Analyte1:C, 5PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
26אתר SW 47ריק1:C, 6PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
27DB_008Analyte1:C, 7PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
28SW באתר 19_DUPAnalyte1:C, 8PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
29SW האתר 20Analyte1:D, 1PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
30SW האתר 21Analyte1:D, 2PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
31אתר SW 46Analyte1:D, 3PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
32אתר SW 47Analyte1:D, 4PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
33DB_009ריק1:D, 5PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
28SW האתר 32Analyte1:D, 6PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
29SW באתר 50Analyte1:D, 7PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
30SW באתר 25Analyte1:D, 8PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
31SW באתר 21_DUPAnalyte1:E, 1PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
32SW באתר 52Analyte1:E, 2PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
33DB_010ריק1:E, 3PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
34פנסיון מלאריק1:A, 2PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
3510 stdתקן101:A, 3PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
3625 stdתקן251:A, 4PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
3750 stdתקן501:A, 5PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
38100 stdתקן1001:A, 6PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
39250 stdתקן2501:A, 7PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
40500 stdתקן5001:A, 8PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
41750 stdתקן7501:B, 1PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
421000 stdתקן10001:B, 2PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
43DB_011ריק1:B, 2PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות
44DB_012ריק1:E, 4PFAS גראד 400uL/min - 9 דקות לרוץPFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 דקות

טבלה 1: worklist לדוגמה עבור ניתוח ממוקד וכימות של PFAS באמצעות LC-MS/MS

זמן
(דקות)
0		% A
(אצטט אמוניום 2.5 ממ ב- 5% MeOH)
90		% B
(אצטט אמוניום 2.5 ממ ב 95% MeOH)
10
51585
5.10100
70100
7.19010
99010

טבלה 2: מעבר דוגמה להפרדה LC בניתוח יישוב

Capilary מתח (kv)1.97
קונוס מתח (V)15
חולץ מתח (V)3
עדשה RF (V)0.3
מקור Temp150
Desolvation Temp40
זרימת הגז desolvation (L לשעה)300
זרימת הגז קונוס (L לשעה)2

טבלה 3: יינון מקור פרמטרים עבור ניתוח ממוקד

Cmpקודמןהמוצרזמן להתעכבקונוס מתח (V)אנרגיית התנגשות (eV)
PFBA212.80168.750.011510
13C 4-PFBA הוא216.80171.750.011510
PFPeA262.85218.750.01159
PFBS ° 1298.7079.900.014030
PFBS ° 2298.7098.800.014028
PFHxA ° 1312.70118.700.011321
PFHxA ° 2312.70268.700.011310
הוא 13C 2-PFHxA314.75269.750.01139
HFPO-DA 1°329.16168.900.011012
HFPO-DA 2°329.16284.900.01106
HFPO-דא הוא 1°332.16168.900.011012
HFPO-DA הוא 2°332.16286.900.01106
PFHpA ° 1362.65168.650.011417
PFHpA ° 2362.65318.700.011410
PFHxS ° 1398.6579.900.015038
PFHxS ° 2398.6598.800.015032
13C 4-PFHxS הוא402.6583.900.015038
PFOA ° 1412.60168.700.011518
PFOA ° 2412.60368.650.011511
13C 4-PFOA הוא416.75371.700.011511
PFNA ° 1462.60218.750.011517
PFNA ° 2462.60418.600.011511
PFNA הוא467.60422.600.011511
עמק חפר ° 1498.6579.900.016048
עמק חפר ° 2498.6598.800.016038
הוא 13C 4-עמק חפר502.6079.700.016048
PFDA ° 1512.60218.750.011618
PFDA ° 2512.60468.550.011612
13C 2 - הוא PFDA514.60469.550.011612

טבלה 4: טבלת מעבר לדוגמה ופרמטרים MS/MS עבור התוכן של PFAC-MXA, יחד עם HFPO-DA

זמן
(דקות)		% A
(אצטט אמוניום 2.5 ממ ב- 5% MeOH)		% B
(אצטט אמוניום 2.5 ממ ב 95% MeOH)
09010
0.59010
35050
3.55050
5.54060
64060
70100
110100

