הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מסכי אחד-היברידית משופרת שמרים לזהות גורם שעתוק מחייב את רצפי דנ א אנושי

8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59192

⸱

11 בפברואר 2019

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Boston University, 2Bioinformatics Program, Boston University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, נציג של שמרים משופר אחד-היברידית הקרנת פרוטוקול כדי לזהות את גורמי שעתוק (TFs) ניתן לאגד לאזור ה-DNA האנושי של עניין. שיטה זו משתמשת צינור ההקרנה תפוקה גבוהה אשר ניתן לחקור את הכריכה של > 1,000 TFs בניסוי יחיד.

תקציר

זיהוי קבוצות גורמי שעתוק (TFs) המסדירים כל הגן האנושי היא משימה מרתיעה הדורש שילוב של גישות ניסוייות וחישוביות רבים. שיטה אחת כזו היא וזמינותו (Y1H) אחד-היברידית שמרים, באיזו מתגובות. הגומלין בין שר ה-DNA אזורים נבדקים את חצרו של גרעין שמרים באמצעות כתב גנים. מבחני Y1H כולל שני רכיבים: על "ה-DNA-פיתיון' (למשל., היזמים, מוצרי טיפוח טבעיים, משתיקי קול, וכו '), 'TF-טרף,' אשר יכולים להיות מוקרן על הפעלת גנים כתב. ביותר שפורסמה בפרוטוקולים לביצוע מסכי Y1H מבוססים על להפוך ספריות TF-טרף או מערכים זני שמרים DNA-פיתיון. כאן, אנו מתארים צינור, שנקרא Y1H משופרת (eY1H) מבחני, איפה TF-DNA אינטראקציות הם שנחקרו על-ידי הזדווגות זנים DNA-הפיתיון עם אוסף ערוכים של זנים TF-טרף באמצעות מערך צפיפות גבוהה פלטפורמה רובוטית (HDA) המאפשר הקרנה ב- 1536 תבנית של המושבה. דבר זה מאפשר עלייה דרמטית בערך תפוקה (רצפי DNA-פיתיון 60 נגד > 1,000 TFs לוקח שבועיים לכל חוקר) ו הפארמצבטית. אנו מדגימים סוגים שונים של התוצאות הצפויות על-ידי בדיקת יזם האנושי רצפים נגד מערך של 1,086 TFs האנושית, כמו גם דוגמאות של בעיות שעשויות להתרחש במהלך מסכי וכיצד לפתור אותם.

מבוא

בעיה מרכזית בתחום הביו-רפואי הוא בקביעת המנגנון שבאמצעותו מוסדר כל הגן האנושי. תמלול היא הצעד הראשון בשליטה על רמות ביטוי גנים, זה מוסדר על ידי קבוצות של גורמי שעתוק (TFs) ייחודיים לכל הגנים. נתון כי בני אדם קידוד עבור > 1,500 TFs1,2, המזהה את הערכה המלאה של TFs השולטים הביטוי של כל הגן נותר אתגר פתוח.

שני סוגים של שיטות יכול לשמש כדי למפות TF-DNA אינטראקציות: שיטות ממורכז TF וממורכז הדנ א3 (איור 1 א'). בשיטות TF ממורכז, TF עניין הוא נחקר עבור איגוד לאזורים דנ א גנומי או כדי לקבוע שלה ירידה לפרטים איגוד ה-DNA. שיטות אלה כוללות immunoprecipitation כרומטין (ChIP) ואחריו רצף תפוקה גבוהה, מיקרו-מערכים מחייב חלבון ו- SELEX4,5,6. בשיטות ממורכז דנ א, רצף ה-DNA של עניין הוא נחקר כדי לקבוע את קבוצת שר זה לאגד רצף ה-DNA. אפלייד נרחב ביותר של שיטות כאלה היא מבחני שמרים אחד-היברידית (Y1H), באיזו מתגובות. הגומלין בין שר ה-DNA אזורים נבדקים את חצרו של גרעין שמרים באמצעות כתב הגנים7,8,9.

