מאמר שיטה

דור, הגברה, טיטור של Recombinant וירוסים Syncytial הנשימה

DOI:

10.3791/59218

⸱

4 באפריל 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1UMR 1173 Institut national de la santé et de la recherche médicale (INSERM), Université de Versailles St. Quentin, 2UR892 Institut national de la recherche agronomique (INRA), Unité de virologie et immunologie moléculaires, 3Assistance Publique–Hôpitaux de Paris (AP-HP), Hôpital Ambroise Paré, Laboratoire de Microbiologie

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים שיטה ליצירת, הגברה גנטית שונה וירוסים syncytial הנשימה (RSVs) ואת וזמינותו של פלאק ממוטב עבור RSVs. אנו ממחישים לפרוטוקול זה על-ידי יצירת שני וירוסים רקומביננטי בהתאמה לאפשר כימות של שכפול RSV ולחיות ניתוח של RSV הכללה וגופי בגרגרים הכללה גופים הקשורים דינמיקה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השימוש של וירוסים רקומביננטי הפך מכריע וירולוגיה בסיסי או מוחלת. גנטיקה הפוכה הוכח להיות טכנולוגיה רבת עוצמה, הן כדי לפענח את שכפול ויראלי מנגנונים כדי ללמוד antivirals או לספק פלטפורמת פיתוח חיסונים. הבנייה ואת מניפולציה של מערכת גנטית הפוך שלילי-בשרך וירוס רנ א כגון וירוס syncytial במערכת הנשימה (RSV), עם זאת, נותר עדין ודורש ידע מיוחד. הגנום RSV הוא RNA חד גדילי חוטים, שלילי-תחושה של בערך 15 kb המשמש כתבנית עבור נגיפי RNA שכפול והן שעתוק. מערכת הפוכה הגנטיקה שלנו משתמש עותק cDNA של הגנום הארוך זן RSV האנושי (HRSV). CDNA הזה, כמו גם cDNAs קידוד חלבונים ויראלי של פולימראז מורכבות (L, P, N, M2-1), מוצבים ביטוי בודדים וקטורים תחת רצפי בקרה פולימראז T7. תרביות תאים של רכיבים אלה בסר-T7/5 תאים, אשר stably אקספרס T7 פולימראז, מאפשר שכפול cytoplasmic שעתוק של RSV רקומביננטי, והוליד virions מהונדסים. RSV חדש, אשר קיים על פני התא, את תגובת שיקוע של התרבות של BSRT7/5, נאסף להדביק תאים אנושיים HEp-2 עבור נגיפים. שניים או שלושה סיבובים של הגברה נדרשים לרכוש מניות נגיפית המכילה 1 x 106 עונה 1 פרק 107 ויוצרים רובד יחידות (PFU) / mL. שיטות האופטימלי קציר, הקפאה, ו טיטור של מניות ויראלי מתוארים כאן בפירוט. אנחנו המחשת פרוטוקול המובאת כאן על-ידי יצירת שני וירוסים רקומביננטי בהתאמה לבטא חינם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) (RSV-GFP) או ויראלי M2-1 דבוקה GFP (RSV-M2-1-GFP). אנו מראים כיצד להשתמש RSV-GFP כדי לכמת את RSV-M2-1-GFP להמחיש מבנים ויראלי, כמו גם חלבון נגיפי דינאמיקה של תאים חיים, באמצעות טכניקות במיקרוסקופ וידאו ושכפול RSV.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האדם RSV הוא הגורם המוביל של אשפוז לדלקת חריפה בדרכי הנשימה תינוקות ברחבי העולם1. בנוסף, RSV משויכת נטל משמעותי במחלה אצל מבוגרים להשוות שפעת, עם רוב אשפוז, התמותה נטל הקשישים2. אין חיסונים או antivirals ספציפיים זמינים עדיין נגד RSV, אבל מבטיח תרופות חדשות הן פיתוח3,4. את המורכבות ואת הכובד של הטכניקות של כימות של כפל RSV לעכב את החיפוש אחר antivirals או חיסונים למרות מאמצים ניכרים הנוכחי. כימות של RSV כפל במבחנה בדרך כלל מבוסס על שיטות מפרך, גוזלת זמן, יקר, אשר מורכב בעיקר בניתוח אפקט ציטופתי על ידי מיקרוסקופ, immunostaining, הפחתת פלאק מבחני, כמותי רוורס טרנסקריפטאז (לרביעיית)-תגובת שרשרת פולימראזית (PCR), והוא מקושר-אנזים immunosorbent assay בדיקות. וירוסים עם הגנום ששונה ולבטא גנים הכתב, כגון אלה קידוד ה-GFP, מתאימים יותר עבור הקרנות כאלה. מצמידים בשימוש בקוראי צלחת אוטומטיות, נושא גן וירוסים רקומביננטי כתב יכול לעשות מבחני אלה מתאימים יותר למטרות התקינה ו תפוקה גבוהה.