טבלה 5: הדרגה דוגמה להפרדה LC בניתוח שאינו ממוקד

הפרמטר profinderקביעת ערך
חילוץ שיא גובה מסנןספירות 800
Ion(s) המותר-H / + H
תכונה החילוץ איזוטופ מודלמולקולות אורגניות נפוצות
הברית המטען המותר2 בינואר
סף ספירת יון מורכביונים של שניים או יותר
יישור RT סובלנות0.40 דקות + 0.0%
רגישות מסה יישורppm 20.00 + 2.0mDa
עיבוד דפוס מסנן גובה מוחלט> = 10000 ספירות מדגם אחד
עיבוד דפוס MFE ציון מסנן> = 75 אחד מדגם
אלגוריתם אינטגרציה שיא2 זריז
שיא אינטגרציה גובה מסנן> = ספירות 5000
למצוא על-ידי מסנן גובה מוחלט יון> = ספירות 7500 מדגם אחד
למצוא על-ידי מסנן הציון יון> = 50.00 אחד מדגם

טבלה 6: תכונה מולקולרית החילוץ והגדרות יישור עבור תוכנת Profinder. כל הערכים חסוי נשמר את הגדרות ברירת המחדל עבור עיבוד נתונים.

יון שפע הסףתכונה ספישכפול סף (n = 5)בזמן ריצהתכונותעוברים את הסף שכפלעוברים את הסף CVתכונות 90% של טיק
1 x S/N2000אף אחד8.1598750542191
2 x S/N5000אף אחד5.0270735731393
3 x S/N10000אף אחד2.330824923093
1 x S/N2000100%3.360333929792
2 x S/N35000100%1.5831024822993
3 x S/N10000100%1.4520219018292

טבלה 7: השוואה של זמן עיבוד הדגימה, תכונה כימיים ופיזיקליים עבור תכונה שונה החילוץ ספי.

figure-results-1
איור 1 : סה כ chromatogram יון, יון שחולצו chromatograms של תת-קבוצות של סטנדרטים אתר perfluorinated. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-2
איור 2 : עקומות כיול נציג עבור תרכובות הוכחת הפחתת איכות הבנייה עקומת אנליטי. בלוח השמאלי ביותר מצביע על כיול באיכות גבוהה; בחלונית האמצעית מציינת תרכובת בדייקנות המסכן ברחבי כפילויות הכנה, במיוחד בריכוזים גבוהים; החלונית הימנית מציין עקומה עם דיוק המסכן טווח דינמי ליניארי נמוך, וכתוצאה מכך התגובה שטוח בקצה העליון של טווח כיול, אין קליטה לזיהוי בקצה התחתון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-3
איור 3 : בשכבות יון סה כ chromatograms (טיק) עבור מים עיליים תמציות במעלה הזרם וערכו במורד הזרם של אתר ייצור שטיח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-4
איור 4 : יון שחולצו chromatograms (EIC) עבור כל זיהה תכונות כימיות של דגימת מים עיליים המכיל מספר מחלקות שטיח. כל עקבות כימיים היא בצבע שונה עבור בידול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-5
איור 5 : דיאגרמה מושגית של raw ומידע החזוי עבור תכונה כימית מזוהה חומצה דיימר תחמוצת hexafluoropropylene (HFPO-DA). תכונות כימיות נאסף ממקור תוכנת חילוץ נתונים גולמיים מ MS מדידות ומכילים כרומטוגרפי (למשל, זמן השמירה (RT)), מסה ספקטרומטר מידע. הנוסחה החזוי, מבנים, זהויות כימי נוצרות מתוך נתוני המדידה גולמיים עבור כל תכונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-6
איור 6 : פגם מסה חלקה עבור תכונות כימיות מזוהה ייצור outfall (אדום, שמאלה), הפניית מים עיליים (כחול, נכון). תרכובות Fluorinated נופלים ליד ומתחת מקווקו את קו האפס. הערה הסדרה PFOA/עמק חפר מתמיד במדגם מים עיליים רקע (מימין). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-7
איור 7 : מסה vs פגם מסה מגרש עבור תכונות כימיות לא מזוהה מתוך מדגם מים עיליים עם סדרת הומולוגי המזוהים ומתויגים מאת nontarget החבילה R. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-8
איור 8 : קשת מסה תכונות כימיות לא ידוע עם עוצמות איזוטרופי החזוי של שלושה נוסחה כימית אפשרי עם monoisotopic אותו למיסה אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-9
איור 9 : פיצול ספקטרום של האתר perfluorinated. הרכב עם מבואר פרגמנט פיקס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-10
איור 10 : ייצוג גרפי של סינון ספי. משמאל לסף שפע יון צודק, עבור תכונה כימית ספקטרה המוני, כוללים שפע הסף עבור תכונות כרומטוגרפי שחולץ ולאחר שכפול סף עבור התכונה זיהוי תדר בניסוי הזרקת triplicate. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

