הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

אינדוקציה של הפטיטיס אוטואימונית הנגרמת על ידי תרופות בעכברי BALB/c לחקר המנגנונים הפתוגניים שלה

2.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59174

⸱

29 במאי 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology and Critical Care Medicine, Johns Hopkins University, 2Department of Pediatrics and Pathology, Johns Hopkins University

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים מודל הפטיטיס חיסון in vivo בעכברי BALB/c שניתן להשתמש בו כדי לחקור את הפתוגנזה של הפטיטיס אוטואימונית הנגרמת על ידי תרופות, כולל הבדלי מין שנראו במחלה זו. נתאר כיצד מודל זה מדגים ניתוחים הניתנים לשחזור באמצעות טכניקות ניסיוניות in vivo ו- in vitro.

תקציר

הפטיטיס אוטואימונית הנגרמת על ידי תרופות (DIH) היא תהליך הרגישות היתר הנפוץ ביותר המושרה על ידי תרופות נגד הכבד שנצפה בכ-9 עד 12% מהחולים עם הפטיטיס אוטואימונית. הרוב המכריע של החולים עם DIH הן נשים. המנגנונים הבסיסיים של הבדלי מין אלה בשכיחות אינם ברורים בגלל מיעוט המודלים של בעלי חיים המחקים מחלות אנושיות. עם זאת, מנגנונים בסיסיים נחשבים בעיני רבים כקשורים להפלוטיפים של אנטיגן לויקוציטים אנושי ולהורמוני מין. לעומת זאת, באמצעות מודל של עכבר DIH, גילינו כי IL-4 יזם תאי CD4+ T המכוונים נגד אפיטופ של ציטוכרום P450 2E1 גורם לזרימה של נויטרופילים, מקרופאגים ותאי פיטום לתוך הכבדים של נקבות עכברי BALB/c. באמצעות מודל זה, הראינו גם שתאי T רגולטוריים של FoxP3+המושרים על ידי IL-33 מעניקים הגנה מפני DIH בעכברים נקביים וזכריים. מודל DIH זה מושרה על ידי חיסון עכברים עם אפיטופ של CYP2E1 אשר השתנה באופן קוולנטי עם מטבוליט של תרופה שנקשרה ל- DIH. אפיטופ זה מוכר על ידי חולים עם DIH. השיטה שלנו גורמת להפטיטיס חזקה וניתנה לשחזור ולנוגדנים עצמיים שניתן להשתמש בהם כדי לחקור את הפתוגנזה של DIH. בעוד שמחקרי in vivo יכולים לגרום לכאב ומצוקה מיותרים בעכברים כאשר הם נעשים בצורה לא נכונה, היתרון של מודל in vivo הוא היכולת להעריך את הפתוגנזה של המחלה במספר רב של עכברים. בנוסף, ניתן לחקור את ההשפעות הביולוגיות של חלבוני הכבד שהשתנו באמצעות הליכים פולשניים. הוספת מחקרי מבחנה לתכנון הניסויי מאפשרת חזרה מהירה וניתוח מכניסטי ברמה התאית. לפיכך, נדגים את פרוטוקול המודל שלנו וכיצד ניתן להשתמש בו כדי לחקור מנגנוני in vivo ו- in vitro של DIH.

מבוא

מטרת שיטה זו היא לתאר מודל עכברי של הפטיטיס אוטואימונית הנגרמת על ידי תרופות המתפתחת in vivo ולהדגים כיצד ניתן להשתמש בה כדי לחקור את הבסיס המולקולרי, האימונולוגי והגנטי של מחלה זו. המטרה ארוכת הטווח של המחקרים שלנו היא לחשוף מנגנונים האחראים להתפתחות דלקת כרונית בכבד ופציעה על ידי מחקר DIH בחולים רגישים. מחלת כבד ושחמת הכבד מהוות את סיבת המוות השישית בשכיחותה בקרב מבוגרים בין הגילאים 25 ל -64. DILI אידיוסינקרטי, המכונה לעתים הפטיטיס אוטואימונית הנגרמת על ידי תרופות (DIH) הוא הגורם השלישי בשכיחותו לאי ספיקת כבד חריפה בארצות הברית. DIH הוא תהליך הרגישות היתר הנפוץ ביותר המושרה על ידי תרופות בכבד שנצפה בכ-9 עד 12% מהחולים עם הפטיטיס אוטואימונית1. הרוב המכריע של החולים עם DIH הן נשיםבנות 2,3,4. סוג של DIH מתפתח אצל אנשים רגישים לאחר מתן של הרדמה נדיפה הלוגנית כגון איזופלורן, sevoflurane, desflurane או halothane. הרדמה זו נקשרת באופן קוולנטי לחלבוני כבד עם מוצרים תגובתיים של חילוף החומרים שלהם, ובכך יוצרת נוגדנים עצמיים חדשניים המסוגלים לעורר תגובות אלרגיות או אוטואימוניות5.

