השיטה המוצגת יוצרת הרביוור טבעי הנזק רקמת הצמח באמצעות היישום של מנדוקה הזחלים סקסטה להתנתק עלים של תפוחי אדמה. רקמת הצמח הוא הבעה ביטוי של שישה שעתוק גורם הומויומני מעורב בתגובות מוקדמות לחרקים העשב.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מנותקת עלה assays לפשט גנים ביטוי לימודי תפוחי אדמה במהלך התפשטות על ידי לעיסת חרק manduca סקסטה
במאמר זה
סיכום
תקציר
הטבע הmultitrophic של לימודי גנים של העשב המאלף חרקים דורש מספר רב של משכפל ביולוגי, היוצר את הצורך לפרוטוקולים פשוטים ויעילים יותר של העשב. רטבאליות של חרקים לעיסה לומדים בדרך כלל במערכות צמחים שלמות. בעוד שאסטרטגיית האורגניזם הזאת פופולרית, אין בכך צורך אם ניתן לשכפל תצפיות דומות בעלה מנותק אחד. ההנחה היא שאלמנטים בסיסיים הנדרשים להתמרה של אותות נמצאים בתוך העלה עצמו. במקרה של אירועים מוקדמים של התמרה אותות, התאים צריכים רק כדי לקבל את האות מתוך הפרטורציה ולשדר את האות לתאים השכנים אשר מחכים לביטוי גנים.
השיטה המוצעת פשוט משנה את התזמון של הניתוק. בניסויים צמחיים שלמים, הזחלים מוגבלים לעלה בודד אשר מנותקת בסופו של דבר מן הצמח ומרותק לביטוי גנים. אם הסדר של כריתה מתהפך, מאחרון בלימודי המפעל כולו, לראשונה במחקר הפרטי, ניסוי ההזנה הוא פשוט.
. סולנום טובראוסום באר קנאו מופץ על ידי העברה קטרי במדיום תרבות פשוטה בינונית והועברה קרקע לצמיחה נוספת אם תרצה. העלים מוגשים ממפעל ההורים והועברו למנות פטרי שבהן מתנהל שיטת ההזנה עם שלבי הזחל של מדיום. רקמת עלה פגומה הינה לביטוי של אירועים מוקדמים יחסית של התמרה אותות. ניתוח ביטויים גנטיים זיהה התפשטות Cys2-His2 (C2H2) גורמים שעתוק, המאשרת את ההצלחה של שימוש בעלים מנותקים במחקרים מוקדמים של התגובה. השיטה היא קלה יותר לבצע מאשר הצמח שלמות התחנות והוא משתמש פחות שטח.
מבוא
הרבורי מגדיר בתנועה סדרה של אירועים מולקולריים שבהם צמח יכול לזהות את המתקפה ולטעון תגובה מתאימה להישרדותה. צמח מקבל שני רמזים בסיסיים מלעיסת חרקים; אחד מהנזק הפיזי לרקמה ולשני מחומרים ספציפיים לחרקים. תבניות מולקולריות משויכות לנזקים (DAMPs) שוחררו בתגובה לנזק שנוצר על-ידי חלקי הזחל ומפעיל תגובת פציעה מוגדרת היטב הנובעת מגידול בחומצה ההורמון לימונית ותמלול גנים הביטחון1. אחד מהדואמפר הידועים ביותר הוא מערכת, פוליפפטיד הנוצרת על ידי המחשוף של החלבון prosystemin גדול יותר לאחר עלה נפצע2,3. התגובה הפצע החומצה הממונית הוא עוד מאופנן על ידי דפוסי מולקולרי הרביוור-הקשורים (HAMPs), אשר יכול ל....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: הפרוטוקול הבא מיועד להגדרה של אדם אחד, לבצע תצפיות ולאסוף דגימות. ניתן לשלב רצפים מרובים של אותה התקנה כדי להגביר את השכפול הביולוגי. כל חזרות נוספות של הניסוי יש להגדיר באותו זמן ביום כדי למנוע השפעות יומי אפשרי על הביטוי גנים. הפרוטוקול נועד ליצור 3 "שורץ" עלים עבור 5 נקודות זמן הקציר נפרד. שליטה בהתאמה עוזב עבור כל נקודת זמן ליצור סך של 30 דגימות. ניתן לבצע את הניסוי במגוון גדלים של עלים ושלבי זחל, אך מומלץ כי גודל העלה, הזחל וזמן התפשטות יהיו עקביים במהלך התהליך.
1. הכנת צמחי תפוחי אדמה
הערה: יש לבצע את כל השלבים המחייבים טכניקה סטרילית במכסה של תרבות הרקמה18,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
צריכה העלה מגדירה הצלחה של הפרוטוקול. בריאים, הזחלים מבוים באופן מדויק צריך להתחיל להאכיל מיד לאחר הצבת על פני השטח ועל האכלה צריך להמשיך באופן עקבי למדי לאורך זמן הפלישה. ב וידאו 1, הזחל בחלק העליון מתחיל ללעוס מיד לאחר המיקום ושומר על שיעור עקבי תוך כדי האכלה. זה חשוב במיוחד אם לומר אירועים ביטוי גנים מוקדם לאחר התפשטות. הזחל בתחתית לא צורכים כל חומר עלה והוא דוגמה של התפשטות מוצלח.
