מאמר שיטה

השתלת השתלות מהונדסים של הנדסה עצבית בVivo לימודי נוירוארכיטקטורה

5.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59242

⸱

11 במאי 2019

 ,  , 
1Laboratory of Cerebral Cortex Development, SISSA

במאמר זה

סיכום

בהתבסס על הנדסת חוץ גופית ויראלי של מראש עצבי, שיתוף ההשתלה שלהם למוח פראי סוג ולזווג הערכה מורמטרית של "מבחן" ו "שליטה" נגזרים, שיטה זו מאפשרת דוגמנות מדויקת של בקרת vivo gene של הנאוקורטילית עצב מורפולוגיה בדרך פשוטה ובמחיר סביר.

תקציר

השליטה הגנטית באדריכלות העצבית. היא הנושא של חקירה אינטנסיבית מתוארים כאן היא שיטה פשוטה שפותחה ללמוד בקרת גנים vivo של מורפולוגיה הקרנה הניאו קליפת המוח. שיטה זו מבוססת על (1) בהנדסה מחוץ לתחום ויראלי של הנדסה עצבית מסוג "מבחן" ו-"שליטה" תאים, (2) שיתוף הפעולה שלהם למוח פראי, ו (3) לזווג הערכה מורמטרית של נגזרות עצבי שלהם. באופן ספציפי, E 12.5 מסמני מקדים מתורמים בעלי התווית גנטית, מעובדים בעלי התוויות, מועסקים למטרה זו. הם מתוכננים כדי לנצל את היזמים שנבחרו, tetON/OFF הטכנולוגיה, והם בחינם יד מושתלים לתוך החדרים לרוחב הלובין. מאוחר יותר, על הפרופילים של המוח המושתלים של מוחות הנמען, צלליות של נוירונים מושתלים מוזנים לתוך התוכנה הקוד הפתוח עצבי, הפרמטרים שלהם מורמטרים מופקים, ואת האורך הממוצע מדד הסתעפות מחושבים. בהשוואה לשיטות אחרות, אחד זה מציע שלושה יתרונות עיקריים: הוא מתיר השגת שליטה עדינה של ביטוי טרנזגני במחיר סביר, זה רק דורש כישורי ניתוח בסיסיים, והוא מספק תוצאות אמינות סטטיסטית על ניתוח מוגבל ספר בעלי חיים. בגלל העיצוב שלה, עם זאת, זה לא מספיק כדי לטפל שאינו השליטה האוטונומית התא של נוירוארכיטקטורה. כמו-כן, רצוי להשתמש בה כדי לחקור שליטה neurite ורפולוגיה לאחר השלמת הגירה עצבית. בניסוח הנוכחי שלה, שיטה זו מכוונת להפליא כדי לחקור בקרת גנים של האדריכלות נוירונים glutamatergic neoקורטיקלית. ניצול של קווים טרנסגניים המבטא EGFP בסוגים אחרים של תאים עצביים ספציפיים, זה יכול להיות מחדש תכליתי כדי לטפל בקרת גנים של הארכיטקטורה שלהם.

מבוא

כאן אנו מתארים שיטה פשוטה שפיתחנו לנתח בקרת גנים vivo של אדריכלות עצבית. מבוסס על הנדסת חוץ גופית של מקדים עצביים, ההשתלה שלהם לתוך המוח הבין לבין הערכה מוגרמטרית של "מבחן" ו "שליטה" תאים, זה מאפשר לחשוף את ההשלכות תפקודית של גנים מבחן בשליטה עדינה של מורפולוגיה עצבית ב דרך מהירה ומשתלמת. כדי לחקור בקרת גנים vivo של אדריכלות עצבית, שלושה נושאים טכניים מרכזיים חייב להיות ממוען: (1) השגת ביטוי גן התעניינות מספקת (הגוי) ושליטה כמותית מדויקת של אותו; (2) קבלת הדמיה מקוטעת כראוי של צלליות נוירואליות נפרדות; (3) מעורר משמעות סטטיסטית של תוצאות תוך העסקת מספר מוגבל של בעלי חיים.

כאשר זמין, העכבר מוטציה קווים מחסה טטרציקלין (ט) מבוקרת transgenes עשוי להיות הכלי הטוב ביותר כדי לטפל בגיליון הראשון1. לחילופין, הטרנסגנזה הסומטית עשויה להיות מועסק. במקרים כאלה, הטרנסגנטית מועברת באמצעות אלקטרופורציה2 או התמרה נגיפית3. לאחר מכן, הוא נשמר כאפיכמה (למשל, על-ידי אלקטרופורציה סטנדרטית4), או שהוא משולב לתוך הגנום (באופן אקראי, באמצעות שילובים retroviral יעיל5; או במיקום מוגדר, באמצעות crispr-קידם הומולוציה שילוב מחדש (slendr)6 ).

