הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הזרקה ישירה של וקטור Lentiviral מדגיש מספר מסלולים מוטוריים בחוט השדרה עכברוש

8.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59160

⸱

15 במרץ 2019

 ,  ,  ,  , 
1Shriner's Pediatric Research Center, Temple University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מדגים הזרקה של וקטור ויראלי יביל retrogradely לתוך רקמות חוט השדרה חולדה. וקטור שצולמו הסינפסה, מועברים לגוף התא של נוירונים היעד. מודל זה מתאים רטרוגרדית העקיבה של מסלולים בעמוד השדרה חשוב או תאים מיקוד ליישומים טיפול גנטי.

תקציר

היכרות עם חלבונים עניין לתוך תאים במערכת העצבים הוא מאתגר עקב המונעים ביולוגית מולדת להגביל את הגישה רוב המולקולות. הזרקה ישירות לתוך חוט השדרה רקמות עוקף מחסומים אלה, והיא מספקת גישה אל גוף התא או synapses איפה ניתן לשלב מולקולות. שילוב טכנולוגיה וקטור ויראלי בשיטה זו מאפשר החדרת גנים היעד לתוך רקמות עצבים לצורך ריפוי גנטי או מערכת עקיבה. כאן וירוס מהונדס להעברה רטרוגרדית יעילים ביותר (HiRet) הוא הציג את הסינפסות של propriospinal interneurons (מערכת העצבים ההיקפית) כדי לעודד תחבורה ספציפית את הנוירונים בחוט השדרה, גזע המוח גרעינים. פילוח מערכת העצבים ההיקפית מנצל הקשרים רבים שהמוענק להם מסלולים מוטוריים נרחבים של rubrospinal ו- reticulospinal, כמו הקישוריות שלהם אחד עם השני לאורך חוט השדרה מקטעים. נציג מעקב באמצעות וקטור HiRet בפרטים צורונים פעילים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מראה דיוק גבוה של תא גופות, אקסונים ו דנדריטים ובשבילים מערכת העצבים ההיקפית בית החזה, reticulospinal נוירונים ב רשתית pontine. HiRet משלבת גם לתוך משעולים גזע המוח, מערכת העצבים ההיקפית, אבל מראה והשתלבות נוירונים בדרכי corticospinal תלוי גיל. לסיכום, הזרקת חוט השדרה באמצעות וקטורים ויראלי הוא שיטה מתאימה על ההקדמה של חלבונים עניין לתוך הנוירונים של יישוב שטחים.

מבוא

וקטורים ויראלי הם כלים ביולוגי חשוב יכול להציג חומר גנטי לתוך התאים על מנת לפצות על גנים פגומים, upregulate צמיחה חשוב חלבונים או מייצרים חלבונים סמן המדגישות את המבנה ואת קשרים סינפטיים של המטרות שלהם. מאמר זה מתמקד הזרקה ישירה של וקטור lentiviral retrogradely הניתנים להעברה יעילה במיוחד לתוך חוט השדרה חולדה כדי לסמן מסלולים מוטוריים הגדולות עם עקיבה פלורסנט.  שיטה זו גם מאוד מתאים ללימודי רגנרציה ומחזור לצמיחה מחודשת עצב להציג חלבונים עניין לתוך אוכלוסיות מגוונות של נוירונים, נעשה שימוש כדי להשתיק את הנוירונים עבור מיפוי פונקציונלי מחקרים1,2.

חלק מהפרטים האנטומי של מסלולים מוטוריים בעמוד השדרה היו מבואר דרך הזרקה ישירה מחקרים עם המשדרים קלאסית כגון BDA ופטור-זהב3,4,5,6,7 , 8. המשדרים הללו נחשבים תקן הזהב, אבל אולי יש חסרונות מסוימים כגון ספיגת מאת אקסונים פגומים או אקסונים בקטע של החומר הלבן שמסביב זריקה באתר9,10,11 . זה יכול להוביל פירושים שגויים של מסלול קישוריות, יכול להיות חיסרון במחקרים התחדשות איפה לצבוע הקליטה על-ידי אקסונים פגומים או קטוע אפשר לטעות, ולשם רגנרציה סיבי במהלך ניתוח מאוחר יותר12.

וקטורים lentiviral פופולריים במחקרים טיפול גנטי, כפי שהם מספקים יציב, לטווח ארוך ביטוי אוכלוסיות עצביים13,14,15,16,17,18 ,19. עם זאת, באופן מסורתי הארוזה וקטורים lentiviral יכול מוגבלת רטרוגרדית תחבורה, עשוי לעורר את התגובה של המערכת החיסונית כאשר נעשה שימוש ב- vivo4,20,21. וקטור תחבורה יעיל רטרוגרדית כינה HiRet הופק על ידי קאטו et al. על-ידי שינוי של מעטפת נגיפית עם גליקופרוטאין וירוס הכלבת ליצירת וקטור היברידית המשפרת תחבורה רטרוגרדית22,23.