המחקר של מנגנונים פתוגניים המעורבים בהתפתחות של הרדמה וכל צורה של DIH הופרע בעבר על ידי היעדר מודל חייתי המחקה באופן הדוק את האינדוקציה של מחלות אנושיות. פיתחנו מודל מורין ניסיוני של DIH עם תכונות הדומות ל-DILI בתיווך מערכת החיסון בחולים. הפטיטיס מושרית על ידי חיסון עם אחד משני נוגדנים עצמיים ששונו באופן קוולנטי על ידי מטבוליט טריפלואורואצטיל כלוריד (TFA) שנוצר בעקבות חילוף חומרים חמצוני של ההרדמה על ידי האנזים ציטוכרום P450 2E1 (CYP2E1)5. אוטונטיגן אחד הוא שבר הכבד הציטוזולי S100 בכבד, שהוא תערובת של מספר חלבונים6, והאנטיגן האוטו-אנטיגן השני הוא אפיטופ של CYP2E1 המוכר על ידי סרה מחולים עם DILI7 המתווך על ידי מערכת החיסון. על ידי שימוש בעכברי BALB/c, שהם עמידים יחסית להפטיטיס אוטואימונית ניסיונית, אנו מבחינים את המודל שלנו ממודל החיסון המושרה על ידי S100 של הפטיטיס אוטואימונית בעכברי C57Bl/6J8.

בגלל המצגות הקליניות המגוונות שלו, DIH קשה למחקר בחולים. מודלים ניסיוניים תרגומיים מציעים את היכולת להעריך את הפתוגנזה של מחלות in vivo ו- in vitro. נכון לעכשיו, אין שיטות חלופיות אחרות לגרימת DIH הבוחנות באופן מלא תגובות חיסוניות in vivo או in vitro מסתגלות או מולדות ללא שימוש בבעלי חיים. יתר על כן, מכיוון שנראה כי טריפלואורואצטילציה של S-100 או אפיטופ CYP2E1 אינה מייצרת אימונוגן מגרה, ואנו גורמים ל- DIH על ידי חיסון עם חלבונים ששונו על ידי TFA, בעלי חיים אלה לא יקבלו אתר, כל הרדמה הלוגנית, ברביטורט או אלכוהול לפני חיסון או הליכים אחרים, בהתחשב בכך שסוכנים אלה עשויים לשנות את הפרמטרים שאנו חוקרים. אף על פי כן, צמצמנו את השימוש בעכבר שלנו על ידי שימוש בהדמיית מחשב כדי לאשר את העדפות הקשירה של האפיטופ CYP2E1 שהתגלה עלידי כך ששיקפו את ה-DIH האנושי המעורב במין הנשי על ידי הוכחה שנקבות עכברי BALB/c מפתחות DIH10 חמור יותר.

למרות מצגות מגוונות של DIH בחולים ואתגרים בחקר מחלות קליניות, שינוי לאחר התרגום של חלבונים מקומיים על ידי מטבוליטים של תרופות תגובתיות הוא מנגנון מפתח מקובל בפתוגנזה DIH העוקב אחר הרדמה הלוגנית11. החוקרים גם מקבלים את העובדה ש-CYP2E1 הוא נוגדן עצמי מרכזי בתהליך זה12,13. תפקידם של תאי CD4+T מווסתים (IL)-4-upregulated המזהים CYP2E1 שעבר שינוי לאחר תרגום וחלבוני כבד אחרים הוא יוזם מקובל של DIH בהרדמה על ידי משיכת נויטרופילים, אאוזינופילים ותאי תורן לתוך הכבד14, ומנגנון זה אושר בצורות רבות של DIH15,16. תאי CD4+CD25+T המושרים על ידי FoxP3 המבטאים את ה-FoxP3 מפחיתים את חומרת ה-DIH, וחסרים יחסיים של תאים אלה בטחול מחמירים את ה-DIH 10,7. לפיכך, רוב ההתקדמות בהבנת DIH התאפשרה על ידי שימוש במודלים של עכברים in vivo כדי להעריך את המנגנונים הגנטיים, המטבוליים והאימונולוגיים של DIH הן in vivo והן in vitro.