שנית, צללית עצבית הדמיה עשוי להיות מושגת באמצעות (a) מדים דלילים תיוג או (ב) צפוף תיוג דיפרנציאלי. באשר לתיוג דליל, מתודולוגיות מתקדמות כמו Golgi עשוי להיות מועסק7, מיניסטים עצביים שנבחרו ניתן למלא על ידי biocytin8, ותיוג מלח ופלפל ניתן להשיג תודות לגנים מבוטא בדלילות. כזה יכול להציג שעתוק מגוון (שלך-EGFP)9 או יכול להיות מופעל על ידי שילוב סטוכסטי (morf)10. באשר (ב), המדינה של אסטרטגיות האמנות כוללים מתווך של היצור-תיווך סטוכסטי שילוב של בתוך מערך מרובה פלואופאנפרוטאין transopחלבון (במוח)11, כמו גם שילוב של מונחה גנומה-טרנספססאוסה של גנים fluoroprotein, בעבר נמסר באמצעות טרנסגנזה סומטית (שיבוט)12.

באשר לסוגיה השלישית, התוצאה המורמטרית מושפעת לעתים קרובות על ידי שינויים אקראיים גדולים, שמקורם הבדלים בין בעלי חיים ואפשרויות הזרקת תאים. בגלל זה, מספר גדול של בעלי חיים מועסק בדרך כלל כדי להשיג את הכוח הסטטיסטי הדרוש כדי להעריך את הפעילות הטובה ביותר של מורמטרי.

הגישות שתוארו לעיל מסתמכות לעתים קרובות על מיומנויות טכניות מתקדמות ודורשות משאבים פיננסיים בולט, אשר עשויים להגביל את הדיפוזיה שלהם בתוך הקהילה המדעית. כדי לעקוף בעיות אלה, הצלחנו צינור קל ופשוט לנתח את השליטה גנים של נוירוארכיטקטורה ב vivo בדרך מהירה ובמחיר נוח. זה מעורר השראה על ידי עיצוב דומה שיתוף השתלת בעבר שפותחה במהירות vivo הערכה של פעילות antiblastic transgene13.

באופן ספציפי, הוא חשב כי השתלת המשותף של הנדסה חוץ גופית "ירוק" מקדים עצביים ("מבחן" ו "שליטה" תאים) לתוך המוח התינוק "שחור" התינוק יכול במקביל לתקן את שלושת הנושאים המרכזיים המפורטים לעיל. למעשה, בהנדסה מחוץ לתחום ויראלי של סמנים מוקדמים, בתנאים מבוקרים היטב, מאפשר תחזוקה של השתנות הביטוי העצבי-מגנטי במינימום, הרחק מתחת כי בדרך כלל הקשורים במניפולציות vivo סומטיים (שבוצעה בעבר מיכל בן 14 , 15 ובתוצאות שלא פורסמו. השליטה המדויקת המתקבלת על ביטוי הגנים דומה לזו שהושגה במודלים טרנסגניים מבוקרים. עם זאת, עלויות של הליך זה הן הרבה מתחת לאלה שמקורן בתחזוקת קו העכבר הטרנסגניים. לאחר מכן, הזרקת התא החופשי היא קלה ודורשת הכשרה מינימלית. כמו-כן, ניתן לכוונן בקלות את כמות הסמנים המושתלים המוזרקים לתוך כל מוח כדי להשיג מספר מצטבר מספיק של מקדם-סמנים בדלילות, תוך שמירה על המספר הכולל של חיות משושתלים במינימום. אחרון חביב, שיתוף הזרקה של fluoro שונים מתויג, "מבחן" ו-"שליטה" מראש סמנים וניתוח סטטיסטי הבאים של התוצאות לנטרל את ההשפעות של בעלי חיים השונות ניסיוני, המאפשר להגיע של משמעות סטטיסטית של תוצאות, גם על ניתוח של מספר מוגבל של אנשים13.

יודגש כי, אם כי מהיר וזול, שיטה זו יש שתי מגבלות עיקריות. ראשית, היא נועדה לחקור את השליטה הגנטית התאית של האדריכלות העצבית, וזה לא מתאים לטפל בשליטה סביבתית. שנית, כמו מושתלים המושתלים טרום המעבר להגיע למיקום הסופי שלהם על ידי לוח זמנים הטרוכרוני, שיטה זו עדיפה על מודל שליטה נוירופרטונידנטים המתרחשים השלמת הגירה בעבר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל השיטות וההליכים המתוארים כאן אושרו על ידי הארגון SISSA הקדם אל Benessere Animale (SISSA IACUC).