עקיבה רטרוגרדית מציג וקטור לתוך מרחב סינפטית של נוירון המטרה, ולאפשר לו להיות נלקח על ידי האקסון של תא זה, מועבר לגוף התא. הובלה מוצלחת של HiRet הוכח הסינפסות עצביים לתוך מוחותיהם של קופים ועכברים23,24 ומן לשריר לתוך מוטורי לגלוקוז22. פרוטוקול זה מדגים הזרקה לתוך חוט השדרה המותני, המכוון את מסופי סינפטית של propriospinal interneurons, גזע המוח נוירונים. מערכת העצבים ההיקפית לקבל חיבורים רבים מסלולים שונים בעמוד השדרה, ובכך יכול להיות מנוצל כדי להתמקד אוכלוסיה מגוונת של הנוירונים בחוט השדרה, גזע המוח. נוירונים שכותרתו במחקר זה מייצגים המעגלים innervating מוטור נוירון בריכות הקשורים בתפקוד המוטורי hindlimb. תיוג חזקים נתפסת חוט השדרה, גזע המוח, כולל פרטים דיוק גבוה של דנדריטים ובשבילים, מסופי האקסון. גם השתמשנו בשיטה זו במחקרים קודמים בתוך חוט השדרה הצווארי לתייג propriospinal, גזע המוח reticulospinal מסלולים25.

פרוטוקול זה מדגים הזרקה של וקטור ויראלי לתוך חוט השדרה המותני של חולדה. כפי שניתן לראות סרט 1, החתך מכוון על ידי זיהוי החוליה L1 הממוקמת הצלע האחרונה. זה משמש כנקודת ציון סימטרית עבור חתך 3-4 ס מ זה חושף את מערכת השרירים מעל חוט השדרה L1-L4. Laminectomies ההיבטים הגבי של החוליות T11-T13 מבוצעים ואת מחט זכוכית משופע מכוונת 0.8 מ מ לרוחב קו האמצע, הוריד 1.5 מ מ עמוק לתוך החומר האפור להחדיר וירוס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים הבאים כירורגית וטיפול בבעלי חיים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים ועל שימוש הוועדה של אוניברסיטת טמפל.

1. בפגישת ההכנות

  1. הכינו זכוכית משך מחטים להזרקה נגיפית מספר ימים לפני הניתוח באמצעות 3.5 nanoliter זכוכית נימי פיפטות מיועד nanoliter מרססים. משוך כל פיפטה פולר המחט שני שלבים לפי הוראות היצרן כדי ליצור שתי תבניות המחט.
  2. לחדד את קצה המחט התבניות חותכים כ 1-2 מ מ זכוכית עודף עם microscissors. מדד גודל הצמצם משוער תחת מיקרוסקופ עם מגלשת כיול מיקרוסקופ כדי לבודד מחטים עם 30-40 µm פתחים.
  3. עם המחט ב 30 מעלות, להשתמש beveller micropipette כדי ליצור קצה עם צוהר מיקרומטר 30-40, בזווית של 45° משופע. ודא רוחב מיפתח צמצם עם קנה המידה ורניה על השקופית כיול. עוברים המחט זכוכית באמצעות מזרק עם קובץ מצורף מחט גמישה כדי לשטוף את הלכלוך ולסמן את המחט במרווחי זמן קבועים עם סמן שחור מים ואתנול.
  4. מקם את המחטים בצלחת פטרי מכוסה בעבר לנקות עם 70% אתנול ולחטא למשך 30 דקות בשכונה אבטחה תחת אור UV.
  5. להכין HiRet lentivirus על-ידי הסרת אמצעי אחסון מתאימים מהמקפיא מייד לפני ההליך.
    הערה: אמצעי אחסון מתאימים כולל את הסכום הדרוש עבור הזרקה (µL 1 לכל זריקה x מספר זריקות) וגם כמות קטנה של יותר נפח להביא בחשבון pipetting וטעינה הפסדים. להעביר ולאחסן את הוירוס על הקרח כאשר אינו בשימוש.
  6. הכינו את מזרק על ידי חיבורו אל micropump והצבתו לתוך micromanipulator עם קנה מידה ורניה.
  7. כדי להכין את המחט זכוכית, בזהירות לטעון צבע בצבע כגון שמן אדום עם מזרק לבוש עם מחט גמישה. ודא כי אין בועות יישארו במחט. שימוש בטכניקה אספטית טיפול המחט ולהימנע מלגעת הטיפ.
  8. את המחט זכוכית לתוך מזרק, המבטיח כי המחט מוכנס כהלכה לתוך הדיסקיות, הכיפה מזרק היא מברזל, מחט מזרק פלדה מורחב כ ¾ אורך המחט זכוכית. וירוס ניתן לטעון לתוך המחט בשלב מאוחר יותר.