מבחני Y1H כולל שני רכיבים: על "ה-DNA-פיתיון' (למשל, היזמים, מוצרי טיפוח טבעיים, משתיקי קול, וכו '), 'TF-טרף,' אשר יכולים להיות מוקרן כתב ג'ין הפעלה9,10 (איור 1B). דנ א-הפיתיון שוכפל במעלה הזרם של כתב שני גנים (LacZ ו HIS3) וקבועים DNA-bait::reporter שני משולבים לתוך הגנום שמרים ליצירת chromatinized 'DNA-פיתיון זנים.' TF-הטרף, המקודדת על פלסמיד המבטאת של TF התמזגו לתחום הפעלה (AD) של השמרים Gal4 TF, מוחדרים המתח DNA-פיתיון לדוג עבור אינטראקציות TF-DNA. אם TF-הטרף נקשר רצף ה-DNA-פיתיון, ואז המודעה נוכח TF-הטרף יוביל להפעלת שתי גנים כתב. כתוצאה מכך, תאים עם השפעה חיובית הדדית יכול להיות שנבחר עבור הצמיחה על צלחות חסר היסטידין, כמו גם התגברות על מעכב תחרותי, 3-אמינו-1,2,4-triazole (3-AT), דמיינו כמו מושבות כחול בנוכחות X-גל. כי חזק שמרים Gal4 לספירה משמש, מבחני Y1H יכול לזהות אינטראקציות מעורבים activators תעתיק וכן repressors. בנוסף, לאור העובדה TF-הטרף באים לידי ביטוי של מקדם חזק שמרים (ADH1), ניתן להבחין אינטראקציות אפילו בשביל TFs בעלי רמות ביטוי אנדוגני נמוכה, אשר הם מאתגרים לזהות על-ידי שבב11,12.

ביותר שפורסמה בפרוטוקולים לביצוע מבחני Y1H מבוססים על ידביקו TF-הטרף זנים DNA-פיתיון שמרים בהפיכת ספריות TF-טרף במאגר עקב בחירה, המושבה איסוף, ורצף כדי לזהות את TF אינטראקציה, או על ידי שינוי צורה של הפרט שיבוטים8,9. אלה הם פרוטוקולי גוזלת זמן, הגבלת מספר רצפי דנ א יכול להיבדק לכל חוקר. שיפור האחרונות של מבחני Y1H, שנקרא משופרת Y1H (eY1H), גדל באופן דרמטי את התפוקה הקרנה באמצעות פלטפורמה רובוטית של המערך (HDA) צפיפות גבוהה להזדווג זני שמרים DNA-הפיתיון עם אוסף של זני שמרים כל ביטוי שונה TF-טרף10,13 (איור 1C). המסכים הבאים מעסיקים של המושבה 1,536 פורמט המאפשר מבחן TFs האנושי ביותר באמצעות לוחות רק שלוש ארבע פעמים. עוד יותר, בהתחשב בעובדה TF-DNA אינטראקציות נבדקים באופן pairwise, גישה זו מאפשרת להשוואת אינטראקציות בין DNA-פיתיונות (כגון שתי גרסאות noncoding נוקלאוטיד יחיד) ובין שר אחר או TF גרסאות11,12 ,14.

באמצעות מבחני eY1H, לנו יש מאפשרת את האדם הגדול ואת Caenorhabditis elegans ממורכז DNA TF-DNA אינטראקציות רשתות עד היום. בפרט, זיהינו 2,230 אינטראקציות בין 246 משפרי התפתחותית האנושי 283 TFs12. יתר על כן, יש לנו עובדים eY1H מבחני לחשוף מחייב TF שינו 109 נוקלאוטיד יחיד noncoding משתנים הקשורים עם מחלות גנטיות כגון מום התפתחותית, סרטן, הפרעות נוירולוגיות. לאחרונה, השתמשנו eY1H על רשת הכוללת 21,714 אינטראקציות בין היזמים ג'ין C. elegans 2,576 366 TFs11. רשת זו הייתה לחשוף את תפקיד פונקציונלי של עשרות TFs C. elegans .

הפרוטוקולים להפיק DNA-פיתיון כתמי ולהעריך את הרמות של פעילות עיתונאית הרקע היה דיווח במקום אחר15,16,17. כאן, אנו מתארים של צינור eY1H יכול לשמש למסך בכל אזור דנ א גנומי האנושי נגד מערך של 1,086 TFs אנושי. ברגע שמרים DNA-פיתיון המתח נוצר מערך TF-טרף ניצפית על גבי הלוחות המתאימים, ניתן לבצע פרוטוקול כולו בעוד שבועיים (טבלה 1). וחשוב מכך, יכול להיות parallelized הפרוטוקול כך חוקר יחיד. באפשרותך לסנן רצפי DNA-פיתיון 60 בו זמנית. כדי להדגים את הפרוטוקול, הוקרנו היזמים של שני גנים ציטוקינים CCL15 ו- IL17F. בנוסף, אנו מראים תוצאות המסכים שנכשלו להמחשת סוגי הבעיות שעלולות להתעורר בעת ביצוע מבחני eY1H וכיצד לפתור אותם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. תכשירים