מכיוון שאנו וחוקרים אחרים גילינו תפקידים עבור IL-4, נויטרופילים ואאוזינופילים בייזום של DIH באמצעות מודלים שונים של עכברים, אנו מאמינים כי תצפית זו תומכת בטענתנו כי ללא קשר למודל ה-DIH שבו נעשה שימוש, הפטיטיס ופציעה נגרמות על ידי IL-4. כוחו של הפרוטוקול שלנו טמון בשימוש במתודולוגיית in vivo, הן עכברים זכרים והן נקבות, וחזרה על היסטולוגיה, מבחני התפשטות תאי T CD4+ T וציטוקינים. החוזק של השימוש שלנו במחקרים חוץ גופיים הוא שהם מפחיתים את מספר העכברים הדרושים תוך מתן המתודולוגיה לבידוד אינטראקציות תאיות המניעות DIH. אנו ממליצים על שימוש בעכברים זכרים ונקבות מכיוון שהדבר מקטין את האפשרות להטיה לא מודעת בפרשנות התוצאות ומחזק את פוטנציאל התרגום של המחקרים שלנו מכיוון שהשכיחות, השכיחות והחומרה של DIH גבוהות יותר אצל נשיםבנות 17. אנו ממליצים לקבל עכברים ממוכר יחיד; עם זאת, אם הדבר אינו אפשרי, השג פקדים על בני זוג פסולת או עכברים מסוג בר מאותו ספק כמו העכברים שהשתנו גנטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הנהלים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים ולשימוש בהם.

1. טריפלואורואצטילציה של חלבונים ציטוזוליים כבדיים מסוג S-100 או אפיטופ CYP2E1

הערה: ראשית, הכן את ה- S100 המשולש (TFA-S100) ואת האפיטופ המשולש של CYP2E1 (TFA-JHDN5). מכיוון שחלבוני S100 סינגניים נחוצים לחיסונים, ועכברי BALB/c נדרשים לייצר את האימונוגן. ההכנה מניבה כמות גדולה של אימונוגן; לכן, צפו לבצע את החלק הזה בערך ארבע פעמים בשנה. שיטה זהה תשמש ליצירת TFA-JHDN5. האפיטופ CYP2E1 (JHDN5), GII / FNN / GPT / WKD / IRR / FSL / TTL, ניתן לרצף או לרכוש.

  1. בידוד של שבר S100 של הכבד.
    1. לאחר הרגעה של 5 - 10 עכברי BALB / c עם 40-60 מ"ג / ק"ג קטמין מעורבב עם 4 - 6 מ"ג / ק"ג קסילאזין, לאשר עומק תקין של הרדמה על ידי התבוננות בירידה בטונוס השרירים וללא תגובה לגירויים כואבים, כגון צביטה בבוהן (רפלקס גמילה), בנוסף לאובדן רפלקסים ימניים ואובדן רפלקסים פלפלבריים.
    2. באמצעות מספריים מיקרוכירורגיים, חושפים את התוכן התוך-בטני באמצעות חתך בקו האמצע ועושים חתך קטן בווריד הנבוב התחתון קאווה כדי להסיר את הדם.
    3. מניחים אנגיוקתטר בעל 24 מדים לתוך וריד הפורטל ומכניסים את הכבד 10 מ"ל לדקה עם 40 מ"ל של 40 מ"ל של תמיסת מלח מחוצץ פוספט (PBS) pH 7.4 באמבט מים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. מוציאים ושוקלים את הכבדים המאוגדים וחותכים אותו לחתיכות קטנות (10 – 15 מ"מ).
      הערה: המתת חסד מושרית על ידי הזרקה תוך-צפקית של קטמין/קסילאזין נוספים (80 מ"ג/ק"ג: 8 מ"ג/ק"ג), ולאחר מכן פריקה של צוואר הרחם ופתיחת חלל החזה כדי למוטט את הריאות. שיטה זו מספקת את הכאב ואי הנוחות הפחותים ביותר לבעלי החיים. שיטה זו עולה בקנה אחד עם המלצות הפאנל להמתת חסד של האגודה האמריקאית לרפואה וטרינרית.
    4. הוסף פי 4 ממשקלו של סוכרוז (250 מ"מ) -TRIS (10 מ"מ) - EDTA (1 mM) מאגר הומוגניזציה (pH 7.4) בתוספת טבליות קוקטייל מעכבי פרוטאז מלאות (ראה טבלת חומרים) לפי המלצות היצרנים. הומוגניזציה בצינור פוליפרופילן 15 מ"ל, באמצעות הומוגנייזר רקמות מעבדה כללי על מהירות בינונית על קרח עד לקבלת חלק. הומוגניזציה על קרח כדי למנוע מהרקמה להתחמם במהלך הומוגניזציה.
    5. צנטריפוגה הכבד הומוגנטית ב 1500 x g במשך 10 דקות ולאחר מכן לשפוך את supernatant. צנטריפוגה את הסופרנטנט במשך שעה אחת ב 100,000 x g. הצמד להקפיא את supernatant ולאחסן ב -80 °C (80 °F). הסופרנטנט הוא S-100 ציטוזולי.
  2. טריפלואורואצטילציה של S100 ו-JHDN5
    הערה: Trifluoroacetylation של קבוצות אמינו ε של שאריות ליזין של S-100 יבוצע על פי ההליך של סאטו18. כל חלקי הניסוי הזה, למעט הימים האחרונים של הדיאליזה, מבוצעים במכסה האדים.
    1. קבע את ריכוז החלבון הכולל של ה-S-100 הציטוזולי באמצעות בדיקת החומצה הביצינכונינית (BCA assay)7. דילול 20 מ"ג של עכבר BALB/c S100 או JHDN5 עד 10 מ"ל עם dH2O בבקבוקון ארלנמאייר 50 מ"ל. התאם את ה- pH ל- 10 עם 1N KOH.
    2. הוסף 4.7 mmole של S-ethyltrifluorothioacetate (S-ETFA), לתמיסה. שמור על ה- pH בין 9.9 – 10.0 עם 1N KOH על ידי מתן KOH בסגנון טיפות במשך כשעה אחת. רשום את הנפח הכולל של KOH עבור כל תגובה.
    3. העבירו את הפתרונות לקלטות דיאליזה נפרדות (אין למלא יתר על המידה). דיאליזה את הקלטות במשך 72 שעות מול 4 ליטר של dH2O עם שלושה שינויים ביום. לאחר דיאליזה, הקלט את הכרך הסופי של TFA-S100 או TFA-JHDN5 ולאחר מכן הוצמד לצינורות מסומנים. הצמד להקפיא ולאחסן ב -80 °C (80 °F).
    4. ריכוז משוער נקבע על ידי חלוקת הכמות הראשונית של S100 או JHDN5 (במ"ג) בנפח הסופי שלאחר דיאליזה (mL). כדי לקבוע את אחוז השינוי של החלבון הטבעי19, יש לדלל 1.0 מ"ג מכל חלבון מקומי וחלבון שעבר שינוי TFA (אם הריכוז הסופי גדול מ-1.0 מ"ג) ל-1.0 מ"ל עם dH2O בצינורות קליע נפרדים ולהכין ריק באמצעות 1.0 מ"ל dH2O. אם ריכוז החלבון ששונה מ-TFA הוא פחות מ-1.0 מ"ג, אין לדלל
      1. כדי להפריד בארות של צלחת באר של 96, הוסיפו 50 μL של החלבונים הריקים, המקוריים והמשתנים. הוסף 50 μL של 4% NaHCO3 ואחריו 50 μL של 0.1% 2,4,6-trinitrobenzene חומצה סולפונית לכל באר.
      2. הדגירה של הצלחת בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר הדגירה, יש להוסיף 50 μL של 10% SDS לכל באר ולאחר מכן 25 μL של 1N HCl.
      3. קרא ב- OD של 334 ננומטר ולאחר מכן רשום ספיגה של כל תרכובת מ- 200 - 600 ננומטר על מנת לאשר את הירידה האופיינית בספיגה ב- 334 ננומטר. חישוב השינוי באחוזים של שאריות ליזין על ידי TFA, באמצעות הנוסחה הבאה:
        figure-protocol-1