2. הכנת האתר כירורגי והרדמה

  1. שוקלים את החיה בקנה מידה דיגיטלי. להקליט את המשקל שטרם-נותחו כדי לקבוע את עוצמת הקול של הרדמה הנדרש, כדי לאפשר פיקוח על המשקל לאחר הניתוח. חולדות ספראג-Dawley נקבות כ 200 – 250 גרם שהיו בשימוש בפרוטוקול זה.
  2. עזים ומתנגד העכברוש באמצעות אינהלציה איזופלוריין או פתרון מוזרקים קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים (k / x). . קטמין מוזרק intraperitoneally 67 מ"ג/ק"ג, חריגות השירותים הווטרינריים במינון 6.7 מ"ג/ק"ג.
  3. לאשר מטוס הרדמה המתאים על-ידי התכווצות כף הרגל בחוזקה. אם מתרחשת נסיגה רפלקסיבי, המתן מספר דקות נוספות לפני שתמשיך.
    הערה: להתבונן גם שפם, העיניים וקצב נשימה סימנים של התודעה. אם נכון הן בפקעת, העין מהבהבת כאשר נגע בעדינות, או הנשימה היא מהירה ורדודה, המתן עד המטוס הרדמה הוא עמוק יותר כדי להמשיך הפרוטוקול. גם לפקח על הסימנים לאורך כל הניתוח laminectomy, הזרקת. אם החיה מציג מטוס הרדמה שטחית, לנהל זריקת תגבור של קטמין בלבד שווה את ½ את k המקורי / x המינון.
  4. לגלח את החולדה לאורך הקו האמצעי הגבי מן המותניים זווית נחות השכם. משוך את העור של החיה מתוח על גילוח קל יותר ומדויק יותר.
  5. משחה אופטלמולוגיות חלות על שתי העיניים.
  6. החל חיטוי לאזור מגולח כדי לעקר את האתר. עבור בסבך שיחים הראשון, משרים גזה סטרילית עם 5% יודיפלור תמיסה, נגבי כל שיער ופסולת. ללכת עם לסחוב חד כיווני עם גזה סטרילית טבולים 70% אתנול, כך אין אזור שתתבצע פניה פעמיים. השתמש את אותה טכניקה עם מתחלפים יוד, ספוג אתנול גזה עוד פעמיים.

3. הכנה השדה ואת כלי כירורגי

  1. הכנת סט של כלי ניתוח בלוק הכוללים אזמל, rongeurs, עכברוש השן מלקחיים, מעיין מספריים, ועוצרי דימום, נקודת בינוני מעוקל מלקחיים, רטרקטורים או ווים משוקלל על ידי הסרת העטיפה הגלישה סטרילי כדי ליצור שדה סטרילי.
  2. פתח את חבילת כפפות כירורגי סטרילי ולמקם הגלישה כפפה סטרילית על השולחן. אשתמש במקום שדה סטרילי נוסף לכלים משומשים כדי למנוע זיהום של הגלישה סטרילי.
  3. ירידה להב סכין #10 בשטח סטרילי. אבטח את הפגיון. כדי אחיזה עם ועוצרי דימום. מיקום מלח סטרילית, 4.0 כרום תפר וחומרים כדי לשלוט הדימום כגון cauterizer, גזה סטרילית, סטרילי applicators שקצהו כותנה (בלידים שריר), או השאיבה או bonewax (בלידים העצם) במקום נגיש.
  4. להוציא את בעל החיים ולהגדיר אותו על בד סטרילי. במקום גזה מתחת לשלפוחית השתן לאיסוף השתן. להעלות אזור היעד עם מגבת מגולגלת מתחת בבטן. אם הוא זמין, מקם כרית החימום כירורגי מתחת הבד סטרילי, במיוחד עבור הליכים ארוכים יותר.
    הערה: עקרות חשוב במהלך ניתוח הישרדות. החזק בקבוק ספריי אתנול 70% על היד כדי לשמור על עקרות של ידיים בכפפות, מעקר חרוז שימוש אם מכשיר עקרות נמצא בסיכון, או בין ניתוחים בודדים.