1. הדור הנדסי של בריכות מחולל "ירוקות"

  1. הכנת הבריכה "הירוקה"
    1. מחבר מסוג פראי CD1 נקבה עם מייסד Mtapt/+ + 16. המתת חסד הסכר ההרה על ידי פריקה צוואר הרחם ב 12.5 ימים post-coitum (היום 0 נקבע על ידי בדיקה לחבר הנרתיק) והקציר היום עובריים 12.5 (E 12.5) עוברים. הגדר אותם בארות בודדות של צלחת 24 מרבי בפתרון PBS קר.
    2. במהירות גנוטיפ העוברים על ידי בדיקה חזותית תחת מנורה כחולה אור, בדיקת פליטת זריחה ירוקה במוח.
    3. מניחים את "ירוק" עוברים לתוך 10 ס מ בקוטר צלחת פטרי מלא קר 1x PBS עם 0.6% גלוקוז ולהעביר אותו תחת stereomicroscope.
    4. חותכים את ראשי העובר באמצעות מספריים סטנדרטיים לחלץ את הטלנצאלון מהם באמצעות3 מלקחיים5.
    5. הפרד בין שתי הtelencephalic שלפוחיות ומבתר את הדרך באמצעות מלקחיים; לוודא להסיר את ההיפוקמפוס גרעינים הבסיס17.
    6. לאסוף מערבולות על ידי העברת אותם עם P1000 הצינורות לתוך שפופרת 1.5 mL שמרו על קרח.
    7. . השאר את החלק התחתון של הצינור
    8. . ומכה את הסופר ככל האפשר
    9. השהה מחדש את ה400 μL של מדיום מתרבים טרי [DMA-F12, 1x גלוטמקס, 1X N2, 1 מ"ג/mL סרום אלבומין חלבון (BSA), 0.6% גלוקוז, 2 μg/mL הפארין, 20 ng/mL בסיסי פיברופיצוץ גורם גידול (bFGF), 20 ng/mL גידול באפידרמיס פקטור (EGF), 1X עט-דלקת, ו-10 pg/mL אמפוריטיצין B].
    10. בעדינות פיפטה מעלה למעלה ולמטה, ברצף עם P1000, P200, ו P20 טיפים, 4x לכל עצה, כדי לקבל השעיה תא מעונן.
      הערה: E 12.5 רקמה ניקורטיקלית רכה מאוד; הנתק אותו לתאים בודדים אינו דורש עיכול אנזימטי בכלל; ליטוף חוזר ונשנה מספיק.
    11. תנו לקרום המוח ולגושים. הקורטיקליים להתיישב למשך 2 דקות
    12. העברת 150 μL מראש ההשעיה התא (בעיקר המכיל תאים בודדים) לתוך צינור חדש 1.5 mL סטרילי.
    13. הוסף 150 μL של בינוני מתרבים טרי וחזור על שלבים 1.1.10-1.1.12 עד שלא יהיו יותר גושים ברקמות. במהלך הפעולה הזאת, השמט את שלב P1000 ליטוף (בשלב 1.1.10).
      הערה: שלושה איטרציה של צעדים 1.1.10-1.1.12 מספיקים בדרך כלל כדי להשיג את הדיסוציאציה רקמות מלא.
    14. לספור תאים ("ירוק" בריכה) עם טרילון כחול הדרה שיטה בחדר בורקר17 ולהוסיף מדיום מתרבים טרי כדי לכוונן את הריכוז 103 תאים/μl.
      הערה: שלבים 1.1.7-1.1.14 יש לבצע תחת מכסה זרימה סטרילית למינארי חיטוי שחוטא על ידי 70% אתנול והמשיך מאוורר לפחות 20 דקות.
  2. הנדסת תת-בריכות "ירוקות"
    1. חלוקת משנה את הבריכה "ירוק" לשתי משנה תת בריכות שני שונים 1.5 mL צינורות לזיהום ויראלי.
    2. הדביקו את תת-הבריכות באופן עצמאי עם שני התערובות הייעודיות. כל מיקס מכיל וירוס "אדום תווית" (Pgk1_mCherry) או "שחור" וירוס (pCAG_lacZ) כפקד, כמו גם וירוסים עבור tetOFF מונחה טרנסגנים (Pgk1p_tTA ו TRE_transgene) או שליטה (Pgk1p_tTA ו TRE_PLAP) ביטוי.
      התראה: לטפל בווירוסים בסביבת הבה4 עם כל מדידות המגן שנקבעו על-ידי הכללים והחוקים הישימים.
      הערה: כל הווירוסים חייבים להיות מנוהלים בריבוי של זיהום (מע) של 8, אשר (כפי שהוצג בעבר14) מספיק כדי לשנות את הרוב המכריע של התאים העצביים בתנאים ניסיוניים כאלה (איור 1). הווירוס מחסה לשנות את הפעילות ניתן לבנות על ידי הפעלת היזמים נוירוonal שונים נהיגה tTA/rtTA ביטוי (למשל, pTα1, pSyn, pCaMKII, pGAD1, וכו ') (איור 2). משרד המשרד הינו היחס של (א) למספר החלקיקים הנגיפי המדבקים הנמסרים ל-(ב) מספר תאי היעד שלהם. כאן, הראשון (א) מחושב על פי ההליך המקובל המתואר במקום אחר14, השני (ב) הוא פשוט מוערך באמצעות תא בורקר.
    3. צלחת 600,000 תאים של כל תת מאגר נגוע לכל טוב של 12 צלחת multiwell יטב, ב 600 μL של בינוני מתרבים עם 2 μg/mL של דוקסיציקלין.
      הערה: כאן, בארות אינן מטופלות מראש עם פולי ליזין, מה שמונע את ההחזקה של התא העצבי לתחתית שלהם.
    4. העבר תאים לחממה ב 5% CO2 ב 37 ° c.
    5. לאחר יומיים, כדי להעריך את היעילות של זיהום ואת הסימון הדיפרנציאלי של בריכות הנדסה, לבדוק את התאים תחת מיקרוסקופ פלורסנט קונבנציונאלי. שתי בריכות המשנה חייבות להופיע כהשעיות של נוירוספירות קטנות, המבטאות באופן ברור את חלבון הפלורסנט האדום ("שליטה") או לא ("מבחן" דגימה). בתוך הנוירוספירות אלה, ה- Mtaptegfp מוגבלת פעיל מוגבל למיעוט של תאים (post-mitotic נוירונים) ושקטים ברובם (precursors מתרבים) (איור 3).

