הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

שחייה המושרה שיתוק כדי להעריך דופמין איתות ב Caenorhabditis elegans

7.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59243

⸱

3 באפריל 2019

 ,  , 
1Harriet Wilkes Honors College, Florida Atlantic University, John D MacArthur Campus, 2Integrative Biology and Neuroscience program, College of Science, Florida Atlantic University, 3Brain Institute, Florida Atlantic University, 4Department of Biomedical Science, Charles E. Schmidt College of Medicine, Florida Atlantic University

במאמר זה

סיכום

שחייה המושרה assay התנהגותית ומבוססת חקר המנגנונים המשמשת כבסיס של דופמין איתות ב Caenorhabditis elegans (C. elegans) היא שיתוק (SWIP). עם זאת, שיטה מפורטת כדי לבצע את הבדיקה לוקה בחסר. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול צעד אחר צעד עבור SWIP.

תקציר

וזמינותו שחייה שמתואר פרוטוקול זה הוא כלי תקף כדי לזהות חלבונים ויסות של דופאמין synapses. בדומה יונקים, דופמין (DA) קובע מספר פונקציות ב- C. elegans כולל למידה ופעילות מוטורית. תנאי זה לעורר שחרור דא (למשל, אמפטמין (AMPH) טיפולים) או זה למנוע DA סיווג (למשל, חיות חסר המשגר DA (dat-1) אשר אינם מסוגלים reaccumulating DA לתוך הנוירונים) ליצור עודף של DA חוץ-תאית בסופו של דבר וכתוצאה מכך ומכניקה עכבות. תופעה זו בולטת במיוחד כאשר בעלי החיים לשחות במים. למעשה, בעוד חיות פראי-סוג להמשיך לשחות לתקופה ממושכת, מוטציות null dat-1 ופראי-סוג שטופלו AMPH או מעכבים של המשגר DA לשקוע לתחתית הבאר ואל תזוז. תופעה זו נקראת "שחייה המושרה שיתוק" (SWIP). למרות וזמינותו SWIP וותיקה, תיאור מפורט של השיטה לוקה בחסר. כאן, אנו מתארים מדריך צעד אחר צעד כדי לבצע SWIP. כדי לבצע את הבדיקה, מאחר חיות הבמה-4 דרגות זחל מוצבים צלחת זכוכית ספוט המכיל סוכרוז פתרון בקרת עם או בלי AMPH. בעלי חיים הם הבקיע עבור התנהגותם שחייה באופן ידני על-ידי ויזואליזציה תחת סטריאוסקופ או באופן אוטומטי על ידי הקלטה עם מצלמה רכוב על סטריאוסקופ. קטעי וידאו הם מכן נותחו באמצעות תוכנת מעקב, אשר מניב ייצוג חזותי של תדירות בהלקאה ושיתוק בצורה של מפות חום. שתי המערכות ידניים ואוטומטיים מבטיח של הבדיקה לכימות בקלות של יכולת שחייה החיה, ובכך להקל על הקרנה עבור חיות הנושאת מוטציות בתוך מערכת וכולינרגיים או גנים עזר. בנוסף, ניתן להשתמש SWIP כדי להבהיר את מנגנון הפעולה של תרופות של התעללות כגון AMPH.

מבוא

חיות לבצע מגוון רחב של התנהגויות מולדת ומורכבים מתווכת על ידי נוירוטרנסמיטרים שונים מתואמת על ידי תהליכים מסובכים איתות. הנוירוטרנסמיטר דופמין (DA) שמתווכת התנהגויות שנשמרת מאוד על פני מינים, כולל למידה, המוטורית ועיבוד גמול.

נמטודות קרקע C. elegans, עם מערכת עצבים פשוטה יחסית וממופים היטב המורכב הנוירונים רק 302, מראה התנהגויות מורכבות בצורה ניכרת, כולל רבים שמווסתים על-ידי DA כגון ההזדווגות, למידה, שיחור מזון, גפיים, הנחת הביצה 1. בין תכונות אחרות, מחזור חיים קצר, קלות הטיפול ושימור של מולקולות איתות, להדגיש יתרונות השימוש C. elegans כמודל ללימוד הבסיס העצבי של התנהגויות ההכפלה.