4. חשיפת בעמודה השדרה וזיהוי באתר laminectomy

  1. לזהות את האזור שבו חתך בעור ייעשו על-ידי הקשה על האצבעות בעדינות על הצלע האחרונה כדי לאתר החוליה L1. שימוש זה כנקודת ציון, גורם חתך בעור 3-4 ס מ עם אזמל כירורגי #10 סיום רק נחות L1 לחשוף את השריר. להחזיק העור המתוח במריחה עדינה ולחץ בחוזקה עם הלהב האזמל כדי להבטיח חתך נקי.
  2. לחתוך ולהפיץ שמן שטחית עם מלקחיים ומספריים במידת הצורך. (בהתאם למטרה חוליה, שם או לא להיות כרית השומן גדולה משיטחי להקפיד השריר).
  3. מרגיש עבור התהליכים קוצניים על הדירה של הלהב באזמל או האצבע. לעיתים קרובות אזור קו האמצע יסומנו על-ידי "V" של fascia לבן משני צדדיו. לעשות חתך קטן rostral כדי לאפשר חדר תתפוס בצורה מאובטחת תהליך העליון עם עכברוש השן מלקחיים, ולאחר מכן לבצע קיצוצים ארוכה, עמוקה 2 קרוב התהליכים ככל האפשר. בנקודה העמוקה ביותר של החתך, ניתן לחוש המשטח הגבי של החוליות עם הלהב ומהדקים.
  4. החזק את השרירים לרוחב הצידה עם רטרקטורים או ווים משוקלל כדי לשפר את הראות. שרירים ברורה סביב התהליכים עם האזמל, מעיין מספריים או rongeurs כדי לקבוע את צורת הראש שלהם.
    הערה: זכור כי חוט השדרה לא להאריך את אורך מלא בעמודה השדרה, בתור חוט השדרה רקמות עצירות גוברת מוקדם בהתפתחות מאשר עצם. משמעות הדבר היא כי רמת בעמוד השדרה היעד עשוי להיות מתחת חוליה אחרת בשם.
  5. אתר את T11 ואת התהליכים טי12 ו- T13 הסמוך.
    הערה: סיוע המיקוד הנכון רמות בחוליות ניתן למצוא אטלס חוט השדרה של עכברוש, מחקרים קודמים בהתוויית ציוני דרך בהעכבר, אשר דומה מאוד במבנה בחוליות6,33. השאר תהליך קוצניים rostral כגון T9 ללא הפרעה לתת ציון דרך קו האמצע.

5. ביצוע laminectomy

  1. ברגע אזור המטרה זוהתה בצורה נכונה, לבצע laminectomies של היבטים הגבי של T11-T13. מורחים בעדינות החוליות כדי לחשוף את הרצועות בין-חולייתי, אשר הם אתרים טובים כדי להוסיף rongeurs עבור הנשיכה הראשונית של העצם. החזק את rongeurs בעמדה עצומות למחצה כדי להגדיל את שליטה טובה.
  2. להסיר את התהליכים קוצניים ואת ההיבט הגבי של החוליות על ידי לוקח ביסים קטנים עם rongeurs. יש להיזהר לא לגרום נזק לחוט השדרה או להפריע השכבה הקשה של המוח. הרם מעט עם המלקחיים השן עכברוש לעזור למשוך חוט השדרה מן החוליות, להקטין את הנטייה לפגוע בחוט השדרה רקמות.
  3. לנקות העצם משם מן האמצע כך ניתן לראות את כלי הדם קו האמצע. להשאיר חלון בבירור מציגה את הרקמה חוט השדרה והוא חינם של פסולת.
  4. לגעת בעדינות את חוט השדרה עם מלקחיים. בעלי חיים שעלולים לקפוץ ניגודיים גם אם המטוס הרדמה עמוקה. להחיל מספר טיפות של חומר מאלחש כגון לידוקאין ישירות על חוט השדרה כדי למנוע קפיצות במהלך ההליך הזרקה.
  5. לאבטח בעל החיים בעל עמוד השדרה על ידי והידק מלקחיים ייצוב תהליכים קוצניים rostral, סימטרית אל החלון laminectomy. הרימו את הבטן של החיה באמצעות בעל עמוד השדרה כדי לנטרל את השפעת תנועות נשימה. זה להגביר את היציבות המחט ולהבטיח המתאים עומק ההזרקה.