דיון

עקרונות הטיפול מדגם
ההכללה של הפניה/ספייק סטנדרטים הם ערך עליון בכל ניתוח ממוקד, כפי שהם מספקים ויצא מהצד השני לבדיקת תוקף אנליטית. חוסר QC דגימות מונע כל הערכה של דיוק התוצאות; הטבע בכל מקום של fluorochemicals כלומר הסיכוי לזיהום של דגימות שדה, עיבוד חומרים, או LC-MS מערכת אינו נדיר חייב להיות אחראים. עוד, זה מאפשר האימות של פרוטוקול ללא קשר וריאציה במדגם היומיומית עיבוד, כפי שרבים מהשלבים יכול להיות משתנה מאוד, במיוחד את SPE והשלבים ריכוז לדוגמה. החילוץ של שני כימיקלים perfluorinated מדור קודם, רומן יכול להיות מושפע בכבדות על-ידי הבחירה של שלב נייח ריכוז והרכיבים של הדגימות מקור, כגון pH ומליחות46. יש לקחת בחשבון את ההשפעה של תנאי מדגם אם למחלקות של pefluorinated כימיקלים הם עניין. ניתן להשתמש ערכות הכנה אלטרנטיביים דוגמת מים תמציות אם מעבדה ההתקנה אינו זמין, ניתוח הנתונים במורד הזרם נשאר דומה.

ניתוח נתונים יישוב
עבור תרכובות עם סטנדרטים הזמינים, איזוטופ מתאימים, יציב עם התווית סטנדרטים פנימיים, החשש העיקרי לניתוח נתונים הם פלייבק והנחישות של שיטת זיהוי גבולות ואת טווחי דיווח מתאים יכול להיקבע על מעבדה-מאת-מעבדה בסיס שימוש בגישות סטנדרטיים, כגון יחס אות לרעש סטנדרט ברמה נמוכה קוצים47. בהיעדר תואם סטנדרטים פנימיים שגיאות מתופעות לא תואמת מטריצה יכולות להתרחש, הגב-חיזוי מדויק של דגימות מחודדים יכול לשמש כדי להעריך את הדיוק של המדידות. כאשר חסר תקנים כדי להכין עקומה, הערכה כמותית של ידוע יכול להתבצע בכך שהוא מתייחס אליה באופן זהה סטנדרט שהותאמו באופן הדוק במתחם, אך טעויות בהערכת גודל 10 + קיפול מוגבלת היכולת לכמת את הוודאות, רואה מק'קורד, ניוטון, Strynar21. במקרים אלה, עדיין ניתן לאסוף נתוני המגמה, אבל ריכוז הערכות להסתמך.