  1. Sc-−U-−H-צלחות (צלחות פטרי 150 מ מ)
    הערה: הצלחות האלה ישמש לגידול זני שמרים את הדנ א-פיתיון.
    1. להמיס את הנשירה תערובת בסיס חנקן שמרים (YNB), hemisulfate אדנין, אמוניום סולפט בשנת 920 מ של מים, ו pH אל 5.9 עם NaOH M 5 (כ 1 מ"ל לליטר של מדיה; ראה בטבלה 2 עבור הרכב). שופכים לתוך בקבוקון 2 ל' והוסף בר מערבבים.
    2. בקבוקון 2 ל' השני, הוסף את אגר עד 950 מ"ל של מים (אין להוסיף בר מערבבים כמו זה יגרום את אגר לרתיחה ב החיטוי).
    3. אוטוקלב למשך 40 דקות-15 psi על מחזור נוזלי.
    4. ומיד שופכים את תכולת הבקבוק הראשון, כולל שורת stir, לתוך אגר המכיל את הבקבוק. להוסיף את הסוכר, מערבבים היטב על צלחת stir, מגניב עד 55 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים.
    5. להוסיף את לאוצין, טריפטופן את התקשורת. לערבב היטב על צלחת מערבבים ויוצקים לתוך צלחות פטרי סטריליות 150 מ מ (~ 80 מ לכל מנה). יבש 3-5 ימים בטמפרטורת החדר, לעטוף בשקיות פלסטיק, וכדי לאחסן בטמפרטורת החדר עד 6 חודשים.
  2. צלחות מלבניות YAPD
    הערה: הצלחות האלה ישמש לגידול הדשא לזן של ה-DNA-פיתיון ועבור הזדווגות עם אוסף מערך TF.
    1. להמיס אבקות (ראו טבלה 3 עבור הרכב), למעט אגר, ב- 950 מ"ל בקבוקון 2 ל' מים ולהוסיף בר מערבבים.
    2. בקבוקון 2 ל' השני, הוסף את אגר עד 950 מ"ל של מים (אין להוסיף בר מערבבים כמו זה יגרום את אגר לרתיחה ב החיטוי).
    3. אוטוקלב למשך 40 דקות-15 psi על מחזור נוזלי.
    4. ומיד שופכים את תכולת הבקבוק הראשון, כולל שורת stir, לתוך אגר המכיל את הבקבוק.
    5. להוסיף את הסוכר, מערבבים טוב על מערבבים בצלחת של מגניב עד 55 מעלות צלזיוס. שופכים את המדיה לתוך הצלחות מלבני (ראה טבלה של חומרים; ~ 70 מ לכל צלחת) באמצעות משאבה סחרור (5 מ ל/שניה) אבובים 6 מ מ. יבש ליום 1 בטמפרטורת החדר, לעטוף בשקיות פלסטיק, ולאחסן את החדר הקרה עד 6 חודשים.
      הערה: למרות שעוצמת media המוצע הוא 70 מ לכל צלחת, 50-80 מ לכל צלחת יכול לשמש. בעיות קריטיות שלושה לשקול מתי שוטף צלחות 1) כי החלקתן כך התקשורת אגר יש עובי אותה ברחבי הבסיס (השתמש בטבלה מפולס או משטח למזיגה צלחת ויוצקים לא בערימות של יותר משבע צלחות) 2) כדי לוודא העדר של בועות אגר המדיה (בועות צריך להיות popped באמצעות מחט סטרילית) ו- 3) ייבוש הלוחות ליום אחד בלבד והגלישה הלוחות בשקיות פלסטיק כדי למנוע כשלים להצמדת שמרים.
  3. Sc −Trp ו- Sc −U −Trp צלחות מלבניות
    הערה: הצלחות האלה ישמש לגידול האוסף מערך TF (Sc −Trp) וכדי לבחור שמרים דיפלואידי לאחר ההזדווגות (Sc −U −Trp).