6. טעינת וירוס והמיקום של מזרק

  1. לטעון וירוס לתוך מזרק pipetting כ 5 µL על חתיכת מצלמות-מיקרוסקופים, מיקום המחט כך הטיפ הוא בתוך הטיפה.
  2. השתמש את micropump כדי למשוך µL עד 4 של וירוס בקצב של 20 – 100 nL/s.
  3. להגדיר את בקר להזריק ולשחרר כמות קטנה של הווירוס המחט כדי להבטיח שקצה המחט אינה חסומה. . תנגב את וירוס עודף עם מגבון מעבדה.
    הערה: מזרק המילטון עם מחט פלדה עשוי לשמש כחלופה פיפטות זכוכית משך.
  4. מקם את micromanipulator כך שגלוי בסולם ורניה ומקם את המחט בקו האמצע של חוט השדרה.
    הערה: האמצע יכול לפעמים להיות ממוקמת על ידי כלי דם גדולים פועל על המשטח הקדמי של חוט השדרה. עם זאת, יכולים להשתנות בחולדות בודדים, קו האמצע מיקוד צריך להיות מאושרות by comparison with תהליכים קוצניים ללא פגע.
  5. לכוון את המחט רוחבית על ידי 0.8 מ מ באמצעות סולם ורניה על micromanipulator.
  6. להנמיך את המחט בחוט השדרה עד הוא הסטה פנימה, אך לא ניקב, השכבה הקשה של המוח. באמצעות תנועה מהירה ומפותלים, לנקב השכבה הקשה של המוח עם המחט עד הוא שוקע לעומק של 1.5 מ מ.

7. הזרקת את וירוס לתוך חוט השדרה

  1. ברגע שהמחט נמצאת במקום, התוכנית מזרק להזרקת בקצב של 400 nL לדקה אשר את הוירוס נכנס חוט השדרה על ידי התבוננות התקדמות החזית לצבוע. צריך להיות. אין נזילה ברור או בולטות של חוט השדרה רקמה. אם נוצרת דליפה, ניתן להקל זה לפעמים על-ידי הפחתת מהירות הזרקת ל nL 200/min.
  2. מרגע סיום ההזרקה, תאפשר את המחט בתוך חוט השדרה למשך 2-5 דקות (בהתאם נפח מוזרק) כדי להקל על דיפוזיה של הנגיף.
  3. לאט לאט למשוך את המחט ולהעביר אל האתר הזרקת הבא. מזריקים µL 1 של וירוס לתוך כל אחד 6 אתרים המרווחות באופן שווה בערך 1 מ מ אחד מהשני לאורכו של הרקמה בעמוד השדרה L1-L4. באותה המחט עשוי לשמש עבור כל זריקה כל עוד הוא ממשיך לתפקד כראוי.