2. חיסון עכברים כדי לגרום להפטיטיס

הערה: DIH מעוצב בעכברי BALB/c על ידי חיסונים עם חלבונים ציטוזוליים בכבד ששונו באופן קוולנטי על ידי טריפלואוראצטיל כלוריד (TFA), מטבוליט תרופה לדוגמה, TFA-S1006 או אפיטופ של CYP2E1 ששונה באופן קוולנטי על ידי TFA9, TFA-JHDN5 הגורם להפטיטיס, תאי T אוטו-רייאקטיביים ו-CYP2E1 נוגדנים עצמיים. עכברים מפגינים שלב הפעלה של הטחול שבועיים לאחר החיסון הראשוני ושלב כבד ב-3 שבועות המאופיין בדלקת גרנולוציטית. נקבות עכברי BALB/c רגישות יותר מאשר זכרים להפטיטיס במודל זה.

  1. ביום 0, חיסנו עכברי BALB/c בני 6-8 שבועות באופן תת עורי בבסיס הצוואר עם 200 מיקרוגרם של TFA-S100 או 100 מיקרוגרם של TFA-JHDN5 בתחליב בכמויות שוות של אדג'ובנט שלם של פרוינד (CFA). ביום 0, לחסן את העכברים עם 50 ng של רעלן שעלת, תוך שרירי באחת הרגליים האחוריות. ביום 7, לחסן את העכברים באופן תת עורי בבסיס הזנב עם 200 מיקרוגרם של TFA-S100 או 100 מיקרוגרם של TFA-JHDN5 בתחליב בכמויות שוות של CFA כדי להבטיח שכל עכבר יקבל שתי זריקות של אותו אימונוגן.
    הערה: העכברים מנוטרים מדי שעה במשך 6 השעות הראשונות לאחר החיסון ולאחר מכן לפחות פעמיים ביום במשך שבוע. אם העכברים מפגינים סימני כאב או מצוקה, כגון תנוחה מחוספסת או פרווה פרועה, יש לתת משככי כאבים בהתאם ל-ACUC המקומי. אם צוין כאב או מצוקה משמעותיים, העכברים צריכים להיות מוערכים על ידי וטרינר כדי לקבוע אם המתת חסד נחוצה.
  2. קביעת תגובות חיסוניות של תאי T מסוג CD4+ לחלבונים עצמיים שלמים, אפיטופים של חלבונים עצמיים או הפטן TFA באמצעות ציטומטריה של זרימה
    1. לאחר הרגעה של עכברים עם 40-60 מ"ג/ק"ג קטמין מעורבב עם 4-6 מ"ג/ק"ג קסילאזין באמצעות הזרקה תוך-צפקית, אשרו את עומק ההרדמה הנכון כמתואר בשלב 1.1.1 ולאחר מכן זהו את הטחול לאחר חשיפת החלל התוך-בטני באמצעות מספריים מיקרו-כירורגיים. חותכים את הטחול בפדיקל ומניחים בצלחת פטרי עם סרום PBS/2% עגל עוברי (FCS).
      הערה: המתת חסד תושרה בעכברים על ידי הזרקה תוך-צפקית של קטמין/קסילאזין נוסף (80 מ"ג/ק"ג: 8 מ"ג/ק"ג), ולאחר מכן פריקה של צוואר הרחם ופתיחת חלל החזה כדי למוטט את הריאות. שיטה זו מספקת את הכאב ואי הנוחות הפחותים ביותר לבעלי החיים. שיטה זו עולה בקנה אחד עם המלצות הפאנל להמתת חסד של האגודה האמריקאית לרפואה וטרינרית.
    2. שחררו את התאים באמצעות מגלשות זכוכית חלביות והעבירו לצינור פוליפרופילן חרוטי בגודל 50 מ"ל. שטפו עם PBS/2% FCS על ידי הבאת נפח של עד 50 מ"ל וצנטריפוגה ב-335 x גרם באמצעות צנטריפוגה מקוררת עם ספסל. שפכו את הסופרנטנט וחזור על שלב זה.
    3. הסר תאים אדומים באמצעות 1 מ"ל של מאגר ACK Lysing למשך דקה אחת והביא נפח של עד 50 מ"ל עם PBS/2% FCS. צנטריפוגה ב 335 x g ולשפוך את supernatant.
    4. ספרו את התאים. סמן את התאים ב- CFSE למשך 30 דקות על קרח בחושך, בהתאם להוראות היצרן. השהו את מתלי התא הבודד לתוך 6 לוחות באר של 3x106 תאים/מ"ל לבאר ב-PBS/2% FCS.
    5. לגרות תאים מסומנים עם CYP2E1, JHDN5 או TFA-OVA (10 מיקרוגרם/מ"ל) למשך 72 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2, 95% אוויר (לחות). לאחר הדגירה, הכתימו את התאים ב-CD4-APC (1:100) למשך 30 דקות על קרח ונתחו לפי ציטומטריית זרימה תוך 3 ימים.
    6. השתמש באסטרטגיית ה-gating הבאה כדי לזהות תאי CD4+CFSE+: תאי CD4+CFSE+ יזוהו מהתאים החיים המגודרים ויוצגו כהיסטוגרמות של תאים מתרבים.
  3. בידוד של חדירה של תאי מערכת החיסון מעכברים מחוסנים.
    1. כדי לבודד תאי חיסון חודרים בכבד ביום ה-14 או היום ה-21, יש להרדים את העכברים על ידי הזרקה תוך-צפקית עם 40-60 מ"ג/ק"ג קטמין מעורבב עם 4-6 מ"ג/ק"ג קסילאזין ולאשר את עומק ההרדמה הנכון כמתואר בשלב 1.1.1. לאחר לפרוטומיה באמצעות חתך בקו האמצע שנעשה עם מספריים מיקרו-כירורגיים כמתואר ב-1.1.2, ניתן להשתמש בווריד הפורטל עם מחט של 25 מדים ולאחר מכן לחתוך את הווריד הנבוב התחתון מתחת לוורידי הכליה.
    2. מנקבים כל כבד בקצב זרימה של 10 מ"ל לדקה עם 40 מ"ל של PBS באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. לאחר זלוף, באמצעות מספריים מיקרו כירורגיים, לחתוך את הכבד על pedicle הכבד, להסיר את כיס המרה ולאחר מכן לחתוך את הכבד על hilum.