ניתוח נתונים שאינם במיקוד
הגדרות האיסוף שיא יש השפעה משמעותית על מספר תכונות כימיות מזוהה, אבל האיכות של בחירת תכונות מושפע גם בכבדות. ההחלטות של התעניינות שיא האיסוף הם 1) עוצמת בודדים גושים כלילה הסף שפע יון 2) את עוצמת שחולצו chromatogram פיקס כדי להיחשב תכונות, זיהוי 3) כוללים תכונת הסף שפע ספקטרה, תדירות, הסף שכפל ו- 4) וריאציה אנליטית, הסף CV (איור 10).

הגדרת סף נמוך unrealistically עבור שיא איסוף תוצאות גידול מעריכי לדוגמה זמן לפתור את תכונות נוספות של שפע יותר ויותר נמוך (טבלה מס ' 7). המסננים הסף יון-שפע המוניים תכונות ספקטרליות איפה מספיק abundances איזוטופ בודדים שאינם עוברים את הסף. פעולה זו בוחרת באופן אידיאלי רק עבור תכונות עם איכות MS ספקטרה, הבטחת שהם תכונות כימיות ממש במקום רעש פלייבק, ומאפשר לחיזוי נוסחה בעיבוד במורד הזרם. הסף המתאים מבוססת על רעש פלייבק, אידיאלי לפחות 3 x הסף רעש עבור MS1 סורק. תכונה שפע הסף מסנן תכונות כימיות המבוססת על עוצמת או אזור של התכונה כרומטוגרפי שחולצו. שלב זה מאפשר דחייה של פסגות שפע נמוכה, אשר בדרך כלל באיכות ירודה כרומטוגרפי, יש סטיות גבוהה או הם התוצאה של מיצוי המסכן תוכנה אחרים. הסף המתאים צריכה להיקבע לכל ניסוי, לכל מטריצה המבוססת על רמת הדור המסכן תכונה (למשל, תכונות מתחת כרומטוגרפיה בעלי המסכן התערוכה הסף). בהמשך QC אנליטית יכול להיות נהגה לדחות תכונות ברמת כרומטוגרפי המבוססת על זיהוי לא עקבי באנליטי ו/או הכנה משכפל (מפתן שכפל) או בהתבסס על הפארמצבטית המסכן מעבר משכפל (CV מפתן). רמות המתאים תלויות איכות שיא שילוב התוכנה ששימשה וישויות כימי תחת חקירה. עבור תרכובות perfluorinated מסיסים במים והפרוטוקולים שילוב אופטימיזציה בקלילות, תכונות צריך להיות מזוהה ב- 80 + % אנליטי משכפל ו CVs צפויים ליפול מתחת 30%, כמפורט בסעיף שיטות.

הפסגות זוהה מניתוח שאינן ממוקדות לא תשואה הערכות כמותיות של ריכוזי החומרים זוהה. יתר על כן, הזהות של אלמונים נכון יכול להיות קשה לאשר כי תרכובות הרומן נעדרים ממסדי נתונים זמין לציבור. נחישות מבניים הרומן דורש ניתוח מקיף עם שיטות מרובות ואינו דורש מומחיות ספקטרומטר מסה וכימיה. עם זאת, נרמול האזורים שיא של תכונות כימיות יכול לספק הערכות כמותיות למחצה של ריכוזי נעלמים מינים מוכרים21. אם הדגימה עקבי ושלבי ההכנה הם מועסקים, זמן מידע מגמה עבור מינים בודדים יכול להיווצר לפקח התמדתו של חומר כימי העתיד כמו התגובה מינים בודדים צריך להיות עקבי אלא אם כן יהיו גדולים וריאציות מטריקס21.