8. פצע הסגר, שלאחר טיפול

  1. הסר את החיה ממחזיק בעמוד השדרה, להוציא רטרקטורים או ווים נעשה שימוש כדי להפיץ את השריר לרוחב. ודא הפצע ברורים של כל פסולת לפני הסגירה.
  2. תפר את השריר באמצעות בתפר לאללה כרום 4.0. לחתוך חוטי תפירה קרוב על מנת להפחית את הסבירות של גירוי בעור הפנים.
  3. להדק את העור סגור באמצעות קליפים 9 מ מ פצע. כדי לאפשר לריפוי אופטימלי, בשורה את הקצוות של העור לפני הידוק.
  4. במקום החיה על הסעת חום המים התחממות משטח וצג עד כשקשה לי לישון.
  5. להזריק 5 – 10 מ ל תמיסת סטרילית subcutaneously לחדש נוזלים, אנטיביוטיקה כגון צפאזולין כדי למנוע זיהום. כאשר החיה אמבולטורי, למקם אותו לכלוב הביתה ומספקים הראשונית משככי כאבים.  לנטר את החולדות לסימן של כאב ומצוקה ולנהוג לפי נוהל שלך IACUC אושרה לטיפול של כאב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הזרקת מוצלחת ותעבורה של וקטור ויראלי צריכה לגרום התמרה חושית של אוכלוסיה חזקה של נוירונים חד-צדדית בחוט השדרה, גרעינים מסויימים גזע המוח. איור 1 מדגים תיוג סטריאוטיפית של נוירונים, אקסונים בחוט השדרה החזי ואת ב רשתית pontine של גזע המוח-הזרקת שלאחר ארבעה שבועות. ביטוי משמעותי GFP נתפסת בנוירונים בתוך החומר האפור של חוט השדרה החזי בצד חולשת על הזריקה (איור 1A, באזור ממוסגר). כמה נוירונים גם הן נצפו בצד contralateral, במיוחד ליד האמצע. בתוך החומר הלבן, ביטו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הנדסה גנטית של נוירונים במוח ובחוט השדרה שימש גולת חושית, מוטוריים, מסלולים אוטונומי באמצעות מעקב פלורסנט, וכן לבחון את פוטנציאל לצמיחה מחודשת של ספינלי עצביים לאחר פציעה27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33. ישיר הזרקה של וקטור ויראלי יביל retrogradely לתוך חוט השדרה ניתן לייעד אוכלוסיות עצביים באמ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו מומן על ידי מענק מן המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות ו קו R01 R01NS103481 ומענקים החולים שריינרים למחקר בילדים SHC 84051 ואת SHC 86000 משרד ההגנה (SC140089).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
#10 להבי אזמלRobozRS-9801-10לשימוש עם אזמל.
מזרקים של 1 מ"לבקטון, דיקינסון ושות309659להזרקת IP להרדמה, זריקות דחף פוטנציאליות להרדמה וזריקות אנטיביוטיקה.
מזרקים של 10 מ"לבקטון, דיקינסון ושות309604להזרקת מי מלח לבעל החיים, לאחר הניתוח.
4.0 תפר כרומי CatgutDemeTECHNN374-16לקשירת שריר מחדש במהלך הסגירה.
48000 Micropipette BevelerWorld Precision Instruments32416משמש לשיפוע קצות צינורות נימי הזכוכית הנמשכים ליצירת מחטי זכוכית פונקציונליות.
5% תמיסת יודPurdue Products L.P.L01020-08לשימוש בעיקור של אתר הניתוח.
70% אתנולN/AN/Aלעיקור מחטי זכוכית שהוכנו לאחרונה, מודלים של בעלי חיים במהלך ההכנה הכירורגית וידי המנתח במהלך הניתוח, כמו גם כל שאר השמירה הקלה על סטריליות.
חומר הרדמה (תמיסת קטמין/קסילזין)Zoetis240048לשמירה על בעל החיים במישור ההכרה הנכון במהלך הניתוח.
אנטיביוטיקה (Cefazolin)West-Ward PharmaceuticalsNPC 0143-9924-90להזרקה תת עורית למניעת זיהום לאחר הניתוח.
מעקר חרוזיםCellPoint5-1450לעיקור חום של מכשירים כירורגיים.
שעוות עצםFine Science Tools19009-00לאיטום עצם במקרה של דימום בעצם.