    3. לשבש את הכבד על מסננת נירוסטה רשת באמצעות מזיק מזרק סטרילי 20 מ"ל ו PBS קר. סנן את תרחיף התא שנוצר לצינורות צנטריפוגה מעוקרים מראש של 50 מ"ל באמצעות מסך רשת של 300 מ"ל. הביאו כל מתלה ל-50 מ"ל באמצעות PBS קר ולאחר מכן שטפו את המתלים בצנטריפוגה למשך 10 דקות ב-370 x גרם.
    4. יש להשליך את הסופרנטנט ולאחר מכן לאגד כל כדור על ידי טיפול בצינורות חדשים של 50 מ"ל (מומלץ צינור אחד לכל עכבר; עם זאת, אם דגימות מרוכזות, מומלץ 2-4 כדורים/צינור). תלו את הכדורים המאוגדים ב-45 מ"ל פרקול ב-35% (ב-PBS), וב-100 יחב"ל/מ"ל הפרין.
    5. סובב כל צינור ב 500 x g במשך 10 דקות ב 20 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט והשעו את הכדור ב-5 מ"ל של PBS ולאחר מכן הוסיפו 1 מ"ל של חיץ ACK לכל כדור למשך 10 דקות על קרח.
    6. הביאו כל צינור ל-50 מ"ל עם PBS ושטפו בצנטריפוגה למשך 10 דקות ב-370 x גרם. השליכו את ה-supernatant ולאחר מכן שטפו את התאים עם PBS/2% FCS על ידי צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-370 x גרם. ספרו את התאים.
    7. ניתוח סוג התא באמצעות ציטומטריית זרימה
      הערה: הנה דוגמה לאופן שבו ניתן לזהות Foxp3+Tregs מושרים.
      1. דגירה של 1x106 תאים עם FcR חוסם ריאגנט וכתם עם דילולים של 1:100 של CD4-FITC, CD25-PE ו- CD45-PerCP למשך 30 דקות על קרח. לאחר מכן, הכתימו את התאים באופן תוך-תאי באמצעות FoxP3-APC.
      2. תקן את התאים עם 250 μL של מאגר קיבוע (ראה טבלת חומרים), ואחסן ב- 4 °C עד לניתוח על ידי ציטומטריית זרימה תוך 3 ימים.
      3. אסטרטגיית הגטינג הבאה מומלצת על מנת לזהות Foxp3+Tregs מושרים בתרחיפים חד-תאיים מבלוטות כבד, טחול או לימפה באמצעות ציטומטריה של זרימה: זהה תאים חיים באמצעות ערכת כתמים של תאים מתים אקווה הניתנים לתיקון חי/מת. לאחר מכן, שער על תאי כבד שהם CD45+ (PerCP, שיבוט RA3-6B2), ותאי שער CD4+ (FITC, שיבוטGK1.5) משער CD45+. מתאי CD4+, זהה את האחוזים של תאי CD25+ (PE, שיבוט 7D4) ו-FoxP3+ (APC, שיבוט 3G3).
  4. ניתוח היסטולוגי של רקמות כבד עבור הפטיטיס
    1. ביום ה-21, קבעו את מקטעי הכבד (בעובי 5 מיקרומטר) בפורמלין נייטרלי של 10% וכתם עם המטוקסילין ואוזין.
    2. קבעו את ציוני ההיסטולוגיה תחילה בהספק נמוך (40X) ב-2 צפיות בממוצע ואשרו ב-64X. דרג את חלקי הרקמה כדלקמן: דרגה 0 =ללא דלקת או נמק; דרגה 1 = דלקת לובולרית קלה ללא נמק; דרגה 2= דלקת לובולרית הכוללת <50% מהקטע; דרגה 3=דלקת לובולרית הכוללת ≥ 50% מהקטע; ודרגה 4=דלקת עם נמק.
  5. קביעת רמות הציטוקינים ברקמות בטחולים ובכבדים.
    1. ביום ה-14 או היום ה-21, הומוגניזציה של דגימות הכבד או הטחול (1 גרם) מכל עכבר ב-1 מ"ל של RPMI/2% FCS עד לקבלת הומוגנייזר מעבדה כללי על הגדרה בינונית. שמור על המדגם קר על קרח.
    2. צנטריפוגה ההומוגנטית למשך 15 דקות ב 1455 x g ב 4 °C באמצעות צנטריפוגה שולחנית מקוררת. הצמד להקפיא את supernatant ולאחסן ב -80 °C (80 °F) עד מוכן לשימוש. ניתן למדוד את רמות הציטוקינים והכימוקין באמצעות ערכות ELISA מסחריות, בהתאם להוראות הערכה. תקן את רמות הציטוקינים על ידי המרת הרמות (ב-mL או ב-μL) ל-pg/g של רקמה.
  6. זיהוי נוגדנים בסרום ל-CYP2E1, ל-CYP2E1 epitope JHDN5 ולמטבוליט של תרופת ה-TFA.
    1. בימים 14 או 21, הרדימו את העכברים עם 40-60 מ"ג/ק"ג קטמין מעורבב עם 4-6 מ"ג/ק"ג קסילאזין. אשרו את עומק ההרדמה התקין על ידי התבוננות בירידה בטונוס השרירים וללא תגובה לגירויים כואבים, כגון צביטה בבוהן (רפלקס גמילה), בנוסף לאובדן רפלקסים מיישרים ואובדן רפלקסים פלברליים. השתמשו במחט 25 גרם המחוברת למזרק שחפת והתקרבו ללב על ידי קידום איטי של המחט לתוך חלל בית החזה שמתחת לצלעות ומיד לרוחב לתהליך ה-xiphoid. לאסוף דם באמצעות ניקוב תוך לבבי.
    2. לאחר איסוף הדם, אפשרו לו לקריש אותו בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה דגימות הדם ב 295 x g במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. הסר בזהירות את הסרה, aliquot את sera ו הצמד להקפיא ב -20 °C (76 °F).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