היתרון העיקרי של שיטה זו הוא ההרחבה של הטיפול הדגימה כדי לאפשר ניתוח ממוקד והן nontargeted. בעוד ניתוח יישוב מספק מידע כמותי מקביל או מעולה, היא מאוד חסרה ולרוחבה של ניתוח הרצוי בעת התמודדות עם חומרים חדשים ומתפתחים, כמו גם היחסים שלהם לחומרים מטריקס. החלת מתודולוגיה יישוב, או אפילו חשוד הקרנת שיטה מבוסס רק על חומרים הידועים, מסדי נתונים מוגבלים עיוור לחלוטין מינים unobserved בעבר, אפילו אם ייתכן שיש להם השפעות בריאותיות משמעותיות. משפר את התוכנה, מסדי נתונים הופכים עמידים יותר, דיוק הזיהוי לא ידוע תמשיך לגדול, עם ירידה הנוטלים הזמן וההשקעה ורמת המומחיות צורך לנתח את הנתונים רב-ממדי שנוצר על ידי זה הגישה. בכל זאת, נתונים שנוצרו כיום היא בעל ערך משמעותי בעתיד כי נתונים בנקאות מאפשר ניתוח פוסט-הוק עם התוכנה החדשה שפותחה ומאפשר השוואה לאורך זמן גם אם זהותו של תרכובת שזוהו אינו ידוע כיום.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

ארצות הברית הסוכנות להגנת הסביבה, באמצעות Office של המחקר והפיתוח שלה, במימון וניהל את המחקר המתואר כאן. מסמך זה כולל נבדקו על ידי הסוכנות להגנת הסביבה של ארה ב, משרד של מחקר ופיתוח, ואף אושרו לפרסום. הדיעות במאמר זה הם אלה של המחברים, ואינן מייצגות בהכרח את ההשקפות או מדיניות של הסוכנות להגנת הסביבה ארה ב. מחקר זה נתמך בחלקה על ידי פעילות התוכנית מחקר פוסט-דוקטורט במעבדה הלאומית חשיפה המחקר מנוהל על ידי המכון אוק רידג מדע וחינוך דרך הסוכנויות DW89992431601 הסכם בין משרד האנרגיה האמריקני, הסוכנות להגנת הסביבה של ארה ב.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מערכת כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד של Acqity ווטרסשונה עם ערכת ניתוח PFCs (176001744); מערכת UPLC מקבילה מקובלת אם רקע PFAS נבדק ואושר כנמוך
אמוניום אצטטFluka17836ספקטרומטריית מסה דרגה >99%
אמוניום הידרוקסידSigma-Aldrich338818
BalanceMettlerAB204S
BEH C18 עמודת UPLC שלב הפוך, 2.1 ופעמים; 50  מ"מ, 1.7  μ מ תאגיד ווטרס186002350
משאבת מזרק בוכנה כפולה תאגיד ווטרסSPC10-C
חומצה אצטית קרחוניתסיגמא-אולדריץ'ARK2183 
מסנני מיקרופייבר זכוכיתWhatman1820-070
בקבוק מדגם פוליאתלי בצפיפות גבוהה נלג'ין2189-0032 
ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוההשוניםצריך להיות מסוגל לספק מסה מדויקת ל-< 10 דפים לדקה ואיסוף נתוני MS/MS.  Agilent 6530 qTOF ו-Thermo Fisher Orbitrap Fusion שימשו בעבודה זו
מתנולסיגמא-אולדריץ'
חומצה חנקתית (35% w/w)Thermo Fisher ScientificSVCN-5-1ניתן להכין בבית באמצעות חומצה חנקתית מרוכזת ומי ריאגנט
משפך פוליפרופילן בוכנרACE Glass12557-09 
צינור וכובע צניטרפוגה מפוליפרופילןBD Falcon352096
בקבוק ואקום פוליפרופילן (1 ליטר)NalgeneDS4101-1000
Quattro Premier XE ספקטרומטר מסה מרובע משולש במקום זאת ניתן להשתמש במערכת מקבילה לשלושה קוואדרופול או טובה יותר, אמורה לספק רגישות ויציבות גבוהות
מיםכל מקור שנקבע כנטול PFAS
נתרן אצטטסיגמא-אולדריץ'W302406
מאייד חנקן TurboVap להשתמש במקום זאת במערכות שוות ערך ל 103198 מדעי החיים של קליפר או מאייד ואקום סיבובי
מחסנית SPE להחלפת אניונים חלשה (Oasis WAX Plus)Waters Corporation186003519
<פתרונות חזקים>סטנדרטיים
2,3,3,3-Tetrafluoro-2-(1,1,2,2,3,3,3,3-heptafluoropropoxy)חומצה פרופנואית (HFPO-DA)וולינגטוןHFPO-DA
תקני תרכובות ממוקדיםשייקבעו על סמך ניתוח ראשוני וזמינות סטנדרטית
מקורית HFPO-DAWellingtonM2HFPO-DA
(2 ug/mL)WellingtonPFAC-MXAאו PFAC-MXB; או תערובת שהוכנה בנפרד המכילה תרכובות מעניינות
איזוטופ יציב עם תווית PFCA/PFAS תערובת (2 ug/mL)WellingtonMPFAC-MXAאו MPFAC-MXB; או תערובת שהוכנה בנפרד המכילה תרכובות מעניינות בהתאם ל-PFAS מקוריים
Software
Mass Profiler ProfessionalAgilentאו חבילות תוכנה בקוד פתוח
ProfinderAgilentאו חבילות תוכנה בקוד פתוח
תאגיד טהור ספקטרומטר מסה לניתוח ממוקד ריאגנטים ניתן נוספים תערובת PFCA/PFAS