ההרמפרודיט C. elegans מכיל נוירונים דופאמין שמונה; בנוסף לכך, הזכר מכיל שישה זוגות נוספים להזדווגות למטרות. כמו יונקים, הנוירונים הללו לסנתז DA ולבטא את המשגר DA (DAT-1), חלבון ממברנה נמצאו אך ורק בנוירונים דופאמין, אשר מסיע DA שפורסם החריץ הסינפטית בחזרה לתוך הנוירונים דופאמין. יתר על כן, רוב החלבונים המעורבים בכל שלב של סינתזה, אריזה ועל שחרור דא מאוד נשמרים בין תולעים ובני ו, כמו אצל יונקים, DA ממיקרו התנהגויות האכלה ובאופן C. elegans2.

C. elegans זוחל על משטחים מוצקים, שוחה עם התנהגות אופיינית בהלקאה במים. מעניין, מוטציות חסר הבעה של DAT-1 (dat-1) לזחול בדרך כלל על משטח מוצק אבל להיכשל לקיים את השחייה כאשר הושקע במים. התנהגות זו היה כינה שחייה המושרה שיתוק או SWIP. ניסויים קודמים הראו כי SWIP, בין השאר, נגרמת על ידי עודף של DA בתוך החריץ סינפטית זה בסופו של דבר מהתזונה קולטני postsynaptic כמו D2 (DOP-3). אמנם במקור שזוהתה dat-1 ההסתרה חיות3, SWIP הוא ציין גם אצל בעלי חיים פראי-סוג לטפל בתרופות שמונעים הפעילות של DAT (כגון imipramine4) ו/או לגרום שחרור דא (למשל, אמפטמין5). מצד שני, למנוע מניפולציות תרופתי או מחלה גנטית הסב סינתזה ושחרור של DA וחסימת פונקציה קולטן DOP-3 SWIP6. יחדיו, אלה נתונים שפורסמו כבר הקמנו SWIP בתור כלי אמין כדי לחקור את ההשפעות התנהגותית נגרם על ידי מוטציה חלבונים בתוך וכולינרגיים הסינפסות3,4,7 וכדי להיות מועסק העברה של מסכי גנטי לצורך זיהוי הרומן משעולים רגולטוריות מעורב DA איתות7,8,9,10,11,12. בנוסף, על ידי מתן של הבדיקה לכימות בקלות של שיכרון התנהגות בבעלי חיים, SWIP מאפשרת הבהרה של מנגנוני הפעולה של תרופות כמו אמפטמין (AMPH), azaperone-דופאמין synapses5, 6 , 13 , 14 , 15.

פרוטוקולים עבור ביצוע מבחני SWIP את תוארו לפני16. כאן נתאר בפירוט את המתודולוגיה ואת ההתקנה כדי לבצע את הבדיקה עם המטרה של מתן כמדריך חזותי עבור הקהילה C. elegans לבצע ביעילות SWIP.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת פתרונות ומדיה