    1. להמיס את הנשירה לערבב YNB, hemisulfate אדנין, אמוניום סולפט בשנת 920 מ של מים, ו pH אל 5.9 עם NaOH 5 מ' (כ 1 מ"ל לליטר של מדיה) (ראה טבלה 4 עבור הרכב). שופכים לתוך בקבוקון 2 ל' והוסף בר מערבבים.
    2. בקבוקון 2 ל' השני, הוסף את אגר עד 950 מ"ל של מים (אין להוסיף בר מערבבים כמו זה יגרום את אגר לרתיחה ב החיטוי).
    3. אוטוקלב למשך 40 דקות-15 psi על מחזור נוזלי.
    4. ומיד שופכים את תכולת הבקבוק הראשון, כולל שורת stir, לתוך אגר המכיל את הבקבוק. להוסיף את הסוכר, מערבבים היטב על צלחת stir, להצטנן עד 55 מעלות צלזיוס.
    5. הוסף את לאוצין, היסטידין אורציל (להשמיט את אורציל עבור לוחות −Trp −U Sc).
    6. לערבב היטב על צלחת מערבבים ויוצקים לתוך צלחות מלבניות (~ 70 מ לכל צלחת) באמצעות משאבת סחרור (5 מ ל/שניה) אבובים 6 מ מ. מתייבשים ליום 1 בטמפרטורת החדר, לעטוף את הצלחות בשקיות פלסטיק, לאחסן בחדר קר עד 3 חודשים.
  4. Sc −U −H −Trp + 3AT + צלחות מלבניות X-גל
    הערה:     הצלחות האלה ישמש בתור readout לוחות עבור מבחני eY1H.
    1. להמיס את הנשירה לערבב YNB, hemisulfate אדנין, אמוניום סולפט ב- 850 מ ל מים (ראה טבלה 5 עבור הרכב). לא pH. שופכים לתוך בקבוקון 2 ל' והוסף בר מערבבים.
    2. בבקבוקון 2 ל' השני, להוסיף את אגר 850 מ ל מים (אין להוסיף בר מערבבים כמו זה יגרום את אגר לרתיחה ב החיטוי).
    3. אוטוקלב למשך 40 דקות-15 psi על מחזור נוזלי.
    4. הכינו 10 x BU מלחי (1 ליטר) על ידי שילוב של 900 מ ל מים, 70 גרם של נה2HPO4∙7H2O ו- g 34.5 NaH2PO4∙H2O. לערבב באמצעות בר מערבבים כדי להמיס אבקות ולהתאים את רמת החומציות אל 7.0 באמצעות 5 M NaOH. מוסיפים מים כדי להביא 1 ליטר, תא לחץ.
    5. הכינו את הפתרון X-גל על-ידי הוספת 3.5 גר' אבקה X-גל צינור פלסטיק 50 מל המכיל 42.5 מ של דימתיל formamide. להוסיף אבקת X-גל דימתיל formamide כדי להמיס בקלות רבה יותר (זה לוקח 30 דקות). שמור פתרון מניות בחושך (שימוש אטום 50 מ ל צינור או לכסות בנייר). חנות ב-20 ° C.
    6. ומיד שופכים את תכולת הבקבוק הראשון, כולל שורת stir, לתוך אגר המכיל את הבקבוק. הוסף את הגלוקוז 10 x BU מלחי (ראה טבלה 5 עבור הרכב), לערבב היטב על צלחת stir, להצטנן עד 55 מעלות צלזיוס.
    7. הוסף את לאוצין, 3AT X-גל (לקבלת הרכב, ראה טבלה 5 ).
    8. לערבב היטב על צלחת מערבבים ויוצקים לתוך הצלחות מלבני (~ 70 מ לכל צלחת) באמצעות משאבה סחרור (5 מ ל/שניה) אבובים 6 מ מ. יבש ליום 1 בטמפרטורת החדר, לעטוף בשקיות פלסטיק, ולאחסן את החדר הקרה מכוסה בנייר אלומיניום (3AT ו- X-גל הם רגיש אור) עד כחודש.