CauterizerFine Science Tools18010-00לאיטום עורקים או ורידים שנחתכו במהלך הניתוח כדי למנוע אובדן דם מוגזם.
משקל דיגיטליOkausREV.005לשקילת החיה במהלך ההכנה הכירורגית.
חיבור מחט גמישWorld Precision InstrumentsMF34G-5לניקוי מחטי זכוכית והעמסת שמן אדום למחטי זכוכית.
קצף ג'לפייזרH68079לאיטום עצם במקרה של דימום בעצמות.
צינורות נימי זכוכיתWorld Precision Instruments4878למחטי זכוכית משוכות - יש לתכנן עבור מזרקי ננו-ליטר.
קוצץ שיעראוסטר111038-060-000לניקוי אזור הניתוח משיער.
המוסטטיםRobozRS-7231לשימוש כללי בניתוחים.
KimwipesKimtech34155לשימוש כללי בניתוחים.
מלקחיים מעוקלים בנקודה בינוניתRobozRS-5136לשימוש כללי בניתוחים.
מיקרומניפולטור עם סולם VernierKanetecN/Aלמיקוד מדויק במהלך הניתוח.
מספריים מיקרו RobozRS-5621לחיתוך לחישות זכוכית מצינורות נימי זכוכית טריים שנמשכו.
מיקרוסקופ עם אור וסולם ורניר OcularLeitz WetzlarN/Aמשמש להדמיה ומדידה של שיפוע של צינורות נימי זכוכית משוכים לתוך מחטי זכוכית פונקציונליות.
בקר משאבת MicroSyringeWorld Precision Instruments62403לשליטה בקצב ההזרקה.
Nanoliter 2000 מזרק ראש משאבהWorld Precision Instruments500150לטעינה והזרקת וירוס בצורה מבוקרת.
חולץ מחטיםNarishigePC-100לחימום ופירוק צינורות נימי זכוכית ליצירת מחטי זכוכית.
משחת עינייםDechra מוצרים וטרינרייםRAC 0119להגנה על עיני החיה במהלך הניתוח.
ParafilmBemisPM-996כדי לסייע בהעמסת הנגיף לתוך הננו-מזרק.
מחטי PrecisionGlide (25G x 5/8)Becton, Dickinson and Company305122לשימוש עם מזרקי 1 מ"ל ו-10 מ"ל כדי לאפשר הזרקה של דגם החיה.
מלקחיים לשן חולדהRobozRS-5152לאחיזה בתהליכים קוצניים.
שמן אדוםN/AN/Aלספק חזית להדמיה של הנגיף הנכנס לרקמה במהלך ההזרקה.
מחזיריםRobozRS-6510כדי להחזיק את פצע הניתוח פתוח.
טבליות רימדילBio ServMP275-050לטיפול בכאב לאחר הניתוח.
RongeursRobozRS-8300להסרת שריר מעמוד השדרה במהלך הניתוח.
ידית להב אזמלRobozRS-9843לפרוס עור פתוח וכרית שומן של דגם בעלי חיים במהלך הניתוח.
מספרייםRobozRS-5980לשימוש כללי בניתוחים.
קליפס פצע גניבת אל חלדCellPoint201-1000כדי לקשור את עור הפצע הניתוחי במהלך הסגירה.
מלקחיים להסרת סיכותקנט סיינטיפיקINS750347כדי להסיר את הסיכות, אם יש ליישם אותם בצורה לא נכונה.
בד סטריליPhoenix Research ProductsBP-989כדי לספק משטח סטרילי לניתוח.
אפליקטורים סטריליים עם קצה כותנהPuritan806-WCלספיגת דם בפצע הניתוחי תוך שמירה על סטריליות.
גזה סטריליתCovidien2146לניקוי אזור הניתוח וכלי הניתוח תוך שמירה על סטריליות.
תאגיד הבריאות בקסטרסטרילי281324לשימוש בניקוי דם ולהחלפת נוזלים לאחר ניתוח.
כפפות כירורגיותN/AN/Aלשימוש על ידי המנתח לשמירה על שדה סטרילי במהלך הניתוח.
כרית חימום כירורגיתN/AN/Aלשמירה על טמפרטורת הגוף של דגם החיה במהלך הניתוח.
מיקרוסקופ כירורגיN/AN/Aלהדמיה משופרת של הפצע הניתוחי.
מהדק כירורגיקנט סיינטיפיקINS750546למרוח את הסיכות.
משאבת מים לטיפול בחום T / PumpGaymarTP500Cכדי לשאוב מים חמים לתוך כרית חימום הסעת המים.
כרית חימום הסעת מיםBaxter Healthcare CorporationL1K018לשימוש באזור ההתאוששות לאחר הניתוח לשמירה על טמפרטורת הגוף של החיה חסרת ההכרה.
ווים משוקלליםN/AN/A כדילהחזיק את פצע הניתוח פתוח.
' '