2. הגדרת כלי הניתוח ואזור התפעול

  1. הכנת מחטי בורוסיליקט
    1. השתמש נימים זכוכית בורוסיליקט עם קוטר חיצוני ופנימי שווה 1.5 מ"מ ו 1.12 מ"מ, בהתאמה.
    2. משוך את הנימים עם ה1000 P.
    3. . הגדר את תוכנית המשיכה פרמטרים אופייניים לתוכנית הם: חום = 614; vel = 60; זמן = 1; לחץ = 600. הם חייבים להיות מותאמים על פי מודל הפולר ואת המנגד חימום המועסקים.
    4. הניחו את הנימים בתוך מחזיקי הפולר והדקו אותם.
    5. הפעל את התוכנית ולקחת את שני מיקרו נימים משכו.
    6. חותכים את העצה נימי ביד, עם אזמל, תחת stereomicroscope כדי לקבל טיפ עם קוטר חיצוני של ~ 200-250 μm.
    7. הניחו את הנימים על חימר מדגמי (לדוגמא, פלסטלינה) בצלחת פטרי סגורה והעבירו אותו אל מתחת למכסה המנוע.
  2. הקמת מכסה המנוע והכנת פתרון המעקב אחר תאים
    1. נקה את מכסה הזרימה האופקית בזהירות וחטא אותו באמצעות 70% אתנול.
    2. חיטוי סיבים אופטיים באמצעות 70% אתנול ומניחים אותם מתחת למכסה המנוע.
    3. מערבבים 10 μL של 125 מ"מ פתרון EGTA ו 10 μL של ירוק מהיר כדי להכין את" פתרון מעקב התא "ולמקם אותו מתחת למכסה המנוע.
    4. גזור חתיכות קטנות (4 ס"מ x 2 ס מ של גודל) של מעבדה איטום הסרט לאיתור ההשעיה התא.
    5. הכינו פתרון של 1 מ"ג/mL דוקסיציקלין סטרילי ומלא אותו לתוך מזרק 0.3 mL.
    6. החליפו את המכסה והמשיכו להזרים את המנוע במשך 20 דקות לפני הניתוח.
  3. הרכבת צינורית ההזרקה
    1. קח את הנרתיק פלסטיק קשיח, שני צינורות לייטקס (כל אחד 30 ס מ ארוך) ומחזיק נימי מתוך ערכת הרכבה שפופרת מתכלה עבור פיפטות מכויל.
    2. תקן את הדבר הקשה-פלסטיק. לקצה אחד של צינור גומי
    3. לתקן את מחזיק הנימי לקצה אחד של צינור לייטקס אחר.
    4. לחבר את הקצוות החופשיים של שני צינורות לייטקס עם מסנן סטרילי 0.45 יקרומטר, כמחסום נגד חיידקים מפעיל.
    5. מניחים את שפופרת הצינור המתקבל על מחזיק חימר הדוגמנות להישמר מתחת למכסה המנוע.