2. איתור מערך TF

  1. מפשיר את המערך TF-טרף
    1. הפשרת שמרים גליצרול צלחות מניות עם המערך TF-טרף על קרח.
      הערה: ניתן להפיק TF-טרף מערכים כמו שפורסמו בעבר10,12,13,18.
    2. Resuspend שמרים באמצעות פיפטה של 12 ערוצים בתוך 1-3 דקות לפני השלב הבא.
  2. הבחינה השמרים לתוך Sc −Trp צלחות מלבניות
    1. ב HDA הרובוט (ראה טבלה של חומרים), בחר 96 צלחות רב טוב כמו המקור, פלטות אגר 96 היעד, וכן סיכת ארוך 96 רפידות.
      הערה: רפידות pin אינם לשימוש חוזר, צריכים להיות מושלך.
    2. בחר את התוכנית לשכפל רבים לעשות שני עותקים לכל צלחת 96-ובכן. אין להשתמש המיחזור או ולבקר אפשרויות כדי למנוע זיהום האחורי של המניות קפוא.
    3. בחר באפשרות הכוריאוגרף למעלה ולמטה במקור כדי לערבב את השמרים.
    4. תיק המערך מנומר, דגירה אגר בצד למעלה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים.
  3. יצירת מערכים המושבה 384 ב- Sc −Trp צלחות מלבניות
    1. הרובוט, בחר פלטות אגר 96 כמו המקור, צלחת אגר 384 כמטרה 96 רפידות פין קצר.
    2. בחר את התוכנית מערך 1:4 . בדרך זו, מאוחדים המושבה 96 ארבע צלחות (המכילים כל אחד של TF שונים) לתוך צלחת אחת 384 המושבה. אין להשתמש המיחזור או ולבקר אפשרויות כדי למנוע תקשורת בין לוחות שונים.
    3. תיק הלוחות, דגירה אגר-לצד מערך 384-המושבה הבחין למעלה ב 30 מעלות צלזיוס במשך יומיים.
  4. יצירת מערכים המושבה 1,536 ב- Sc −Trp צלחות מלבניות
    הערה: זה יגרום מערכים המכילים ארבע המושבות TF-םימעפ.
    1. הרובוט, בחר פלטות אגר 384 בתור מקור הלוחות אגר 1,536 כמטרה, רפידות פין קצר 384.
    2. בחר את התוכנית מקור יחיד וזמינותו של 1:4. המטרה היא להעתיק את כל המושבה אל ארבע המושבות כדי להשיג quadruplicates. השתמש המיחזור ואת revisit אפשרויות כפי שהוא כרוך בהעתקת ארבע פעמים כל המושבה.
    3. תיק הלוחות, דגירה אגר-לצד מערך 1536-המושבה הבחין למעלה ב 30 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים.
  5. הגברה המערך המושבה 1,536 ב- Sc −Trp צלחות מלבניות
    1. הרובוט, בחר פלטות אגר 1,536 כמו המקור, פלטות אגר 1,536 כמטרה 1,536 רפידות פין קצר.
    2. בחר את התוכנית רבים לשכפל לשכפל עותקים 3-4. השתמש המיחזור, ולבקר את האפשרות, אבל לזרוק את משטח כאשר מחליפים צלחת שונה של המערך כדי למנוע זיהום לחצות.
    3. תיק הלוחות, דגירה אגר-לצד מערך 1536-המושבה הבחין למעלה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים להשתמש להזדווגות שלבים (ראו להלן). לאחר מכן, שמור את הצלחות בטמפרטורת החדר, העתק שוב לאחר 7 ימים לסיבוב חדש של ההקרנה.