מקורות

  1. Provisional Health Advisories for Perfluorooctanoic Acid (PFOA) and Perfluorooctane Sulfonate (PFOS). United States Environmental Protection Agency. , Washington, DC. (2009).
  2. Lifetime Health Advisories and Health Effects Support Documents for Perfluorooctanoic Acid and Perfluorooctane Sulfonate. United States Environmental Protection Agency. , Washington DC. 33250-33251 (2016).
  3. Fact Sheet: 2010/2015 PFOA Stewardship Program. , Available from: https://www.epa.gov/assessing-and-managing-chemicals-under-tsca/fact-sheet-20102015-pfoa-stewardship-program (2006).
  4. EPA and 3M Announce phase out of PFOS. Environmental Protection Agency. , Available from: https://yosemite.epa.gov/opa/admpress.nsf/0/33aa946e6cb11f35852568e1005246b4 (2000).
  5. Wang, Z., Cousins, I. T., Scheringer, M., Hungerbühler, K. Fluorinated alternatives to long-chain perfluoroalkyl carboxylic acids (PFCAs), perfluoroalkane sulfonic acids (PFSAs) and their potential precursors. Environment International. 60, 242(2013).
  6. Scheringer, M., et al. Helsingør Statement on poly- and perfluorinated alkyl substances (PFASs). Chemosphere. 114, 337-339 (2014).
  7. Wang, Z., DeWitt, J. C., Higgins, C. P., Cousins, I. T. A Never-Ending Story of Per- and Polyfluoroalkyl Substances (PFASs). Environmental Science & Technology. 51 (5), 2508-2518 (2017).
  8. Xiao, F., Golovko, S. A., Golovko, M. Y. Identification of novel non-ionic, cationic, zwitterionic, and anionic polyfluoroalkyl substances using UPLC-TOF-MSE high-resolution parent ion search. Analytica Chimica Acta. 988, 41-49 (2017).
  9. Shoemaker, J., Grimmett, P., Boutin, B. Method 537. Determination of selected perfluorinated alkyl acids in drinking water by solid phase extraction and liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC/MS/MS). US Environmental Protection Agency. , Washington, DC. (2009).
  10. Poole, C. F., Gunatilleka, A. D., Sethuraman, R. Contributions of theory to method development in solid-phase extraction. Journal of Chromatography A. 885 (1), 17-39 (2000).
  11. Ahrens, L. Polyfluoroalkyl compounds in the aquatic environment: a review of their occurrence and fate. Journal of Environmental Monitoring. 13 (1), 20-31 (2011).
  12. Higgins, C. P., Field, J. A., Criddle, C. S., Luthy, R. G. Quantitative Determination of Perfluorochemicals in Sediments and Domestic Sludge. Environmental Science & Technology. 39 (11), 3946-3956 (2005).
  13. Szostek, B., Prickett, K. B., Buck, R. C. Determination of fluorotelomer alcohols by liquid chromatography/tandem mass spectrometry in water. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 20 (19), 2837-2844 (2006).
  14. Alzaga, R., Bayona, J. M. Determination of perfluorocarboxylic acids in aqueous matrices by ion-pair solid-phase microextraction-in-port derivatization-gas chromatography-negative ion chemical ionization mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1042 (1-2), 155-162 (2004).
  15. Schaider, L. A., et al. Fluorinated Compounds in U.S. Fast Food Packaging. Environmental Science & Technology Letters. 4 (3), 105-111 (2017).
  16. Lindstrom, A. B., Strynar, M. J., Libelo, E. L. Polyfluorinated Compounds: Past, Present, and Future. Environmental Science & Technology. 45 (19), 7954(2011).