לוח הזמנים לחיסונים המשמש להשראת DIH המוצג באיור 1 מייצג את שני החיסונים הנדרשים בבסיס הצוואר (יום 0) ובבסיס הזנב (יום 7). איור 2 מציג נתוני התפשטות מייצגים שהתקבלו ביום ה-14 באמצעות CFSE בתגובה ל-CYP2E1, JHDN5, האפיטופ CYP2E1 והמטבוליט הטריפלואורואצטיל (TFA) של חומרי ההרדמה. איור 3 מראה את אסטרטגיית הגטינג ואת ניתוח הציטומטריה של זרימה מייצגת של CD4+CD25+FoxP3+ Tregs מושרים שהתקבלו ביום ה-14. איור 4 מר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כוחו של פרוטוקול זה נשען על יכולת השכפול שלו; לכן, זה קריטי לדבוק בצעדים המוצעים. ניסוח של האימונוגן יכול להיות מחסום עבור חלק; עם זאת, שחזרנו את המודל שלנו באמצעות האפיטופ המתואר במסמך שלנו, אשר מסיר את הצורך לבודד את החלק S100 של הכבד. סביר להניח כי אפיטופים או חלבונים נוספים ניתן לשנות ולגרום הפטיטיס בעקבות חיסונים; עם זאת, אנו מתארים את החלבונים שבהם השתמשנו עם תוצאות מהימנות. מספר חלבונים הודגמו כטריפלואורואצטילציה עם חשיפה להרדמה הלוגנית. ככל הנראה בשל התפשטות האפיטופ, חלק מהחלבונים הללו הם גם מטרה לנוגדנים עצמיים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