RSV הוא מעטפת, nonsegmented שלילי-סנס וירוס רנ א שייך הסוג של Orthopneumovirus של Pneumoviridae משפחה, סדר Mononegavirales5. הגנום RSV הוא RNA חד גדילי חוטים, שלילי-תחושה של בערך 15 kb, אשר מכיל את אזור noncoding ב הגפיים 3' ו 5' שנקרא מנהיג, הקרוואן, 10 יחידות תעתיק קידוד חלבונים 11. הגנים מסודרים כדלקמן: 3'-NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2 (קידוד חלבונים M2-1 ו- M2-2), L-5'. ה-RNA הגנומי נארז בחוזקה על ידי נוקלאופרוטאין שימוש ש RNA הגנומי encapsidated כתבנית, תלויי-RNA נגיפי RNA פולימראז (RdRp) יבטיח שעתוק ושכפול של RNA נגיפי. RdRp ויראלי מורכב של החלבון גדולה L אשר נושאת את פעילות נוקלאוטיד פולימראז כשלעצמה, שלה קופקטור חובה phosphoprotein P והחלבון M2-1, אשר מתפקד בתור תעתיק ויראלי גורם6. תאים נגועים, RSV גורם להיווצרות של הכללות cytoplasmic נקרא הכללה גופים (IBs). תכלילים cytoplasmic מורפולוגית דומים נצפו9,8,7, Mononegaviralesמספר10. מחקרים שנעשו לאחרונה על נגיף הכלבת, vesicular stomatitis וירוס (VSV), אבולה וירוס RSV הראה כי סינתזה RNA נגיפי מתרחשת ב- IBs, אשר יכול להיחשב ובכך מפעלים ויראלי8,9,11, 12. המפעלים וירוס להתרכז RNA וחלבונים ויראלי נדרש סינתזה RNA נגיפי, מכילים גם חלבונים הסלולרית13,14,15,16, 17. IBs התערוכה של subcompartment תפקודית שנקרא בגרגרים הקשורים ליברות (IBAGs), אשר רכזו החדש synthetized המתהווה mRNA הנגיפי יחד עם החלבון M2-1. RNA הגנומי של L, P, ואת N לא מזוהים ב- IBAGs. IBAGs הם מבנים כדוריים דינמי קטן בתוך המעי הרגיז כי התערוכה את המאפיינים של organelles נוזלי12. למרות התפקיד המרכזי של IBs בכפל נגיפית, מעט מאוד ידוע על הטבע, המבנה הפנימי, היווצרות, הפעולה של המפעלים האלה ויראלי.

הביטוי של הגנום של poliovirus מ cDNA אפשרה הייצור של השיבוט ויראלי זיהומיות הראשון בשנת 198118. חד-גדילי RNA שלילי וירוסים, זה לא היה עד 1994 הייצור של וירוס הכלבת הראשון בעקבות תקנים של פלסמידים לתוך תאים19 התרחש. מבוסס על פלסמיד הפוכה גנטי המערכת הראשונה עבור RSV פורסם בשנת 199520. גנטיקה הפוכה הובילו התקדמות גדולה בתחום של וירולוגיה. האפשרות של הצגת שינויים ספציפיים לתוך הגנום הנגיפי סיפקה קריטי תובנות שכפול ועל בפתוגנזה של וירוסי RNA. טכנולוגיה זו הנחתה במידה רבה גם את ההתפתחות של חיסונים בכך שהוא מאפשר הנחתה ספציפי באמצעות סדרת יישוב של שינויים. שינויים הגנום ומאפשר כימות מהירה של כפל נגיפית במידה רבה משופרים את ההקרנה אנטי ויראליים, חקר את מצב הפעולה.

למרות שתואר קודם לכן, קבלת RSVs מהונדסים נשאר עדין. כאן, אנו מפרטים פרוטוקול כדי ליצור שני סוגים של HRSV רקומביננטי, בהתאמה לבטא RSV-GFP או RSV-M2-1-GFP. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את התנאים תרביות תאים הנחוצים כדי להציל רקומביננטי וירוסים חדשים, כמו גם הגברה שלהם כדי לקבל מניות ויראלי עם כייל נוגדנים גבוה, מתאים experimentations לשחזור. הבנייה של וקטורים של הגנטיקה הפוכה כשלעצמה לא מתואר כאן. אנו מתארים שיטות קציר אופטימלית, הקפאה של מניות ויראלי. השיטה המדויקת ביותר לכמת נגיפים זיהומיות נשאר פלאק וזמינותו. תאים נגועים דילולים טורי של ההשעיה שנותחה, מודגרות עם כיסוי האוסרת פעפוע של חלקיקים נגיפיים חינם ב- תגובת שיקוע. בתנאים כאלה, רק ידביק הווירוס תאים רציפים ויוצרים "שלט" עבור כל חלקיק זיהומיות הראשונית. ב RSV טיטור וזמינותו קונבנציונאלי, שלטי התגלה על ידי immunostaining, ספרתי בהסתכלות מיקרוסקופית. שיטה זו היא יקרים ולגזול. כאן אנחנו תיאר פרוטוקול פשוט מאוד עבור assay רובד RSV באמצעות כיסוי שעוות תאית המאפשרת היווצרות הפלאק גלוי לעין בלתי מזוינת. אנחנו מראים כיצד ניתן להשתמש RSV-GFP כדי למדוד RSV שכפול וכדי, לפיכך, לכמת את ההשפעה בשווי. שילוב של גנטיקה הפוכה וטכנולוגיה הדמיה בשידור חי, נדגים כיצד RSV-M2-1-GFP מאפשרות למדענים להמחיש M2-1 בתאים חיים, לעקוב אחר הדינמיקה של מבנים תאיים ויראלי, כגון תסמונת המעי הרגיז.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנה גשמי