  17. Liu, Y., Pereira, A. D. S., Martin, J. W. Discovery of C5-C17 Poly-and Perfluoroalkyl Substances in Water by In-Line SPE-HPLC-Orbitrap with In-Source Fragmentation Flagging. Analytical Chemistry. 87 (8), 4260(2015).
  18. Backe, W. J., Day, T. C., Field, J. A. Zwitterionic, Cationic, and Anionic Fluorinated Chemicals in Aqueous Film Forming Foam Formulations and Groundwater from U.S. Military Bases by Nonaqueous Large-Volume Injection HPLC-MS/MS. Environmental Science & Technology. 47 (10), 5226-5234 (2013).
  19. Mazzoni, M., Rusconi, M., Valsecchi, S., Martins, C. P. B., Polesello, S. An on-line solid phase extraction-liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the determination of perfluoroalkyl acids in drinking and surface waters. Journal of Analytical Methods in Chemistry. 2015, 942016(2015).
  20. Li, F., et al. Method development for analysis of short- and long-chain perfluorinated acids in solid matrices. International Journal of Environmental Analytical Chemistry. 91 (12), 1117-1134 (2011).
  21. McCord, J., Newton, S., Strynar, M. Validation of quantitative measurements and semi-quantitative estimates of emerging perfluoroethercarboxylic acids (PFECAs) and hexfluoroprolyene oxide acids (HFPOAs). J Chromatoqr A. , (2018).
  22. Wang, Y., Liu, S., Hu, Y., Li, P., Wan, J. -B. Current state of the art of mass spectrometry-based metabolomics studies - a review focusing on wide coverage, high throughput and easy identification. RSC Advances. 5 (96), 78728-78737 (2015).
  23. Cajka, T., Fiehn, O. Toward Merging Untargeted and Targeted Methods in Mass Spectrometry-Based Metabolomics and Lipidomics. Analytical Chemistry. 88 (1), 524-545 (2016).
  24. Mann, M., Kelleher, N. L. Precision proteomics: The case for high resolution and high mass accuracy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18132-18138 (2008).
  25. Sobus, J. R., et al. Integrating tools for non-targeted analysis research and chemical safety evaluations at the US EPA. Journal of Exposure Science & Environmental Epidemiology. , (2017).
  26. Bletsou, A. A., Jeon, J., Hollender, J., Archontaki, E., Thomaidis, N. S. Targeted and non-targeted liquid chromatography-mass spectrometric workflows for identification of transformation products of emerging pollutants in the aquatic environment. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 66, 32-44 (2015).
  27. Viant, M. R., Sommer, U. Mass spectrometry based environmental metabolomics: a primer and review. Metabolomics. 9 (1), 144-158 (2013).
  28. Xiao, F. Emerging poly- and perfluoroalkyl substances in the aquatic environment: A review of current literature. Water Research. 124, 482-495 (2017).
  29. Nakayama, S. F., Strynar, M. J., Reiner, J. L., Delinsky, A. D., Lindstrom, A. B. Determination of perfluorinated compounds in the Upper Mississippi River Basin. Environmental Science & Technology. 44 (11), 4103(2010).
  30. Strynar, M., et al. Identification of novel perfluoroalkyl ether carboxylic acids (PFECAs) and sulfonic acids (PFESAs) in natural waters using accurate mass time-of-flight mass spectrometry (TOFMS). Environmental Science & Technology. 49 (19), 11622(2015).
  31. Newton, S., et al. Novel Polyfluorinated Compounds Identified Using High Resolution Mass Spectrometry Downstream of Manufacturing Facilities near Decatur, Alabama. Environmental Science & Technology. 51 (3), 1544-1552 (2017).