3. שילוב תאים והשתלת מדרסים

  1. ערבוב "מבחן" ו-"שליטה" תא ירוק בריכות משנה
    1. לאסוף "מבחן" ו "שליטה" נוירוספירות (ראה שלב 1.2.5) בנפרד 1.5 mL צינורות.
    2. כדורים צנטריפוגה מושעה ב 200 g עבור 5 דקות.
    3. לאסוף ולמחוק את סופרנטאנט, הימנעות הפרעה של הגלולה התא.
    4. השעיה מחדש בעדינות של נוירוספירות ב-500 μL של 1x PBS.
    5. צנטריפוגה אותם ב 200 g עבור 1 דקות.
    6. . הסר את הסופרנטאנט
    7. חזור על הצעדים 3.1.4-3.1.6 עוד פעמיים.
    8. השהה בעדינות את הספירות ב-200 μL של הפתרון של 2x טריפסין (2x טריפסין, 1x PBS) והתא הפיפטה למעלה ולמטה 4x-5x.
      הערה: שים לב לא לעשות בועות אוויר.
    9. השאר תאים בחממה עבור 5 דקות ב 37 ° צ' כדי להשיג השעיה תא בודד.
    10. לחסום טריפסין עם 200 μL של טריפסין פתרון מעכבי (DMEM-F12, 10 μg/mL DNAse I, 0.28 mg/mL טריפסין מעכבי) על ידי ליטוף למעלה ולמטה 4x-5x.
    11. בתאי צנטריפוגה ב 200 x g עבור 5 דקות ולהשעות אותם מחדש 1 מ ל של מדיום מתרבים טרי (Dמאמ-F12, 1X גלוטמקס, 1X N2, 1 מ"ג/ML bsa, 0.6% גלוקוז, 2 μg/ml הפארין, 20 Ng/Ml bFGF, 20 Ng/ML egf, 1x עט-דלקת, 10 pg/Ml אמפוריטיצין B).
    12. הרוזן תאים של שתי הבריכות עם טרי, שיטת אי-הכללה כחולה בחדר בורקר.
    13. להתאים את הריכוז שלהם כדי 100,000 תאים/μL במדיום ההתרבות.
    14. מערבבים 1:1 "בדיקת" תאים עם "שליטה" אלה.
    15. בדוק את התמהיל המתקבל תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטית (הגדלה אובייקטיבית: 10x) כדי להבטיח כי התמהיל הוא תא בודד השעיה של שתי הבריכות (איור 3C).
    16. הניחו את התערובת על הקרח מתחת למכסה המנוע.
  2. השתלת אנטרריקולריות
    1. הכן את הכלוב עם האם והגורים הP0 על השולחן הרחק מאזור הניתוח הכירורגי.
    2. הציבו כלוב שחזור על עגלה הקרובה למכסה המנוע.
    3. שימו תערובת של נסורת נלקח מהכלוב של האם בתחתית כלוב ההתאוששות ומניחים אותו מתחת למנורה.
    4. בצד, להגדיר תיבת קרח מכוסה על ידי רדיד אלומיניום להרדמה של גורים P0.
    5. רק לפני השתלת, להוסיף 1/10 נפח של פתרון מעקב תאים (משלב 2.2.3) עד 1 נפח של ההשעיה התא (משלב 3.1.16) ובמקום 3 μL של התוצאה "הזרקת הזרקה" על פיסת מעבדה איטום הסרט.
    6. הצב את הגור על רדיד אלומיניום קריר במשך 1 דקות ובדוק כי הוא מורדם לחלוטין.
      הערה: כדי לאשר הרדמה, לסחוט בעדינות כפה ולעקוב אחר הכלבלב על העדר תנועות, תוך שהוא עדיין נושם.
    7. בינתיים, לאכול את 3 μL של תערובת הזרקה (משלב 3.2.5) לתוך נימי הזכוכית.
    8. נגב בעדינות את ראש הכלבלב. ההרדמה עם 70% אתנול
    9. מניחים את סנטרו של הגור על קצה הסיבים האופטיים כדי לזהות בבירור את האונות הקורטיקלית.
      הערה: ב-P0-P1, עור הראש דק מאוד, ומאפשר זיהוי ויזואלי ישיר של האונות מעל העיניים ומאחורי הנורות הריח.
    10. שמרו את הקפילר (טעונים כמתואר בשלב 3.2.7) באחד משני מטוסי האדם הבינוניים (שמאל או ימין), מעל לנורת הריח, ונקב את עור המצח בהצטלבות עם המישור הקדמי המכיל את מרכזי העיניים. שימו לב לא לפגוע בכלי הדם. הכניסו את הקפילר לקליפת המוח הקדמית והיכנסו לחלל המוח (איור 4A).
    11. כדי למנוע נזק מקרי של כבוד גנגלייוני, לסובב את המחט למעלה על ידי 30 מעלות, מצביע הקצה שלה caudal-המדיאלי-וורד (איור 4B).
    12. בעדינות להזריק את התאים לתוך חלל חדרית ולפקח על הדיפוזיה שלהם באמצעות ירוק מהיר (איור 4C).
    13. לחכות 5-10 s.
    14. הסר את המחט זכוכית מטפלת לא להשליך את ההשעיה התא ולמחוק אותו בסל סילוק מתאים.
    15. לפני התאוששות הגור מן הרדמה להזריק 150 μL של intraperitoneally פתרון דוקסיציקלין לשמור על ביטוי transgene עדיין לאחר ההשתלה.
    16. לאחר הזריקה, למקם את הגור מיד מתחת למנורה להחלמה.
    17. להשאיר את הגורים מתחת למנורה עבור 5-10 דקות, פעם הערה לגמרי, למקם אותם בכלוב עם האם.
    18. הביטו בגורים המופעלים ב-2-3 h כדי לוודא שהאם מקבלת אותם.
    19. לספק את הכלוב עם מי שתייה המכילה 0.5 mg/mL דוקסיציקלין ו 50 g/L סוכות כדי לשמור על הבעה גנטית לבטל.
    20. להחליף את המים דוקסיציקלין-המכיל מים ללא 4 ימים לאחר ההשתלה, ובכך מפעיל את הטרנסגנים ב-post-mitotic נוירונים. שמרו על עכברים במשטר ללא דופי במשך 6 ימים והללו את המתת החסד שלהם ב-P10 על ידי שאיפת פחמן דו חמצני ואחריה בעריפת ראש.