3. eY1H מסך

  1. הכנת ה-DNA-פיתיון זן דשא להזדווגות
    1. במקום השמרים DNA-פיתיון זנים על צלחת −H −U Sc ולגדול במשך 3 ימים ב- 30 ° C.
    2. צובעות את השמרים לתוך 15 ס מ Sc-−U-−H-צלחת בעזרת קיסם סטרילי, כך שהלוח יתאים זנים שונים של 12-16. דגירה אחת ביום 30 ° C.
    3. צובעות את השמרים לתוך 15 ס מ Sc-−U-−H-צלחת בעזרת קיסם סטרילי, כך שהלוח יתאים 4 זנים שונים. תקופת דגירה של יום אחד ב- 30 ° C.
    4. לגרד את השמרים באמצעות קיסם סטרילי, מקפיד לא לגרד כל אגר ולהוסיף לתוך צינור 1.5 עם 500 µL של מים סטריליים.
    5. להוסיף 10 – 15 חרוזי זכוכית סטריליים על צלחת מלבנית YAPD. הוסף את המתלים שמרים לצלחת ומנערים ביסודיות בכל הכיוונים עבור 1 דקות להבטיח שהשמרים היא התפשטה דרך כל הלוח.
    6. הפוך את הצלחת מיד והקש על כך החרוזים לעבור המכסה. הסר ולאחר למחזר את החרוזים.
    7. לוחיות הרישוי ועם תקופת דגירה אגר בצד למטה של 1 – 2 ימים ב- 30 ° C. לאחר מכן המשך לשלב ההזדווגות.
  2. ההזדווגות של שמרים DNA-פיתיון וללחצים מערך TF
    1. להעביר את המערך TF צלחת מלבנית YAPD עם הרובוט. בחר את הצלחת אגר 1,536 מקור היעד, ואת משטח 1,536 פין קצר. בחר את התוכנית לשכפל רבים . כל צלחת מערך TF ניתן להעביר ל 3-4 צלחות YAPD (בהתאם למספר הצלחות במערך). מערך TF הגלופות המשמשות להזדווגות חייב להיות בן 2-3 ימים אבל לא יותר כמו ההזדווגות עשוי להיות לא יעיל.
    2. להעביר את הדשא של זן ה-DNA-פיתיון הלוחות YAPD כבר המכיל את המערך TF עם הרובוט. בחר את הצלחת אגר 1,536 מקור היעד, ואת משטח 1,536 פין קצר. בחר את התוכנית לשכפל רבים . השימוש של ההיסט המקרי במקור עם רדיוס של ~0.6 מ מ כדי למנוע לוקח שמרים מאותה נקודה ומערבבים על המטרה כדי להקל על הקשר בין זני שמרים. השתמש את הדשא שמכילות את הדנ א-פיתיון (סעיף 3.1) כמקור ולאחר הלוחות YAPD המכיל את המערך TF הבחין בשלב 3.2.1 כמטרה.
    3. תיק הלוחות, דגירה אגר בצד למעלה ב 30 ° C עבור יום אחד.
  3. הבחירה של שמרים דיפלואידי
    1. העבר את השמרים ובסיומה מן הלוחות YAPD Sc −U −Trp צלחות עם הרובוט. בחר את הצלחת אגר 1,536 מקור היעד, ואת משטח 1,536 פין קצר. בחר את התוכנית לשכפל . מערבבים על מקור ועל המטרה.
    2. תיק הלוחות, דגירה אגר בצד למעלה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 2 – 3 ימים (זמן דגירה מוביל לפעילות כתב רקע).
  4. להעביר readout צלחות
    1. העבר את השמרים דיפלואידי מן הלוחות −Trp −U Sc readout צלחות מלבניות Sc −U −H −Trp + 3AT 5 מ מ + 0.4 מ מ X-גל השימוש ברובוט. בחר את הצלחות אגר 1,536 מקור היעד, ואת משטח 1,536 פין קצר. בחר את התוכנית לשכפל .
    2. תיק הלוחות, דגירה אגר בצד למעלה ב 30 ° C עד 7 ימים.
  5. הדמיה של הבדיקה צלחות
    1. עבור זנים DNA-הפיתיון עם רקע עיתונאי פעילות, לצלם תמונות בימים 2, 3 ו- 4. אחרת, לצלם תמונות ימים 4 ו-7. אינטראקציה חיובית מזוהים על ידי צמיחה וצבע כחול של המושבות שמרים, יכול להיקבע באופן ידני, או ניתן לקבוע באמצעות תוכנת ניתוח התמונה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

שלושה גורמים עיקריים יש לשקול בעת ניתוח תוצאות מבחני eY1H: הפעילות העיתונאית רקע של המתח DNA-פיתיון, עוצמת הפעילות העיתונאית המתאים TF-DNA אינטראקציות, ואת מספר מושבות חיובי. הפעילות העיתונאית רקע (קרי: autoactivity) של המתח DNA-פיתיון מתייחס הצמיחה הכללי ואת הצבע של המושבות שמרים בצלוחית readout, אפילו בהיעדר TF-טרף. באופן אידיאלי, זנים שאינם autoactive להראות על רקע לבן או בהיר צבע חום, עם מושבות עבור אינטראקציות חיוביות להיות גדול וכחול. Autoactive DNA-פיתיון זנים הצג צמיחת שמרים מדיה חסר היסטידין, צבע כחול בנוכחות X-...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

EY1H רובוטית ההזדווגות ההקרנה הגישה המתוארת כאן במידה רבה מגדילה את התפוקה כדי לזהות את קבוצת TFs לאגד לאזור ה-DNA של עניין, לעומת ההקרנה ספריה הקודמים או הקרנה ערוכים גישות המבוסס על שינוי. יתר על כן, את האינטראקציות TF-DNA מזוהה על-ידי eY1H מבחני הם מאוד לשחזור, כמו 90% של אינטראקציות שזוהו הן חיובית עבור כל המושבות ארבע בדיקות לכל TF, 90% של אינטראקציות תבדקי במסך עצמאית של אותם שמרים DNA-פיתיון זן10 , 12 , 19. יותר חשוב, אינ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים [R35-GM128625 כדי J.I.F.B.].