מקורות

  1. Wang, X., et al. Deconstruction of corticospinal circuits for goal-directed motor skills. Cell. 171 (2), 440-455 (2017).
  2. Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).
  3. Brichta, A. M., Grant, G. Cytoarchitectural organization of the spinal cord. The rat nervous system. Vol. 2, hindbrain and spinal cord. , Academic Press. (1985).
  4. Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. Projections from the brain to the spinal cord in the mouse. Brain Structure & Function. 215 (3-4), 159-186 (2011).
  5. Rexed, B. The cytoarchitectonic organization of the spinal cord in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 96 (3), 414-495 (1952).
  6. Schmued, L. C., Fallon, J. H. Fluoro-gold: A new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).
  7. Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
  8. Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G., Heise, C. Atlas of the rat spinal cord. The spinal cord. , 238-306 (2009).
  9. Brandt, H. M., Apkarian, A. V. Biotin-dextran: A sensitive anterograde tracer for neuroanatomic studies in rat and monkey. Journal of Neuroscience Methods. 45 (1-2), 35-40 (1992).
  10. Geed, S., van Kan, P. L. E. Grasp-based functional coupling between reach- and grasp-related components of forelimb muscle activity. Journal of Motor Behavior. 49 (3), 312-328 (2017).
  11. Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y., Del Mar, N., Honig, M. G. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 23-37 (2000).
  12. Steward, O., Zheng, B., Banos, K., Yee, K. M., et al. Response to: Kim et al., "axon regeneration in young adult mice lacking nogo-A/B." neuron 38, 187-199. Neuron. 54 (2), 191-195 (2007).
  13. Brown, B. D., et al. A microRNA-regulated lentiviral vector mediates stable correction of hemophilia B mice. Blood. 110 (13), 4144-4152 (2007).
  14. Lo Bianco, C., et al. Lentiviral vector delivery of parkin prevents dopaminergic degeneration in an alpha-synuclein rat model of parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (50), 17510-17515 (2004).
  15. Malik, P., Arumugam, P. I., Yee, J. K., Puthenveetil, G. Successful correction of the human cooley's anemia beta-thalassemia major phenotype using a lentiviral vector flanked by the chicken hypersensitive site 4 chromatin insulator. Annals of the New York Academy of Sciences. 1054, 238-249 (2005).
  16. Pawliuk, R., et al. Correction of sickle cell disease in transgenic mouse models by gene therapy. Science. 294 (5550), 2368-2371 (2001).
  17. Wang, G., et al. Feline immunodeficiency virus vectors persistently transduce nondividing airway epithelia and correct the cystic fibrosis defect. The Journal of Clinical Investigation. 104 (11), R55-R62 (1999).
  18. Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. The red nucleus and the rubrospinal projection in the mouse. Brain Structure & Function. 217 (2), 221-232 (2012).
  19. Abdellatif, A. A., et al. delivery to the spinal cord: comparison between lentiviral, adenoviral, and retroviral vector delivery systems. Journal of Neuroscience Research. 84 (3), 553-567 (2010).
  20. DePolo, N. J., et al. VSV-G pseudotyped lentiviral vector particles produced in human cells are inactivated by human serum. Molecular Therapy. 2 (3), 218-222 (2000).
  21. Higashikawa, F., Chang, L. Kinetic analyses of stability of simple and complex retroviral vectors. Virology. 280 (1), 124-131 (2001).
  22. Hirano, M., Kato, S., Kobayashi, K., Okada, T., Yaginuma, H., Kobayashi, K. Highly efficient retrograde gene transfer into motor neurons by a lentiviral vector pseudotyped with fusion glycoprotein. PLoS One. 8 (9), e75896(2013).
  23. Kato, S., et al. A lentiviral strategy for highly efficient retrograde gene transfer by pseudotyping with fusion envelope glycoprotein. Human Gene Therapy. 22 (2), 197-206 (2011).
  24. Kato, S., et al. Selective neural pathway targeting reveals key roles of thalamostriatal projection in the control of visual discrimination. The Journal of Neuroscience. 31 (47), 17169-17179 (2011).
  25. Sheikh, I. S., Keefe, K. M., et al. Retrogradely transportable lentivirus tracers for mapping spinal cord locomotor circuits. Frontiers in Neural Circuits. 12, 60(2018).
  26. Harrison, M., et al. Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse. NeuroImage. 68, 22-29 (2013).
  27. Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord. The Journal of Neuroscience. 27 (22), 6068-6078 (2007).
  28. Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia. The Journal of Neuroscience. 26 (11), 2923-2932 (2006).
  29. Liu, Y., Keefe, K., Tang, X., Lin, S., Smith, G. M. Use of self-complementary adeno-associated virus serotype 2 as a tracer for labeling axons: Implications for axon regeneration. PLoS One. 9 (2), e87447(2014).
  30. Chamberlin, N. L., Du, B., de Lacalle, S., Saper, C. B. Recombinant adeno-associated virus vector: Use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS. Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).
  31. Filli, L., et al. Bridging the gap: A reticulo-propriospinal detour bypassing an incomplete spinal cord injury. The Journal of Neuroscience. 34 (40), 13399-13410 (2014).
  32. Williams, R. R., Pearse, D. D., Tresco, P. A., Bunge, M. B. The assessment of adeno-associated vectors as potential intrinsic treatments for brainstem axon regeneration. The Journal of Gene Medicine. 14 (1), 20-34 (2012).
  33. Smith, G. M., Onifer, S. M. Construction of pathways to promote axon growth within the adult central nervous system. Brain Research Bulletin. 84 (4-5), 300-305 (2011).
  34. Morcuende, S., Delgado-Garcia, J. M., Ugolini, G. Neuronal premotor networks involved in eyelid responses: Retrograde transneuronal tracing with rabies virus from the orbicularis oculi muscle in the rat. The Journal of Neuroscience. 22 (20), 8808-8818 (2002).
  35. Ugolini, G. Specificity of rabies virus as a transneuronal tracer of motor networks: Transfer from hypoglossal motoneurons to connected second-order and higher order central nervous system cell groups. The Journal of Comparative Neurology. 356 (3), 457-480 (1995).
  36. Gelderd, J. B., Chopin, S. F. The vertebral level of origin of spinal nerves in the rat. The Anatomical Record. 188 (1), 45-47 (1977).
  37. Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. 73, e50313(2013).
  38. Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. Journal of Visualized Experiments. 53, e2834(2011).
  39. Snyder, B. R., et al. Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery. Human Gene Therapy. 22 (9), 1129-1135 (2011).
  40. Cronin, J., Zhang, X. Y., Reiser, J. Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping. Current Gene Therapy. 5 (4), 387-398 (2005).
  41. Reed, W. R., Shum-Siu, A., Onifer, S. M., Magnuson, D. S. Inter-enlargement pathways in the ventrolateral funiculus of the adult rat spinal cord. Neuroscience. 142 (4), 1195-1207 (2006).
  42. Mao, X., Schwend, T., Conrad, G. W. Expression and localization of neural cell adhesion molecule and polysialic acid during chick corneal development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (3), 1234-1243 (2012).
  43. Charles, P., et al. Negative regulation of central nervous system myelination by polysialylated-neural cell adhesion molecule. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (13), 7585-7590 (2000).
  44. Tervo, D. G., et al. A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
  45. Tohyama, T., et al. Contribution of propriospinal neurons to recovery of hand dexterity after corticospinal tract lesions in monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (3), 604-609 (2017).
  46. Liu, Y., et al. A sensitized IGF1 treatment restores corticospinal axon-dependent functions. Neuron. 95 (4), 817-833 (2017).
  47. Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

GFP
הזרקה ישירה של וקטור Lentiviral מדגיש מספר מסלולים מוטוריים בחוט השדרה עכברוש
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.