4. ניתוח מוחות מושתלים

  1. היסטולוגיה ואימונולואונציה
    1. המתת חסד את הגורים המושתלים 10 ימים לאחר השתלת התא על ידי שאיפת פחמן דו חמצני ואחריו עריפת ראש. לתקן את המוח של כלבלבים מורדמים ב 4% פאראפורמלדהיד (בתחתית) ב 4 ° c בלילה.
      התראה: המטה רעיל מאוד; לטפל בו בזהירות, להיענות בקפדנות למרשמים של היצרן, תחת כיסוי כימי; להיפטר הפתרון הכיורי שיורית במיכל פסולת בעלת תווית.
    2. הסר את הפתרון הב, והחלף אותו ב-30% סוכרוז פתרון.
    3. השאירו את המוח בארבע מעלות צלזיוס או עד שהוא ישקע לתחתית הבקבוקון.
    4. להעביר את המוח לתוך עובש הטבעה חד פעמי בערך חצי מלא עם מדיום הכללת ההקפאה.
    5. הקפא את המוחות הכלולים ב--80 ° c.
    6. גזור 60 יקרומטר סעיפים ילתית עבה באמצעות קריוסטט.
      הערה: הימנע משימוש במקטעים דקים, כמו זה עלול לגרום לאובדן מקובל של מידע על הארכיטקטורה כולה של נוירונים בודדים.
    7. מקטעי תהליכים לאימונולואונציה18,19, באמצעות anti-gfp [1:400] ו anti-rfp (mcherry) [1:500] נוגדנים. גרעיני נגד כתמים עם פתרון 1 מ"ג/mL DAPI [1:200].
  2. גומורמטריה
    1. הגדר פרמטרים עבודה של המיקרוסקופ קונפוקלית וקד כדלקמן: z-מחסנית גובה = 40 μm; שלב = 2 μm.
    2. לאסוף תמונות של פרוסות חיסוני בחירת שדות הצילום של העצב הגדול GFP-עשיר, עיוור של התפלגות אותות RFP.
    3. יצא את התמונות כקבצי. nd2.
    4. צור הקרנות Z מרביות שלהן כקבצי tiff (איור 5A).
    5. כדי לאפשר לשלד משני סדרתי. להיות עיוור לתאים, תחביא את האות האדום לשם כך, פתח כל קובץ. tiff באמצעות תוכנה מתאימה והוסף שכבת התאמה. בחר "רמות", "אדום", ואז להגדיר "פלט" לאפס. שמור את הקובץ ככזה.
      הערה: השלד מבוצע לאחר מכן על ידי מפעיל חדש שלא הייתה לו גישה קודמת לקבצים המקוריים של אדום רגיל.
    6. לכל קובץ אדום מוסתר, הוסיפו שכבת ציור לתמונה הראשית ובחרו בכלי העיפרון (צבע לבן). לעקוב אחר הסומה על בסיס האות GFP, ואז לעקוב אחר neurites.
      הערה: ניתן להגדיר את כלי העיפרון ב 40 פיקסלים עבור הסומה ובשלושה פיקסלים עבור neurites.
    7. שמור את קובץ רובת שכבות כולל צלליות עצבי (איור 5b).
      הערה: ניתוח מאוחר יותר של שלד עצבי יכול להתבצע על ידי כל אופרטור.
    8. צור קובץ חדש בגווני אפור של 1024 x 1024 16-bit עם רקע שחור, אחד לכל תא עצב.
    9. העתק והדבק צלליות בודדות מהתמונה הראשית לקובץ גווני האפור החדש. חזור לקובץ מרובה שכבות והחלף את שכבת ההתאמה כדי לחשוף גנוסוגים עצביים. שמור את הקובץ בגווני אפור של 16 סיביות המדגיש את הגנוטיפ העצבי המתאים.
    10. יבא תמונות בגווני אפור ב-ImageJ אחד אחד ונתח שלדים על-ידי תוסף עצבי התוכנה של imagej (איור 5c).
    11. העתק את הנתונים הראשוניים (neurite_length, attachment_points ונקודות קצה; עבור כל אחד מהם, קח את הערכים "שטח כולל"), הדבק אותם בגיליון אלקטרוני והשתמש בהם לחישוב פרמטרים משניים מורמטרים ( ממוצע neurite אורך, מדד הסתעפות) (איור 5d).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