  32. Forsberg, E. M., et al. Data processing, multi-omic pathway mapping, and metabolite activity analysis using XCMS Online. Nature Protocols. 13, 633(2018).
  33. Sturm, M., et al. OpenMS - An open-source software framework for mass spectrometry. BMC Bioinformatics. 9 (1), 163(2008).
  34. Kind, T., Fiehn, O. Seven Golden Rules for heuristic filtering of molecular formulas obtained by accurate mass spectrometry. BMC Bioinformatics. 8, 105-105 (2007).
  35. Loos, M., Singer, H. Nontargeted homologue series extraction from hyphenated high resolution mass spectrometry data. Journal of Cheminformatics. 9, 12(2017).
  36. Dimzon, I. K., et al. High Resolution Mass Spectrometry of Polyfluorinated Polyether-Based Formulation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27, 309(2016).
  37. McEachran, A. D., Sobus, J. R., Williams, A. J. Identifying known unknowns using the US EPA's CompTox Chemistry Dashboard. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (7), 1729-1735 (2017).
  38. French, W. R., et al. Wavelet-Based Peak Detection and a New Charge Inference Procedure for MS/MS Implemented in ProteoWizard's msConvert. Journal of Proteome Research. 14 (2), 1299-1307 (2015).
  39. Tautenhahn, R., Böttcher, C., Neumann, S. Highly sensitive feature detection for high resolution LC/MS. BMC Bioinformatics. 9, 504(2008).
  40. Rafiei, A., Sleno, L. Comparison of peak-picking workflows for untargeted liquid chromatography/high-resolution mass spectrometry metabolomics data analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (1), 119-127 (2015).
  41. Kind, T., Fiehn, O. Metabolomic database annotations via query of elemental compositions: Mass accuracy is insufficient even at less than 1 ppm. BMC Bioinformatics. 7, 234-234 (2006).
  42. Brack, W., Dulio, V., Slobodnik, J. The NORMAN Network and its activities on emerging environmental substances with a focus on effect-directed analysis of complex environmental contamination. Environmental Sciences Europe. 24 (1), 29(2012).
  43. Blaženović, I., et al. Comprehensive comparison of in silico MS/MS fragmentation tools of the CASMI contest: database boosting is needed to achieve 93% accuracy. Journal of Cheminformatics. 9, 32(2017).
  44. Rager, J. E., et al. Linking high resolution mass spectrometry data with exposure and toxicity forecasts to advance high-throughput environmental monitoring. Environment International. 88, Supplement C 269-280 (2016).
  45. Munoz, G., et al. Environmental Occurrence of Perfluoroalkyl Acids and Novel Fluorotelomer Surfactants in the Freshwater Fish Catostomus commersonii and Sediments Following Firefighting Foam Deployment at the Lac-Mégantic Railway Accident. Environmental Science & Technology. 51 (3), 1231-1240 (2017).
  46. Brumovský, M., Bečanová, J., Karásková, P., Nizzetto, L. Retention performance of three widely used SPE sorbents for the extraction of perfluoroalkyl substances from seawater. Chemosphere. 193, 259-269 (2018).
  47. Definition, Definition and Procedure for the Determination of the Method Detection Limit (Revision 2). Environmental Protection Agency. , Federal Regester (2016).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

PFAS
זיהוי לכל-כימית Polyfluorinated מינים בזרימת עבודה משולבת יישוב, שאינו ממוקד-סינון ברזולוציה גבוהה ספקטרומטר מסה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.