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
3-אמינו-1,2,4-טריאזול (3AT) ~95% TLCSigmaA8056-100Gמעכב תחרותי למוצרים של הגן HIS3
אדנין סולפט (המיסולפט), דיהידראטUS BiologicalsA0865נדרש לגידול שמרים תקין
אגר חוזק ג'ל גבוה - דרגה בקטריולוגיתאמריקאית בינלאומית AGHGUPחומר תזונתי לגידול שמרים
אמוניום סולפטUS BiologicalsA1450מקור חנקן במדיה שמרים סינתטית
D+ גלוקוז נטול מיםUS BiologicalsG3050נדרש לגידול שמרים
תערובת נשירה מינוס His, Leu, Tryp ו-Uracil, עשיר באדנין ללא בסיס חנקן שמריםUS BiologicalsD9540-02מדיה שלמה סינתטית נדרשת לקצה גידול שמרים
מד pH רב-פרמטריHannaInstruments HI2020-01למדידת pH של מדיה סלקטיבית
קיסמים שטוחים 750 קראטיהלוםלפס שמרים על
חרוזי זכוכיתוולטר שטרן100Cכדי לסחוט שמרים בעת הכנת מדשאות
גליצרול ≥ 99%Millipore SigmaG9012-1Lנדרש לייצור מלאי שמרים קפואים
L-HistidineUS BiologicalsH5100לבחירת גידול שמרים במדיה סלקטיבית
L-LeucineUS BiologicalsL2020-05לבחירת גידול שמרים במדיה סלקטיבית
L-TryptophanSigmaT-0254לבחירת גידול שמרים במדיה סלקטיבית
N, N-DimethylformamideSigma319937-1Lלהכנת תמיסת X-gal
Omnipense EliteWheatonW375030-Aלחלוקת כמויות מדויקות של מדיה לתוך צלחות זינגר
פפטון, בקטריולוגיאמריקאי בינלאומיכימי PEBAUPמקור חלבון נדרש לגידול שמרים
צלחת פטרי, 150 מ"מ x15 מ"מVWR10753-950לגידול פיתיונות שמרים עבור הקרנה
PlusPlatesSinger InstrumentsPLU-003לייצור צלחות אגר מלבניות לשימוש עם Singer Robot
דיוק בטמפרטורה נמוכה BOD חממה מקוררתThermoFisher ScientificPR205745Rלדגירת צלחות שמרים בטמפרטורה קבועה
RePads 1,536קצר Singer InstrumentsREP-005כדי להעביר את מערך הטרף TF, להזדווג עם שמרים ולהעביר שמרים ללוחות בחירה וקריאה דיפלואידיים
RePads 384 Singer Instruments קצריםREP-004להעברת מערך TF-prey מ-384 ל-1,536 פורמט מושבה
RePads 96Singer InstrumentsREP-001להעברת מערך טרף TF ממלאי גליצרול לצלחת אגר
RePads 96קצר Singer InstrumentsREP-002להעברת מערך טרף TF מפורמט מושבה 96 ל-384
Singer HDA RoToR רובוטSinger מכשיריםלהעברת שמרים בצורה בעלת תפוקה גבוהה
נתרן הידרוקסיד (כדורים/ACS מוסמך)FisherS318-1להתאמת pH של מדיה סלקטיבית
נתרן פוספט דו-בסיסי heptahydrateSanta Cruz Biotechnologysc-203402Cנדרש לפעילות מדווח LacZ ב-X-gal 
נתרן פוספט מונוהידראט מונוהידראטסנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-202342Bנדרש לפעילות מדווח LacZ ב-X-gal 
UracilSigmaU0750-100Gלבחירת גידול שמרים במדיה סלקטיבית
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside)Gold BiotechnologyX4281C100&-galactosidase הופך לכחול X-gal חסר צבע לזיהוי אינטראקציה בין חלבון ל-DNA
תמצית שמריםUS BiologicalsY2010מדיום מזין לגידול והתפשטות שמרים
בסיס חנקן שמרים (אבקה) ללא AA, פחמימות וללא AS US BiologicalsY2030נדרש לגידול שמרים נמרץ
ארוך