ד"ר נג'וקו מבקש להודות לד"ר נואל ר. רוז, MD PhD, על ההדרכה והדיונים מלאי התובנות שלו שהביאו לניסוח מודל זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.1% 2,4,6-טריניטרובנזן חומצה סולפונית (TNBS)ThermoFisher28997
AKP ערכת מצעBioRad172-1063
עכברי BALB/cJackson
CellTrace™ ערכת התפשטות תאים CFSEThermoFisherC34554
CFA H37RaBecton Dickinson (Difco Bacto)231131
מגיב חסימת FCRMilteyi130-092-575
תוסף כלליThermoFisherHPRG770
HepaRG™ תאים שמורים בהקפאהThermoFisherHPR GC10
חי/מת ניתן לתיקון ערכת צביעת Aqua Dead Cell ThermoFisherL34965
NaHC03Millipore SigmaS5761
Percoll®Millipore SigmaP1644-1L
רשימת רעלני שעלתביולוגיים180
פוספט חוצץ מי מלח pH 7.4וסחר שונים
; מעכב פרוטאז מיני טבליות, ללא EDTAThermoFisher88666
אשלגן הידרוקסידJT Baker3140-01
S-ethyltrifluorothioacetate (S-ETFA)Millipore Sigma177474
קלטות דיאליזה Slide-a-lyzer (10 K, 12 מ"ל)ThermoFisher66810
UltraPure™ פתרון SDS, 10%ThermoFisher24730020
Williams Media E, ללא פנול אדוםThermoFisherA1217601
פירס