  1. רכישת מדיה תא (מופחת סרום מדיה, מדיה חיוני מינימלי [מ], 10 x MEM ולאחר Dulbecco המתואמת של בינוני הנשר [DMEM]), ריאגנט תרביות תאים, שעוות תאית (ראה טבלה של חומרים).
  2. להשיג את הווקטורים הבאים עבור גנטיקה הפוכה: vector(s) גנומית של ווקטורים ביטוי קידוד החלבון N ו החלבונים מורכבים פולימראז. הווקטורים גנומית מכילה הגנום המלא cDNA של RSV-GFP (p-RSV-GFP) ושל RSV-M2-1GFP (p-RSV-M2-1GFP) במורד הזרם של האמרגן bacteriophage T7 RNA פולימראז (פול פוט T7). הווקטורים ביטוי (כמנהל p-N, p -P, p-L, ו p-M2-1) מכילים את קידוד רצף N, P, L או M2-1 במורד הזרם של פול פוט T7 (ראה Rincheval et al.12 ו- Rameix-Welti et al.21 לפרטים לגבי המבנה פלסמיד).
  3. להכין מדיה עבור תרבות תא בסביבה סטרילית תרביות תאים, זיהום. שימוש DMEM עם 2 מ מגלוטמין שיושלם עם 10% עגל עוברית סרום (FCS), 1,000 יחידות/mL פניצילין סטרפטומיצין 1 מ"ג/מ"ל (או בלי אנטיביוטיקה), הגברת עם 2 מ מגלוטמין בתוספת 0%, 2% או 10% FCS 1,000 יחידות/mL פניצילין, 1 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין, כמנהל "בינוני מלא" בפרוטוקול הבא.
  4. להשיג BSRT7/522 תאים ולעשות מניות במדיום מלאה בתוספת 10% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) ב 1-2 x 106 תאים/מ ל.... חסוך את מניות תא חנקן נוזלי. להשיג HEp-2 תאים. התרבות התאים BSRT7/5 ב DMEM מלאה, HEp-2 תאים MEM מלאה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 בסביבה סטרילית.
  5. הכינו 10 x RSV שימור פתרון (0.5 M HEPES ו- 1 מ' MgSO4 [pH 7.5] במים) בסביבה סטרילית.
  6. להשיג במיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוכה תואם עם מדידות קרינה פלואורסצנטית GFP ותואמת הדמיה לחיות אם זה הכרחי כדי לפקח על זיהום. להשיג קורא microplate תואם GFP מדידות קרינה פלואורסצנטית עבור כימות של שכפול RSV-GFP.

2. הצלה ומעבר הראשון של וירוס רקומביננטי

הערה: בצע את כל השלבים הבאים בסביבה סטרילית, באמצעות מחלקה II בטיחות ארון.

  1. יום לפני תרביות תאים, הופך השעיה של הקו תא BSRT7/5-5 x 105 תאים למ"ל במדיום מלאה. להפיץ 2 מ"ל של השעיה תא לכל טוב בצלחת 6-. טוב. היכונו שליטה שלילי באר אחת לכל וירוס שהולך להינצל וכל אחד נוסף. דגירה לצלחת-CO 37 ° C ו-5%2. בדוק כי התאים נמצאים ב- 80% – 90% זרימה למחרת.
  2. להפשיר את הגנטיקה הפוכה וקטורים (מתוך שלב 1.2) p-RSV-GFP ו- p-RSV-M2-1-GFP, כמו גם p-N, p -P, p-L, ו p-M2-1. מיקס, עבור כל וירוס להציל, µg 1 של p-N ו- p -P, 0.5 µg של p-L, µg 0.25 של p-M2-1 ו- 1.25 µg של p-RSV (GFP או GFP M2-1) בצינור.
    הערה: ניתן להשתמש בביטוי שונה וקטורים עבור N, P, L ו M2-1; עם זאת, היחס בין החלבונים חייב להישמר. לבצע את הפקד שלילי על-ידי החלפת וקטור p-RSV וקטור ריק.
  3. להמשיך תרביות תאים, ע פ הפרוטוקול של היצרן ריאגנט תרביות תאים (ראה טבלה של חומרים).
    1. להוסיף 250 µL של מדיום מופחת סרום הווקטורים מעורבת. צינור אחר, לדלל µL 10 מהתרכובת תרביות תאים ב- 250 µL של מדיום מופחת סרום. בעדינות מערבולת שני צינורות, לחכות 5 דק לערבב תוכנן של שתי מנורות ולחכות 20 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. לשטוף את התאים BSRT7/5 עם 1 מ"ל של מדיום מופחת סרום ולהפיץ 1.5 מ של הגברת עם 10% FCS ללא אנטיביוטיקה לכל טוב. במידת הצורך, דגירה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 עד הדגירה שמתואר בשלב 2.3.1 הושלמה.
    3. להוסיף 500 µL של המיקס תרביות תאים מוכן בשלב 2.3.1 לבאר, זמן הדגירה 20 דקות הסתיימה. המקום התאים בחממה ב- 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2 3 ימים. אל תשנה את המדיום התרבות של התאים במהלך תרביות תאים.
  4. להתבונן GFP קרינה פלואורסצנטית (עירור-488 ננומטר), פליטת-515-535 nm תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוכה בהגדלה x 20 1 x ליום כדי לנטר את יעילות הצלה, באמצעות ה-GFP לסנן.
  5. ביום השני לאחר תרביות תאים, זרע את התאים למעבר הראשון של וירוסים שניצלו. להכין השעיה של תאים HEp-2-5 x 105 תאים למ"ל במדיום מלאה. להפיץ 2 מ"ל של השעיה תא לכל טוב בצלחת. ובכן 6 (באר אחת לכל וירוס הצלה ושליטה שלילי אחד).
  6. ביום השלישי של תרביות תאים, התאים מאפס בכל טוב של הלוח transfected 6-טוב BSRT7/5, משתמש במגרדת שונה של כל טוב. להעביר כל תוכן טוב (התאים ואת תגובת שיקוע) לתוך צינור microcentrifuge mL 2 סטרילי. מערבולת כל צינור נמרצות במשך לפחות 30 s כדי לשחרר את הוירוס שניצלו מן לקרום התא.
    הערה: זה מקביל מעבר 0 (P0) של הנגיף שניצלו (איור 1).
  7. השתמש המתלה P0 ויראלי טריים כדי לבצע הגברה הראשון של וירוסים שניצלו.
    1. הסר המדיום תרבות מהצלחת HEp-2 6-ובכן נזרע יום קודם (ראה שלב 2.5) במהירות להוסיף 500 µL של ההשעיה P0 (מתוך שלב 2.6) לכל טוב. מקם את הצלחת HEp-2 ב- 37 מעלות צלזיוס על כיסא נדנדה נדנדה על עצבנות רכה כבר שעתיים.
    2. להסיר, למחוק את µL 500 של inoculum ולהוסיף 2 מ של הגברת עם 2% FCS. תקופת דגירה לצלחת-CO 37 ° C ו-5%2 של 3 ימים. זה יהיה לייצר את המעבר הראשון (P1) של וירוסים שניצלו (איור 1).
  8. להוסיף 1/10 של אמצעי האחסון של 10 x RSV שימור פתרון (0.5 M HEPES ו- 1 מ' MgSO4 [pH 7.5]) לתוך ההשעיה P0 הנותרים (מתוך שלב 2.6). מערבולת microtubes נמרצות במשך 5 s ו aliquot התוכן קריוגני צינורות בתווית עם התגים עמידים לאלכוהול. לטבול את הצינורות עבור פחות שעה באלכוהול precooled ב-80 מעלות צלזיוס, ואחסן אותם ב- 80 ° c
  9. Titrate את המניה P0 (ראה שלב 2.6) של כל וירוס שניצלו (ראו סעיף 4 עבור טיטור שעוות תאית).
  10. להתבונן GFP קרינה פלואורסצנטית (עירור-488 ננומטר), פליטת-515-535 nm של התאים HEp-2 נגוע ההשעיה P0 תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוכה בהגדלה x 20 x 1 ליום כדי לנטר את הזיהום. להתבונן במיקרוסקופ brightfield את המראה של syncytia קטן וסלולרי ניתוק אשר משקף את האפקט cytopathogenic RSV (CPE) (ראה איור 2).
  11. שימו לב כי החילוץ נכשלה אם לא זריחה ולא CPE גלוי לאחר 2-3 ימים.
  12. לאסוף את המעבר הראשון (P1) ביום 3 או 4 כפי שמתואר בשלב 2.6. בקצרה, לגרד את התאים, לאסוף את התאים ואת תגובת שיקוע ביחד, מערבולת אותם, להוסיף את הפתרון שימור כפי שמתואר בשלב 2.8, aliquot את הדגימה, ומקפיאים.
  13. Titrate (ראה סעיף 4 עבור טיטור וזמינותו) ומגבירים את המעבר הראשון (ראו סעיף 3 עבור ההגברה).