קירובים חזותית במהלך צריכת .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השימוש הקיים הצמח כולו מתודולוגיות העשב הוא מיותר להשיג את המטרה של מחקר מסוים זה (כלומר, המסך מערכת של גנים המועמדים לתגובה שלהם התפשטות). היתרון הברור של עידון העלה הפרטי הוא קיצור הזמן שלוקח לבצע העשב vory assays. הטבע המרפא של צמחים שלמים עם כלובים מסולקים מסולק והוא מבוצע מוקדם יותר, מאז הצמחים צעירים כמו 2 שבועות ניתן להשתמש כדי הקציר עלים. זה דורש גם טביעת רגל קטנה הרבה יותר במהלך האכלה ופחות חלל קאמרית הצמיחה; חשוב גם כאשר משאבים אלה מוגבלים.
המגבלה של מעשה זה, כלומר ניתוק, נתקל כאשר ב.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
המחברים רוצים להודות בוב Farrar ואלקסיס פארק עבור מתן חרקים המשמשים במחקר זה ועבור המומחיות שלהם בזחל הזמני. תודות למייקל בלקברן ולסקאט גוש לסקירה קריטית של כתב היד.
ציון שמות המסחר או מוצרים מסחריים בפרסום זה מיועד אך ורק לצורך מתן מידע ספציפי ואינו מעיד על המלצה או אישור על ידי משרד החקלאות של ארצות הברית.
משרד החקלאות הוא ספק הזדמנויות שוות ומעסיק.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| תחליף אגר | מוצר PhytoTechnology Laboratories | G3251 | של גלזן |
| (צלחת 6,12 או 24 בארות) | פישר סיינטיפיק | 08-772-49, 08-772-50, 08-72-51 | חברות רבות אחרות מוכרות את המוצרים הללו |
| ביצי מנדוקה | חברת האספקה הביולוגית של קרוליינה | 143880 | 30-50 ביצים |
| ביצי מנדוקה | תולעת קרן האגמים הגדולים | NA | 50, 100, 250 או 500 ביצים |
| זחלי מנדוקה | חברת האספקה הביולוגית של קרוליינה | קוראים לבקשות כוכב זחל ספציפיות | כל |
| זחלי מנדוקה | תולעת קרן | קוראים לבקשות כוכב זחל ספציפיות | כל |
| צינורות מיקרוצנטריפוגה instar, 1.7 מ"ל | תומס סיינטיפיק | 1158R22 | אלה נבדקו בנוזל N2 ולא יתפוצצו |
| Murashige & Skoog (MS) בינוני בזאלי עם ויטמינים | מעבדות PhytoTechnology | M519 | המשמש לייצור תערובת אגר תזונתית בינונית התפשטות |
| PhytoTechnology Laboratories | M5825 | המוצר הוא Murashige & סקוג בזל בינוני עם ויטמינים, סוכרוז | |
| ודיסקיות סינון נייר | פישר סיינטיפיק | 09-805A | מעגלי ווטמן-רכישה להתאמה לצלחת פטרי צלחת |
| פטרי, 60X15 מ"מ או 100X15 מ"מ | פישר סיינטיפיק | FB0875713A או FB0875712 | המתאים |
| לפקעות תפוחי אדמה בגודל עלים | כל | גודל B (לא אורגני) | מציע חקלאי מיין" s סירי החלפה |
| , 10 אינץ' | גריפין חממה אספקה, בע"מ | 41PT1000CN2 | |
| משמר/ביוציד | טכנולוגיית תאי צמח | NA | הוא PPM (תערובת משמרת צמחית) |
| תפוחי אדמה זרעים למקור אקספלנט | בכל | גודל B (לא אורגני) | מציע חקלאי מיין' s החלפת |
| דשן בשחרור איטי (14-14-14) | כל | NA | Osmocote הוא שם מותג פופולרי |
| מלקחיים רכים למגע | BioQuip | 4750 | |
| תערובת אדמה | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 65-51121 | המוצר הוא Sunshine LC1 mix |
| כלי תרבית סטרילי | PhytoTechnology Laboratories | C2100 | כלי מסוג מגנטה, כלי תרבית סטרילי PTL-100 |
| פישר סיינטיפיק | מוצר ICN2672206 | הוא MP Biomedicals Plantcon |
מקורות
- Choi, H. W., Klessig, D. F. DAMPs, MAMPs, and NAMPS in plant innate immunity. BMC Plant Biology. 16, 1-10 (2016).
- Pearce, G., Strydom, D., Johnson, S., Ryan, C. A. A polypeptide from tomato leaves induces wound-inducible proteinase inhibitor proteins. Science.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