מקורות

  1. Castiella, A., Zapata, E., Lucena, M. I., Andrade, R. J. Drug-induced autoimmune liver disease: A diagnostic dilemma of an increasingly reported disease. World J. Hepatology. 6 (4), 160-168 (2014).
  2. Bjornsson, E. S., Bergmann, O. M., Bjornsson, H. K., Kvaran, R. B., Olafsson, S. Incidence, presentation, and outcomes in patients with drug-induced liver injury in the general population of Iceland. Gastroenterology. 144 (7), 1419-1425 (2013).
  3. Castiella, A., Lucena, M. I., Zapata, E. M., Otazua, P., Andrade, R. J. Drug-induced autoimmune-like hepatitis: a diagnostic challenge. Digestive Diseases and Sciences. 56 (8), 2501-2502 (2011).
  4. Czaja, A. J. Drug-induced autoimmune-like hepatitis. Digestive Diseases and Sciences. 56 (4), 958-976 (2011).
  5. Pohl, L. R., Thomassen, D., Pumford, N. R., Butler, L. E., Satoh, H., Ferrans, V. J., Perrone, A., et al. Hapten carrier conjugates associated with halothane hepatitis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 283, 111-120 (1991).
  6. Njoku, D. B., Talor, M. V., Fairweather, D., Frisancho-Kiss, S., Odumade, O. A., Rose, N. R. A novel model of drug hapten-induced hepatitis with increased mast cells in the BALB/c mouse. Experimental and Molecular Pathology. 78 (2), 87-100 (2005).
  7. Cottagiri, M., Nyandjo, M., Stephens, M., Mantilla, J., Saito, H., Mackay, I. R., et al. In drug-induced, immune-mediated hepatitis, interleukin-33 reduces hepatitis and improves survival independently and as a consequence of FoxP3+ T-cell activity. Cellular and Molecular Immunology. , (2018).
  8. Lohse, A. W., Manns, M., Dienes, H. P., Meyer zum Buschenfelde, K. H., Cohen, I. R. Experimental autoimmune hepatitis: disease induction, time course and T-cell reactivity. Hepatology. 11 (1), 24-30 (1991).
  9. McCarthy, E. K., Vakos, A., Cottagiri, M., Mantilla, J. J., Santhanam, L., Thomas, D. L., et al. Identification of a Shared Cytochrome p4502E1 Epitope Found in Anesthetic Drug-Induced and Viral Hepatitis. mSphere. 3 (5), (2018).
  10. Cho, J., Kim, L., Li, Z., Rose, N. R., Talor, M. V., Njoku, D. B. Sex bias in experimental immune-mediated, drug-induced liver injury in BALB/c mice: suggested roles for Tregs, estrogen, and IL-6. PLoS. One. 8 (4), 61186(2013).
  11. Satoh, H., Gillette, J. R., Takemura, T., Ferrans, V. J., Jelenich, S. E., Kenna, J. G., et al. Investigation of the immunological basis of halothane-induced hepatotoxicity. Advances in Experimental Medicine and Biology. 197, 657-673 (1986).
  12. Eliasson, E., Kenna, J. G. Cytochrome P450 2E1 is a cell surface autoantigen in halothane hepatitis. Molecular Pharmacology. 50 (3), 573-582 (1996).
  13. Bourdi, M., Chen, W., Peter, R. M., Martin, J. L., Buters, J. T., Nelson, S. D., et al. Human cytochrome P450 2E1 is a major autoantigen associated with halothane hepatitis. Chemical Research in Toxicology. 9 (7), 1159-1166 (1996).
  14. Njoku, D. B., Li, Z., Washington, N. D., Mellerson, J. L., Talor, M. V., Sharma, R., et al. Suppressive and pro-inflammatory roles for IL-4 in the pathogenesis of experimental drug-induced liver injury. European Journal of Immunology. 39 (6), 1652-1663 (2009).
  15. Aithal, G. P., Ramsay, L., Daly, A. K., Sonchit, N., Leathart, J. B., Alexander, G., et al. Hepatic adducts, circulating antibodies, and cytokine polymorphisms in patients with diclofenac hepatotoxicity. Hepatology. 39 (5), 1430-1440 (2004).
  16. Higuchi, S., Kobayashi, M., Yoshikawa, Y., Tsuneyama, K., Fukami, T., Nakajima, M., et al. IL-4 mediates dicloxacillin-induced liver injury in mice. Toxicology Letters. 200 (3), 139-145 (2011).
  17. Rubtsova, K., Marrack, P., Rubtsov, A. V. Sexual dimorphism in autoimmunity. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2187-2193 (2015).
  18. Satoh, H., Fukuda, Y., Anderson, D. K., Ferrans, V. J., Gillette, J. R., Pohl, L. R. Immunological studies on the mechanism of halothane-induced hepatotoxicity: immunohistochemical evidence of trifluoroacetylated hepatocytes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 233 (3), 857-862 (1985).
  19. Habeeb, A. F. Determination of free amino groups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid. Analytical Biochemistry. 14 (3), 328-336 (1966).
  20. Christen, U., Burgin, M., Gut, J. Halothane metabolism: immunochemical evidence for molecular mimicry of trifluoroacetylated liver protein adducts by constitutive polypeptides. Molecular Pharmacology. 40 (3), 390-400 (1991).
  21. Christen, U., Quinn, J., Yeaman, S. J., Kenna, J. G., Clarke, J. B., Gandolfi, A. J., et al. Identification of the dihydrolipoamide acetyltransferase subunit of the human pyruvate dehydrogenase complex as an autoantigen in halothane hepatitis. Molecular mimicry of trifluoroacetyl-lysine by lipoic acid. European Journal of Biochemistry. 223 (3), 1035-1047 (1994).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Cytochrome P450 2E1
אינדוקציה של הפטיטיס אוטואימונית הנגרמת על ידי תרופות בעכברי BALB/c לחקר המנגנונים הפתוגניים שלה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.