3. הגברה של וירוסים שהוצלה

הערה: הפרוטוקול הבא מתאר ההגברה של וירוסים שניצלו בבקבוקון2 75 ס מ. להתאים את גודל הבקבוק לאמצעי האחסון הדרוש ואת הריבוי הנדרש של זיהום (MOI). טבלה 1 מציין אמצעי אחסון עבור מבחנות שונות. בצע את כל השלבים הבאים בסביבה סטרילית בכיתה II בטיחות הקבינט.

  1. להכין השעיה של תאים HEp-2-5 x 105 תאים למ"ל בינוני מלא, ביום שלפני ההגברה. להפיץ 15 מ"ל של התליה תא לכל 75 ס מ2 הבקבוק, דגירה המבחנות-CO 37 ° C ו-5%2. להכין בקבוק אחד לכל וירוס כדי להגביר.
  2. יום אחרי תחילת הדגירה, בדוק כי התאים נמצאים confluent 80%-100%.
  3. לדלל ההשעיה ויראלי מהשלב 2.12 ב MEM ללא FCS לקבל השעיה 3 מ ל- 50,000 PFU/mL (המקביל MOI של 0.01 תא PFU).
  4. להסיר את המדיום ולהוסיף במהירות את המתלה ויראלי 3 מ. מקם את הבקבוק ב- 37 מעלות צלזיוס על כיסא נדנדה נדנדה על עצבנות רכה כבר שעתיים.
  5. להסיר, למחוק את inoculum ולהוסיף 15 מ"ל של הגברת עם 2% FCS. דגירה-CO 37 ° C ו-5%2 עבור 2-4 ימים.
  6. בדוק את התא מורפולוגיה ואת GFP קרינה פלואורסצנטית (עירור-488 ננומטר), פליטת-515-535 nm תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוכה בהגדלה x 20 על מנת להעריך את הזמן הנכון לקצור וירוסים. שים לב כי זה בדרך כלל בניתוק 50%-80% של השכבה תא HEp-2 בשל CPE RSV המתרחשת בין 48 ל-72 שעות postinfection (חוקר פרטי) (ראה איור 3).
  7. לגרד את כל התאים באמצעות המגרד של התא. לאסוף את התאים והן את תגובת שיקוע ביחד ומעבירים אותם אל שפופרת צנטרפוגה 50 מ.
  8. הוסף 1/10 נפח של 10 x פתרון שימורית RSV (0.5 M HEPES ו- 1 מ' MgSO4 [pH 7.5]). מערבולת צינורות נמרצות עבור 5 s ולהבהיר התליה על ידי צנטריפוגה 5 דקות ב x 200 גרם.
  9. להעביר את תגובת שיקוע שפופרת 50 מ. מערבולת בקצרה, aliquot התליה קריוגני צינורות בתווית עם התגים עמידים לאלכוהול. לטבול את צינורות אלכוהול precooled-80 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה ואחסן אותם ב- 80 ° c
  10. יפשירו aliquots כדי titrate את המתלים ויראלי (ראו סעיף 4).