קיימות חמש מערכות נתונים ראשיות המספקות מידע שימושי אודות היבטים מרכזיים של הפרוצדורה, היעילות הראשונה (1) התייעלות של התמרה ושיתוף התמרה של וקטורים מבוססי-ויראליות. (2) דוגמה של תכונות עיקריות של היזמים המועסקים לנהוג "גן מבחן". (3) דוגמה של תאים מהונדסים מוכן השתלת. (4) קריקטורה הכוללת פרטים פרוצדורליים מרכזיים של הזרקת מיקרותא למוח הירחי. (5) תמצית של הצינור המטרי השלם.

באשר (1), את היכולת של הפרוטואוליים וקטורים מועברים ב MO...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

היבטים/צעדים ספציפיים של הליך זה הם קריטיים ודורשים תשומת לב מיוחדת. ראשית, (א) אופרטורים חייבים להיות מאומנים בצורה מספקת כדי לתפעל בביטחה את הווירוסים בסביבת מעבדה תואמת BSL-2. שנית, (ב) לפני ערבוב "מבחן" ו "שליטה" ההכנות העצביות, זה הכרחי כדי לשטוף בזהירות את שני השעיות נוירוספירה המקביל כפי שמתואר, כדי למנוע כל עיכוב החוצה הידבקות של שתי ההכנות בשל העדשה לא רצויות להמשיך השלישי, (ג) תוך שתילת התאים, הטיפול חייב להיות ממוקם תוך מיקוד חלל חדרית; במובן זה, מכשיר המעקב הירוק מהיר כלול בהשעיה של התא הוא של עזרה משמעותית. ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

אנו מודים לקרן דוק על תרומתו לשלב מוקדם של הליך זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מזרק 0.3 מ"לBD320840חנות ב-RT
0.45 μ m מסנן סטריליMillex-HVחנות SLHU033RSבחנות RT
12 multiwell plateFalcon353043בחנות RT
1X PBSGibco14190-094בחנות RT
24 multiwellplate Falcon351147ב-RT
נוגדן נגד EGFP, פוליקלונל עוף, RRID:AB_371416חנות TebubioGTX13970ב-20 & #176; C
נוגדן נגד RFP, חד שבטי עכברוש, RRID:AB_10795839חנות ABIN334653 מקוונת של נוגדניםב-20 ו-#176;
C נוגדן נגד Tubb3, חד שבטי עכבר, RRID:AB_2313773CovanceMMS-435Pב-20 & #176;
C ערכת מכלולי צינור שואב לפיפטות מיקרו-נימיות מכוילותSigmaA5177-5EAבמנורת אור
כחולNightseaBLS2בנימי RT
בורוסיליקטKwik-FilTW150-4בחנות RT
BSASigmaA9647בחנות -20 & #176; C
Bü תא rkerSigmaBR7195200.0025 מ"מ2, 0.100 מ"מ
Cryo-inclusion medium (Killik)Bio-Optica05-9801חנות בחנות RT
DAPISigmaD9542ב-20 & #176; C
תבנית הטבעה חד פעמיתBio-Optica07MP7070חנות בחנות RT
DMEM/F-12Gibco31331-028בחנות +4 & #176; C
Dnase IRoche10104159001חנות ב -20 & #176; C
DoxyciclineSigmaD1822חנות ב -20 & #176; מלקחיים C
Dumont #3cחנות Fine Science Tools11231-20בחנות RT
Dumont #5חנות Fine Science Tools11251-20בחנות RT
EGFGibcoPHG0311ב-20 & #176; חנות C
EGTASigmaE3889בחנות RT
FGFGibcoPHG0261ב-20 & #176; C
מספריים עדינים - חנות SharpFine Science Tools14060-09בחנות RT
Fungizone (Amphotericin B)Gibco15290018בחנות -20 & #176; חנות C
גלוקוזסיגמאG8270בחנות RT
GlutaMAX תוסףתזונה Gibco35050061בחנות RT
עז נגד עוף Alexa 488InvitrogenA11039בחנות -20 & #176; C
עז נגד חולדות Alexa 594InvitrogenA11007חנות ב -20 & #176; C
Heparin SolutionStem Cell Technologies07980חנות ב-20 & #176; תוסף C
N2Gibco17502048חנות ב -20 & #176; C
סיבים אופטייםLeicaCLS150X
P1000 חולץSutter InstrumentsP-1000 דגם
ParafilmBemisPM-996חנות בחנות RT
PenStrep SigmaP0781בחנות -20 & #176; C
חנות 353003 פלקון צלחת פטריבחנות 158127 RT
PFASigmaב-RT
Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP]בנויה in housestore ב-20 & #176; C
פלסמיד #386 [LV_pTa1_mCherry]בנוי in housestore ב-20 & #176; C
פלסמיד #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)]בנוי בבית#176; C
פלסמיד #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)]בנוי in ביתחנות ב-20 & #176; C
פלסמיד #484 [LV_lacZ]חנות Addgene12108ב-20 ו-#176; C
Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry]בנוי in housestore ב-20 & #176; C
פלסמיד #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)]בנוי בביתחנות ב-20 & #176; חנות C
TאזמלבראוןBB515בחנות RT
SteromicroscopeLeicaMZ6בחנות RT
Trypan blueGibco15250-061בחנות RT
TrypsinGibco15400-054בחנות -20 & #176;
מעכב טריפסיןC SigmaT6522חנות ב -20 & #176; ג
חנות חנות RT חנות חנות חנות ב-20 ו-