  1. הכנת מאגר M9 על ידי המסת ח'2PO4 3.0 g (22.05 מ מ), נה2HPO4 g 6.0 (42.2 מ מ), ו- g NaCl 5.0 (85.5 מ מ) ב 1 ליטר של מים יונים בלוק. הוסף 1.0 מ"ל של 1 מ' MgSO4 (12 גרם באמצעי אחסון הסופי של 100 מ ל מים יונים בלוק) אחרי autoclaving. מיקס 100 מ"ל של x 10 וכתוצאה מכך M9 עם 900 מל של בלוק יונים מים כדי ליצור פתרון 1 x.
  2. כדי להפוך את הביצה מאגר, להמיס 6.896 g של NaCl (118 מ מ), g 3.578 של אשלגן כלורי (48 מ מ), 0.294 גר' CaCl2-2 H2O (2 מ מ), 0.406 גר' MgCl2-6 H2O (2 מ מ) ו- g 5.958 (25 מ מ) של HEPES ב 1 ליטר של מים יונים בלוק. להתאים את ה-pH ל 7.3 באמצעות NaOH.
  3. להכין נתרן תת-כלורי טריים/NaOH פתרון על-ידי הוספת 1 מ"ל של 5-6% נתרן תת-כלורי (אקונומיקה) 180 µL של 10 N NaOH 3.8 מ ל מים יונים.
  4. שוקל 60 גר' סוכרוז, להתמוסס במים יונים בלוק לאמצעי הסופי של 100 מ ל לעשות 60% סוכרוז פתרון.
  5. להמיס 0.684 גר' סוכרוז ב 10 מ"ל מים יונים בלוק לעשות 200 מ"מ סוכרוז. לבדוק ולהתאים אותה על osmolarity באמצעות osmometer. להפוך aliquots 1 מ"ל ב 1.5 mL microcentrifuge צינורות ומקפיאים ב-20 ° C.
  6. שוקל 0.184 גר' AMPH (משקל מולקולרי 184.75 g/mol), להמיס 10 מ"ל של מים יונים כדי ליצור פתרון מניות 100 מ מ. לערבב 2 µL של הפתרון מניות ב- 400 µL של מים כדי ליצור הפתרון עובד 0.5 מ מ.
  7. להכין צמיחה מזין לוחות מדיה (NGM)
    1. מערבבים דור 3 של NaCl (52.65 מ מ), 20 גרם של peptone, 25 גרם של מה נשארתי-אגר, 975 מ ל מים יונים בבקבוקון Erlenmeyer 2 ל'. כוללים בר מערבבים מגנטי autoclave (121 מעלות צלזיוס, 15 PSI) למשך שעה באמצעות מחזור נוזלי.
    2. מגניב כדי, לשמור על הטמפרטורה כ 50 ° C על-ידי הצבת את הבקבוק על הגל תוך כדי ערבוב. להוסיף 0.5 מ"ל של כולסטרול (5 מ"ג/מ"ל אתנול), 1 מ"ל של MgSO 1 מ'4, 1 מ"ל של 1 מ' CaCl2 , 25 מ ל 1 מ' אשלגן פוספט מאגר, pH 7.4 (g 108.3 של ח'2PO4, 35.6 g K-2-HPO-4 יונים מים 1 ליטר).
    3. פיפטה 25 מ ל כל אחד לתוך צלחות פטרי 100 מ"מ x 15 מ"מ ולאפשר התקשורת לגבש. חנות את הלוחיות הפוך ב 4 ° C בקופסה עד 4 שבועות.
  8. הכנת ציר מרק (ליברות) Lysogeny
    1. להמיס 5 גר' LB לערבב אבקת ב 200 מ ל מים יונים הבקבוק Erlenmeyer. אוטוקלב במשך 30 דקות ניצול של עיקור נוזלי מחזור. לאפשר שהמרק להתקרר. לאחסן בטמפרטורת החדר במשך 1-2 שבועות.
  9. הכנת לוחות חיידקי NA22
    1. השתמש טיפ פיפטה סטרילי או לולאה חיידקי סטרילי צובעות צלחת ליברות עם נפח קטן של חיידקים NA22 e. coli במלאי גליצרול, דגירה את הצלחת במהופך בתוך חממה 37 ° C בלילה לגדול מושבות המבודד. לבחור להציג שמושבה בודדת לתוך 200 מ ל LB מרק מוכן בשלב 1.8 ותנו לגדול בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס על פלטפורמה חזק.
    2. כדי להפיץ את הצלחות, לוותר על 200 µL של התרבות חיידקי על גבי הלוחות NGM שהוכן קודם לכן בשלב 1.7 ולהפיץ עם מקל הוקי זכוכית סטריליים. . תן את הצלחות יבש לילה או יותר תחת ברדס ולאחסן upside מטה בתיבת אטום ב 4 º C.
  10. כדי להפוך את הכלי ריסים/פלטינה לאסוף תולעים, דבק ריסים עבים או של נימה פלטינה לתוך כוס פיפטה פסטר באמצעות דבק סופר. חותכים את קצה עפעף בזווית באמצעות סכין גילוח. לחלופין, ניתן להשתמש מבער בונזן להמיס את קצה פיפטה מזכוכית סביב נימה פלטינה.

2. גידול C. elegans

הערה: תרבות פראי-סוג N2C. elegans עומס על צלחות NA22 Escherichia coli . השיטות תרבות מפורט שיפורטו להלן.