4. פלאק טיטור Assay

  1. להתכונן טוב 12 צלחות טיטור יום לפני ביצוע וזמינותו טיטור (שש בארות יידרשו titrate שפופרת אחת של וירוס). זרע הבארות עם 1 מ"ל של תאים HEp-2-5 x 105 תאים למ"ל במדיום מלאה.
  2. למחרת, להכין השעיה סטרילי שעוות תאית (2.4% [w/v] במים) (ראה טבלה של חומרים).
    1. לפזר 2.4 גר' אבקה שעוות תאית ב- 100 מ של מים מזוקקים, שימוש סטנדרטי של פגים, עד פירוק מלא של האבקה (בדרך כלל 4-12 שעות). אוטוקלב ההשעיה ב 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות ואחסן אותו בטמפרטורת החדר לפני השימוש.
      הערה: בתנאים כאלה, המתלה הוא יציב אחריות לשנה.
    2. לאחר פתיחת הפתרון בסביבה סטרילית, לאחסן אותו ב 4 מעלות צלזיוס למשך 6 חודשים. תמיד לערבב את המתלים לפני השימוש (על ידי היד רועדת או vortexing) כדי לוודא שזה הומוגנית.
  3. להכין 2 x MEM בסביבה סטרילית. לדלל מסחרי MEM 10 x עם מים סטריליים ולהוסיף -גלוטמין 1000 יחידות/mL פניצילין, סטרפטומיצין 1 מ"ג/מ"ל. לנער הדילול נמרצות ואחסן אותו ב 4 º C.
    הערה: בצע שלבים 4.4 – 4.10 בסביבה סטרילית באמצעות מחלקה II בטיחות בארון.
  4. להכין 6 צינורות המכיל µL 900 של מאמ ללא FCS לכל וירוס כדי להיות טיטרציה (הצינורות טיטור). להפשיר את aliquots וירוס, מערבולת אותם נמרצות במשך 5 s, ו- µL העברת 100 כדי טיטרציה הראשון צינור.
  5. מבצע לדילול tenfold 6 x, כפי שמוצג להלן. להוסיף 100 μL של וירוס μL 900 של מדיום בצינור הראשון, שים את הכובע על המרקע, לערבב את תוכנו על ידי vortexing למשך כמה שניות. לשנות את הטיפ על פיפטה, להוסיף 100 µL של דילול הראשון µL 900 של מדיום בצינור השני, שים את הכובע על צינור, ו מערבולת. חזור על הפעולות עד ברכבת התחתית השישית.
    הערה: . זה מאוד חשוב לשנות את המידע עבור כל דילול
  6. לכתוב הוירוס דילולים לקפל את ושם על לוחות 12-ובכן HEp-2. הוספת סימן כדי להתאים את הצלחת ולכסות שלה כי הם עשויים להיות מופרדים במהלך צביעת (שלב 4.9). להסיר את המדיום של הלוחות ולהפיץ את µL 400 של דילול אחת לכל טוב. דגירה הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים, על וירוס ספיחה.
    הערה: לשנות את הטיפ פיפטה בין כל inoculum או להמשיך הריכוז הגבוה ביותר עם קצה אותו מן הנמוך ביותר. לחסן סדרה מוגבלת של צלחות (1-2) בו זמנית כדי למנוע את התאים ייבוש.
  7. להכין את הכיסוי שעוות תאית במהלך ספיחה וירוס (המאולתרת ההכנה). כדי להשיג 100 מ של שכבת-העל, מערבבים 10 מ"ל של 2.4% שעוות תאית השעיה, 10 מ של 2 x MEM ולאחר 80 מ של הגברת עם 2% FCS.
    1. להתאים את ה-pH של 2 x MEM כדי סביב 7.2 עם פתרון סטרילי סודיום ביקרבונט ב- 7.5%, בעקבות מחוון צבע. הוסף את הבולם שעוות תאית, את הגברת, מערבבים היטב.
  8. בסוף הדגירה 2 h, להוסיף 2-3 מ"ל של שכבת-על כל טוב של הלוחות 12-ובכן מבלי להסיר את inoculum. להיות זהירים כדי למנוע הזיהום של הבארות הסמוכים עם כייל נוגדנים גבוה נגיפי inoculums. תקופת דגירה לצלחת-CO 37 ° C ו-5%2 של 6 ימים. אל תזיז את הצלחת ואל תזוז החממה בתקופת הדגירה.
  9. המשך מכתים את התאים, באמצעות הפתרון קריסטל ויולט (8% קריסטל ויולט [וי/v], 2% פורמלדהיד [וי/v] ו 20% אתנול [וי/v] במים).
    1. להגן על משטח העבודה של אבטחה ארון עם סדין (הסגול קריסטל חריפה צובע משטחים).
    2. לנער בעדינות את הצלחות להוריד את הכיסוי שעוות תאית. להסיר את supernatants. ולשטוף את התאים 2 x 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS). להתמודד עם הצלחות אחת כדי למנוע את התאים ייבוש. להוסיף 1-2 מ"ל של הפתרון קריסטל ויולט ולא לחכות 10-15 דקות להסיר הפתרון, אשר ניתן להשתמש בהם עבור צביעת צלחת עוקבות.
    3. לטבול את לוחות ומכסים ב אקונומיקה טריים למשך כמה שניות, לאחר מכן, לשטוף אותם ביסודיות עם מים מהברז. שימו לב כי והלחצנים ושוקמו על ידי המלבין.
    4. לשים את לוחות ומכסים על מגבות נייר ולתת להן להתייבש. יבש את הצלחות בטמפרטורת החדר לאחר שטיפה במים ולאחסן אותם בטמפרטורת החדר. עבור תקופות אחסון זמן (חודשים), להעסיק את הצלחות מוגן מפני אור כדי להגן על הצבע. שים לב כי אם התאים מאבדים את הגיוון שלהם, הם יכולים להיות מוכתם שוב קריסטל ויולט.
  10. חישוב titers וירוס. לספור את לוחות הבארות של הצלחות יבש, אשר נראים לעין בלתי מזוינת. בדוק מספר לוחות של דילולים שונים קוהרנטי (פקטור 10 בין כל דילול). בחר את הבאר שבו הלוחיות הן הקלות ביותר כדי לספור. להעריך את מספר לוחות נגד האחסון inoculum הדילול.
    הערה: על הדוגמה סיפק באיור4, שלטי 21 נספרים ב 10-5 הדילול. אלה תואמות כייל של
    figure-protocol-1
    figure-protocol-2