מקורות

  1. Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. A census of human transcription factors: function, expression and evolution. Nature Reviews Genetics. 10 (4), 252-263 (2009).
  2. Lambert, S. A., et al. The Human Transcription Factors. Cell. 172 (4), 650-665 (2018).
  3. Arda, H. E., Walhout, A. J. Gene-centered regulatory networks. Briefings in Functional Genomics. 9 (1), 4-12 (2010).
  4. Jolma, A., et al. DNA-binding specificities of human transcription factors. Cell. 152 (1-2), 327-339 (2013).
  5. Bulyk, M. L., Gentalen, E., Lockhart, D. J., Church, G. M. Quantifying DNA-protein interactions by double-stranded DNA arrays. Nature Biotechnology. 17 (6), 573-577 (1999).
  6. Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
  7. Li, J. J., Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system. Science. 262 (5141), 1870-1874 (1993).
  8. Sewell, J. A., Fuxman Bass, J. I. Options and Considerations When Using a Yeast One-Hybrid System. Methods in Molecular Biology. 1794, 119-130 (2018).
  9. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Gene-Centered Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  10. Reece-Hoyes, J. S., et al. Enhanced yeast one-hybrid assays for high-throughput gene-centered regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1059-1064 (2011).
  11. Fuxman Bass, J. I., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network provides a framework for functional predictions. Molecular Systems Biology. 12 (10), 884(2016).
  12. Fuxman Bass, J. I., et al. Human gene-centered transcription factor networks for enhancers and disease variants. Cell. 161 (3), 661-673 (2015).
  13. Reece-Hoyes, J. S., et al. Yeast one-hybrid assays for gene-centered human gene regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1050-1052 (2011).
  14. Sahni, N., et al. Widespread macromolecular interaction perturbations in human genetic disorders. Cell. 161 (3), 647-660 (2015).
  15. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Generating Bait Strains for Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  16. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Colony Lift Colorimetric Assay for beta-Galactosidase Activity. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  17. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Zymolyase-Treatment and Polymerase Chain Reaction Amplification from Genomic and Plasmid Templates from Yeast. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  18. Deplancke, B., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network. Cell. 125 (6), 1193-1205 (2006).
  19. Reece-Hoyes, J. S., et al. Extensive rewiring and complex evolutionary dynamics in a C. elegans multiparameter transcription factor network. Molecular Cell. 51 (1), 116-127 (2013).
  20. Carrasco Pro, S., et al. Global landscape of mouse and human cytokine transcriptional regulation. Nucleic Acids Research. 46 (18), 9321-9337 (2018).
  21. Whitfield, T. W., et al. Functional analysis of transcription factor binding sites in human promoters. Genome Biology. 13 (9), R50(2012).
  22. Fuxman Bass, J. I., et al. Transcription factor binding to Caenorhabditis elegans first introns reveals lack of redundancy with gene promoters. Nucleic Acids Research. 42 (1), 153-162 (2014).
  23. Hens, K., et al. Automated protein-DNA interaction screening of Drosophila regulatory elements. Nature Methods. 8 (12), 1065-1070 (2011).
  24. Gubelmann, C., et al. A yeast one-hybrid and microfluidics-based pipeline to map mammalian gene regulatory networks. Molecular Systems Biology. 9, 682(2013).
  25. Brady, S. M., et al. A stele-enriched gene regulatory network in the Arabidopsis root. Molecular Systems Biology. 7, 459(2011).
  26. Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Reports. 8 (2), 622-632 (2014).
  27. Burdo, B., et al. The Maize TFome--development of a transcription factor open reading frame collection for functional genomics. The Plant Journal. 80 (2), 356-366 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

בדיקת Yeast One-hybridזני פיתיון DNAמערך טרף TFמערך בצפיפות גבוההפלטפורמה רובוטיתפורמט של 1536 מושבותמצע SC ללא טריפטופאןהפעלת גן מדוררגנומיקה תפקודית
מסכי אחד-היברידית משופרת שמרים לזהות גורם שעתוק מחייב את רצפי דנ א אנושי
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.