מקורות

  1. Kistner, A., et al. Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (1996).
  2. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2011).
  3. Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
  4. Puram, S. V., et al. A CaMKIIβ 2 signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain. Nature Neuroscience. , (2011).
  5. Zuccotti, A., Le Magueresse, C., Chen, M., Neitz, A., Monyer, H. The transcription factor Fezf2 directs the differentiation of neural stem cells in the subventricular zone toward a cortical phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2014).
  6. Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by in Vivo Genome Editing. Cell. , (2016).
  7. Spiga, S., Acquas, E., Puddu, M. C., Mulas, G., Lintas, A., Diana, M. Simultaneous Golgi-Cox and immunofluorescence using confocal microscopy. Brain Structure and Function. , (2011).
  8. Chen, B., et al. The Fezf2-Ctip2 genetic pathway regulates the fate choice of subcortical projection neurons in the developing cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2008).
  9. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. , (2000).
  10. Lu, X. H., Yang, X. W. Genetically-directed Sparse Neuronal Labeling in BAC Transgenic Mice through Mononucleotide Repeat Frameshift. Scientific Reports. , (2017).
  11. Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Improved tools for the Brainbow toolbox. Nature Methods. , (2013).
  12. Garcia-Moreno, F., Vasistha, N. A., Begbie, J., Molnar, Z. CLoNe is a new method to target single progenitors and study their progeny in mouse and chick. Development. , (2014).
  13. Falcone, C., Daga, A., Leanza, G., Mallamaci, A. Emx2 as a novel tool to suppress glioblastoma. Oncotarget. , (2016).
  14. Brancaccio, M., Pivetta, C., Granzotto, M., Filippis, C., Mallamaci, A. Emx2 and Foxg1 inhibit gliogenesis and promote neuronogenesis. Stem Cells. , (2010).
  15. Fimiani, C., Goina, E., Su, Q., Gao, G., Mallamaci, A. RNA activation of haploinsufficient Foxg1 gene in murine neocortex. Scientific Reports. , (2016).
  16. Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. Neurotrophins are required for nerve growth during development. Nature Neuroscience. , (2001).
  17. Currle, D. S., Hu, J. S., Kolski-Andreaco, A., Monuki, E. S. Culture of mouse neural stem cell precursors. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
  18. Park, J. J., Cunningham, M. G. Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
  19. Puzzolo, E., Mallamaci, A. Cortico-cerebral histogenesis in the opossum Monodelphis domestica: Generation of a hexalaminar neocortex in the absence of a basal proliferative compartment. Neural Development. , (2010).
  20. NeurphologyJ Manual. , http://life.nctu.edu.tw/~ehwang/Manual.pdf (2012).
  21. Chiola, S., Do, M. D., Centrone, L., Mallamaci, A. Foxg1 Overexpression in Neocortical Pyramids Stimulates Dendrite Elongation Via Hes1 and pCreb1 Upregulation. Cerebral Cortex. , (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

NeurphologyJTetON OFF

מאמרים קשורים