5. השימוש של וירוס רקומביננטי HRSV-GFP כדי לפקח על שכפול ויראלי תאים שטופלו RNA מפריעות קטן או עלולות

הערה: בצע שלבים כל פרט 5.1 ו- 5.2.5 בסביבה סטרילית באמצעות מחלקה II בטיחות בארון.

  1. ניטור השפעת הסלולר ג'ין להשתיק על כפל RSV
    שים לב: פרוטוקול תרביות תאים תלויה הכימית (ראה טבלה של חומרים).
    1. להכין צלחות 96-ובכן המדידה GFP. יומיים לפני וזמינותו, עבור בהתחשב RNA קטנים מפריעות (siRNA), להכין פתרון של מדיה מופחת סרום המכיל siRNA-ריכוז של 100 ננומטר, ריאגנט תרביות תאים של siRNA מדולל ב 1/500. דגירה הפתרון למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. להוסיף 25 µL של הפתרון הבארות של צלחת המבושלות 5.1.1 (בטריפליכאט). זרע הבארות עם 75 µL של השעיה של תאים A549-עונה 4 פרק 105 תאים למ"ל במדיום מלאה ללא אנטיביוטיקה בריכוז תא הסופי של 3 x 105 תאים/מ ל.... דגירה את הצלחת. בשביל h 48-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
      הערה: ריכוז siRNA הסופי הוא 25 ננומטר, האחסון ריאגנט תקנים הסופי הוא µL 0.5/טוב).
    3. להדביק את התאים כדלקמן. הסר את המדיום הבארות. להוסיף 100 µL של השעיה RSV-GFP-PFU 50,000/mL, תקופת דגירה של 2 h-CO 37 ° C ו-5%2. להסיר את המתלים ויראלי ולהוסיף 100 µL של DMEM עם 2% FCS ובלי פנול אדום. דגירה לצלחת-CO 37 ° C ו-5%2.
    4. ב 24 שעות ו 48 שעות עבודות שירות, למדוד את פלורסצנטיות, באמצעות מצלמות-דיגיטליות לקבוע עירור, פליטה אורכי גל nm 488 ו 520, בהתאמה (קרינה פלואורסצנטית מבוטא ביחידות פלורסצנטיות יחסית). להשתמש noninfected A549 תאים תקנים עבור רמות קרינה פלואורסצנטית ורקע.
      הערה: התאים צריך להיות קבוע עם 4% paraformaldehyde (PFA) לפני מדידתם ללא המכסה את הצלחת.
  2. הערכה של עיכוב סמים באמצעות ה-RSV-GFP
    1. להכין צלחות 96-ובכן המדידה GFP. יום לפני וזמינותו, זרע הבארות עם 100 µL של השעיה של תאים HEp-2-5 x 105 תאים למ"ל במדיום מלאה ללא פנול אדום.
    2. להכין לדילול טורי נבדק עם MEM השלים עם 2% FCS אנטיביוטיקה (50 µL לכל טוב) סמים (AZ4316 בדוגמה זו). להכין השעיה ויראלי-10,000 PFU/מ ל מם ללא גורם לכלי הדם סטרומה (SVF) וללא פנול אדום (50 µL לכל טוב).
    3. להסיר את המדיום 96-ובכן HEp-2 צלחת ולהוסיף 50 µL של ההשעיה סמים µL 50 של ההשעיה ויראלי (בטריפליכאט). לבצע זיהום מעושה במקביל כפקד.
      הערה: התרופה לדילול ומתלים ויראלי עשוי להיות מעורב לפני הוספתן על התאים, או ניתן להוסיף ברצף.
    4. דגירה את הצלחת. בשביל h 48-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
    5. למדוד את פלורסצנטיות, באמצעות מצלמות-דיגיטליות כפי שמתואר בשלב 5.1.4. להשתמש תאים הנגועים ואימץ HEp-2 תקנים עבור רמות רקע זריחה.

6. אפיון לוקליזציה M2-1 In Vivo עם וירוס רקומביננטי RSV-M2-1-GFP

הערה: בצע שלבים 6.1 ו- 6.2 בסביבה סטרילית, באמצעות מחלקה II בטיחות בארון.

  1. להכין השעיה של תאים HEp-2-5 x 105 תאים למ"ל במדיום מלאה. זרע 1.5 מ של התליה תא ב- 35 מ מ פטרי permeant CO2 ומותאמים עבור חיים הדמיה.
  2. לבצע את הזיהום יום לאחר זריעה עם וירוס RSV-M2-1-GFP-MOI 1, כמתואר בצעדים 3.3 – 3.5 (להסיר המדיום, להוסיף 500 µL מ של inoculum, ואת דגירה המדגם ב 37 מעלות צלזיוס תוך מנענע בעדינות על 2 h; להסיר את inoculum ולהוסיף 1.5 מ של הגברת עם 2 % FCS). תקופת דגירה התאים-CO 37 ° C ו-5%2 של הזמן המבוקש (IBs יתחילו להופיע מ 10 h חוקר פרטי).
  3. מחממים התא דגירה של מיקרוסקופ הפוכה מצויד 40 x 100 x מטרות ב 37 מעלות צלזיוס, לפני הצבת את צלחת פטרי המכילות את התאים הנגועים על הבמה. פתח את אספקת2 CO ולחכות מוקד מייצב.
  4. לבצע הדמיה עם מסננים תואמי ה-GFP, תחת עירור נמוך העוצמה ותמונה תדר (מ 1 עד התמונה 0.1 כל דקות) כדי למזער את phototoxicity.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעבודה זו, אנו המתואר פרוטוקול מפורט כדי לייצר וירוסים RSV רקומביננטי ביטוי חלבון פלואורסצנטי (איור 2). ב- pRSV-GFP, גן ה-GFP הוצג בין הגנים P ו- M, כמתואר עבור הגן שרי העבודה שפורסמו בעבר21. PRSV-M2-1-GFP, הגן M2 והמבריא שהוגש, קידוד גנטי נוסף M2-1-GFP הוכנס בין הגנים של SH ו- G-12. השלב הראשון, המתאים להצלה של הוירוס בתאים BSRT7/5, מוצג באיור 2A. בקבוצות קטנות של תאים ניאון ירוק ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים שיטת החילוץ של רקומביננטי RSVs מ 5 פלסמידים, הגברה שלהם. היכולת לתמרן את הגנום של וירוסים יש מהפכה וירולוגיה המחקר לבדוק מוטציות, מבטאים גנים נוספים או חלבון נגיפי מתויגות. RSV יש תיאר ואנו לשמש דוגמא במאמר זה הוא וירוס לבטא גן כתב את RSV-GFP (לא פורסם), מבטא החלבון M2-1 דבוקה תג ה-GFP12. חילוץ RSV הוא מאתגר ודורש תרגול. היעילות תרביות תאים הוא קריטי, בהתאם בחירה נבונה של תרביות תאים הכימית ואופטימיזציה מוקדמת של פרוטוקול תרביות תאים. השימוש של תאים המבטאים את pol T7 bacteriophage ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים ד ר צ'ין יו של חברת AstraZeneca R & D בוסטון, מסצ'וסטס, ארה ב, על מתן התרופה AZD4316. המחברים מודים פלטפורמת Cymages לגישה אל המיקרוסקופ ScanR האולימפוס, אשר נתמכה על ידי מעניק מאזור ile-de-(בריאות אחד עמום). המחברים להכיר תמיכה את INSERM ואוניברסיטת סן ורסאי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
35 מ"מ ומיקרו; צלחת להדמיית תאים חייםIbidi81156
A549ATCCATCC CCL-185
Avicel RC-591FMC BioPolymerAvicel RC-591מידע טכני ואחר על Avicels זמין בכתובת http://www.fmcbiopolymer.com. יש לאחסן בטמפרטורת החדר. הפרוטוקול בשלב 4 מותאם למגיב זה.
BSRT7/5אינו זמין מסחריתראה הפניה 22. Buchholz et al. 1999
תמיסת קריסטל סגולסיגמאHT90132
מיקרוסקופ פלואורסצנטי לתצפיותאולימפוסIX73 מיקרוסקופ
אולימפוס מיקרוסקופ פלואורסצנטי למיקרוסקופ וידאואולימפוסScanR מיקרוסקופ
HEp-2ATCCATCC CCL-23
HEPES ≥ 99.5%סיגמאH3375
L-גלוטמין (200 מ"מ)ThermoFisher Scientific25030024
LIPOFECTAMINE 2000 REAGENTThermoFisher Scientific11668019בשלב 2.3. מותאם למגיב זה.
MEM (10x), ללא גלוטמיןThermoFisher Scientific11430030
MEM, תוסף GlutaMAXThermoFisher Scientific41090-028
MgSO4 ReagentPlus, ≥ 99.5%SigmaM7506
Opti-MEM I סרום מופחת בינוניThermoFisher Scientific51985-026
תמיסה מימית Paraformaldehyde, 32%, EMGrade Electron Microscopy Sciences15714
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL)ThermoFisher Scientific15140122
פלסמידיםאינם זמיניםראה הפניה 21. Rameix-Welti et al. 2014
ראה Saw RockerVWR444-0341
Si RNA GAPDHDharmaconON-TARGETplus siRNA
D-001810-10-05		SMARTpool ו-3 מתוך 4 siRNAs בודדים שתוכננו על ידי Dharmacon.
Si RNA IMPDH2DharmaconON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human
L-004330-00-0005		SMARTpool של 4 siRNAs בודדים שתוכננו על ידי Dharmacon.
הפניות ורצפים בודדים
J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA;
J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC;
J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU;
J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCUCGAUG;
Si RNA RSV NDharmaconON-TARGETplus siRNA מותאם אישיתUUCAGAAGAACUAGAGGCUAU ו-UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA
SiRNA NTDharmaconON-TARGETplus מאגר
SiRNA מגיב טרנספקציהDharmaFECT1 Ref: פרוטוקול T-2001-03בשלבים 5.1.ו-5.1.2 מותאמים למגיב זה.
נתרן ביקרבונט 7.5% תמיסהThermoFisher Scientific25080094
ספקטרופלואורומטרTecan Tecanאינסוף M200PRO
אולימפוס פרוטוקול מסחרית לא ממוקד

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. The Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
  2. Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E. Respiratory Syncytial Virus Infection in Elderly and High-Risk Adults. The New England Journal of Medicine. 352 (17), 1749-1759 (2005).
  3. DeVincenzo, J. P., et al. Activity of Oral ALS-008176 in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study. The New England Journal of Medicine. 373 (21), 2048-2058 (2015).
  4. DeVincenzo, J. P., et al. Oral GS-5806 Activity in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study. The New England Journal of Medicine. 371 (8), 711-722 (2014).
  5. Afonso, C. L., et al. Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2016. Archives of Virology. 161 (8), 2351-2360 (2016).
  6. Collins, P. L., Hill, M. G., Cristina, J., Grosfeld, H. Transcription elongation factor of respiratory syncytial virus, a nonsegmented negative-strand RNA virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (1), 81-85 (1996).
  7. Hoenen, T., et al. Inclusion bodies are a site of ebolavirus replication. Journal of Virology. 86 (21), 11779-11788 (2012).
  8. Heinrich, B. S., Cureton, D. K., Rahmeh, A. A., Whelan, S. P. Protein expression redirects vesicular stomatitis virus RNA synthesis to cytoplasmic inclusions. PLoS Pathogens. 6 (6), e1000958(2010).
  9. Lahaye, X., et al. Functional Characterization of Negri Bodies (NBs) in Rabies Virus-Infected Cells: Evidence that NBs Are Sites of Viral Transcription and Replication. Journal of Virology. 83 (16), 7948-7958 (2009).
  10. Kolesnikova, L., Mühlberger, E., Ryabchikova, E., Becker, S. Ultrastructural organization of recombinant Marburg virus nucleoprotein: comparison with Marburg virus inclusions. Journal of Virology. 74 (8), 3899-3904 (2000).
  11. Dolnik, O., Stevermann, L., Kolesnikova, L., Becker, S. Marburg virus inclusions: A virus-induced microcompartment and interface to multivesicular bodies and the late endosomal compartment. European Journal of Cell Biology. 94 (7-9), 323-331 (2015).
  12. Rincheval, V., et al. Functional organization of cytoplasmic inclusion bodies in cells infected by respiratory syncytial virus. Nature Communications. 8 (1), 563(2017).
  13. Santangelo, P. J., Bao, G. Dynamics of filamentous viral RNPs prior to egress. Nucleic Acids Research. 35 (11), 3602-3611 (2007).
  14. Lifland, A. W., et al. Human Respiratory Syncytial Virus Nucleoprotein and Inclusion Bodies Antagonize the Innate Immune Response Mediated by MDA5 and MAVS. Journal of Virology. 86 (15), 8245-8258 (2012).
  15. Garcia, J., Garcia-Barreno, B., Vivo, A., Melero, J. A. Cytoplasmic inclusions of respiratory syncytial virus-infected cells: formation of inclusion bodies in transfected cells that coexpress the nucleoprotein, the phosphoprotein, and the 22K protein. Virology. 195 (1), 243-247 (1993).
  16. Brown, G., et al. Evidence for an association between heat shock protein 70 and the respiratory syncytial virus polymerase complex within lipid-raft membranes during virus infection. Virology. 338 (1), 69-80 (2005).
  17. Radhakrishnan, A., et al. Protein analysis of purified respiratory syncytial virus particles reveals an important role for heat shock protein 90 in virus particle assembly. Molecular & Cellular Proteomics. 9 (9), 1829-1848 (2010).
  18. Racaniello, V. R., Baltimore, D. Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in mammalian cells. Science. 214 (4523), 916-919 (1981).
  19. Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. Infectious rabies viruses from cloned cDNA. The EMBO Journal. 13 (18), 4195-4203 (1994).
  20. Collins, P. L., et al. Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms an essential role for the transcription elongation factor from the 5' proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (25), 11563-11567 (1995).
  21. Rameix-Welti, M. -A., et al. Visualizing the replication of respiratory syncytial virus in cells and in living mice. Nature Communications. 5, 5104(2014).
  22. Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. Journal of Virology. 73 (1), 251-259 (1999).
  23. Cianci, C., Meanwell, N., Krystal, M. Antiviral activity and molecular mechanism of an orally active respiratory syncytial virus fusion inhibitor. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 55 (3), 289-292 (2005).
  24. Derscheid, R. J., et al. Human respiratory syncytial virus memphis 37 grown in HEp-2 cells causes more severe disease in lambs than virus grown in vero cells. Viruses. 5 (11), 2881-2897 (2013).
  25. McKimm-Breschkin, J. L. A simplified plaque assay for respiratory syncytial virus - direct visualization of plaques without immunostaining. Journal of Virological Methods. 120, 113-117 (2004).
  26. Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virology Journal. 7, 1-7 (2006).
  27. Novina, C. D., Sharp, P. A. The RNAi revolution. Nature. 430 (6996), 161-164 (2004).
  28. Sintchak, M. D., Nimmesgern, E. The structure of inosine 5'-monophosphate dehydrogenase and the design of novel inhibitors. Immunopharmacology. 47 (2-3), 163-184 (2000).
  29. Beaucourt, S., Vignuzzi, M. Ribavirin: A drug active against many viruses with multiple effects on virus replication and propagation. Molecular basis of ribavirin resistance. Current Opinion in Virology. 8, 10-15 (2014).
  30. Hruska, J. F., Bernstein, J. M., Douglas, R. G., Hall, C. B. Effects of Ribavirin on Respiratory Syncytial Virus in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 17 (5), 770-775 (1980).
  31. Simões, E. A. F., et al. Past, Present and Future Approaches to the Prevention and Treatment of Respiratory Syncytial Virus Infection in Children. Infectious Diseases and Therapy. 7 (1), 87-120 (2018).
  32. Alvarez, R., et al. RNA interference-mediated silencing of the respiratory syncytial virus nucleocapsid defines a potent antiviral strategy. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3952-3962 (2009).
  33. DeVincenzo, J., et al. A randomized, double-blind, placebo-comtrolled study of an RNAi-based therapy directed against respiratory syncytial virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8800-8805 (2010).
  34. Zhou, Y., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).
  35. Nikolic, J., et al. Negri bodies are viral factories with properties of liquid organelles. Nature Communications. 8 (1), 58(2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RSVBSR T7 5HEp 2GFP

מאמרים קשורים