  1. הכנה של תרבות תולעת
    1. כדי להפוך את תרבות starter של תולעים, לחתוך חתיכה קטנה של אגר מצלחת המכיל חיות מוזן היטב ולהעביר אותה אל צלחת חיידקים NA22 e. coli מוכן בשלב 1.9 בעזרת מרית סטרילי. דגירה צלחות ב 20 מעלות צלזיוס במשך 3-4 ימים. תחת מיקרוסקופ סטריאו, חזותית לאשר הנוכחות של מבוגרים gravid.
  2. הכנת מסונכרן אוכלוסיית תולעים
    1. לאסוף מבוגרים gravid לפחות 2 צלחות על ידי מחלק מים יונים בלוק סביב הלוח באמצעות בקבוק מים. מה עוללת בעדינות את הצלחת לסלק את התולעים ולאסוף את התולעים לתוך 15 מ"ל פוליסטירן חרוט צינור באמצעות פיפטה פלסטיק חד פעמיות
    2. ספין דרך צינור ומפרידה ב x 140 גרם למשך 2 דקות הצניפה התולעים, ואז וארוקן את supernatant באמצעות משאבת ואקום או עם בנה בואקום מעבדה.
    3. Resuspend ושטוף התולעים על-ידי מילוי את הצינור מים יונים בלוק, מיקס, צנטריפוגה ב 140 x גרם עבור 2 דק וארוקן את תגובת שיקוע וחזור זה יימשך צעד שני פעמים נוספות, או עד תולעים ברורים מחיידקים (מים מופיע ברור כשמערבבים. עם התולעים).
    4. הוסף 5 מ של נתרן תת-כלורי טרי/NaOH פתרון (שלב 1.3) בגדר תולעת ומערבבים במהירות באמצעות מערבולת. דגירה הצינור על כיסא נדנדה למשך כ- 4-8 דקות. תקופת הדגירה עם נתרן תת-כלורי/NaOH פתרון שנעה בין 4-8 דקות על סמך איכות הפתרון מניות נתרן תת-כלורי (אקונומיקה).
    5. לשים טיפה (2-50 µL) של לאודנום תולעים על משטח זכוכית מיקרוסקופ ולבדוק כל 2 דקות תחת המיקרוסקופ על פירוק תולעת. כאשר כ- 70% של התולעים הן lysed ביצים משתחררים, ממלאים את הצינור מאגר ביצים המבושלות שלב 1.2 ומיד צנטריפוגה עבור 1 דקות ב- 140 x גרם הצניפה העוברים והתולעת הגוויות.
    6. וארוקן את תגובת שיקוע ולשטוף בגדר 3 פעמים נוספות על-ידי מילוי את הצינור בכל פעם עם מאגר ביצה. ספין למטה ב x 140 גרם עבור 1 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע בכל פעם. בגדר הופך ללבן בסוף שוטף.
    7. לאחר השטיפה הסופית להפריד את העוברים הגוויות מת ב 30% סוכרוז פתרון. הוסף 5 מ ל מים יונים בלוק בגדר, resuspend, הוסף 5 מ של 60% סוכרוז מוכן בשלב 1.4. לערבב ביסודיות, צנטריפוגה ב 160 x גרם במשך 6 דקות.
    8. השתמש כוס פסטר פיפטה להעברת העוברים צף-מניסקוס העליון לתוך צינור חרוטי טריים 15 מ"ל. אין ליטול יותר מ- 3-4 מ"ל. כדי להסיר כל סוכרוז הנותרים, לשטוף את העוברים 3 פעמים עם מים בלוק על ידי צריך שתוציאו ב 140 x גרם במשך 3 דקות, הסרת את תגובת שיקוע, resuspending בגדר (וממלאים את הצינור) בכל פעם.
    9. חזור על שוטף עם מאגר x M9 1. לאחר השטיפה הסופית resuspend בגדר ב 10 מ"ל של M9. להשאיר את הצינורות מטרף בן לילה (לא יותר מ- 14 h) על הביצים לבקוע לזחלים L1. תולעים יישארו ב- L1 הפרפרים והעשים בשל חוסר מזון.
    10. לשטוף L1 הזחלים 3 פעמים עם מים בלוק להסיר שאפריש פרומונים שפורסמו על ידי הזחלים על ידי צריך שתוציאו ב x 140 גרם עבור 2 דק Resuspend הזחלים ב 1 מ"ל של מים. להפוך 1:10 דילול של תולעים מים, pipette טיפה 10 µL על משטח זכוכית, לשים על coverslip, לספור את מספר תולעים מתחת סטריאוסקופ. חזור על פעולה זו פעמיים, ממוצע התוצאות.
    11. פיפטה הנפח של תולעים שמתאים כאלף תולעים על גבי צלחת NA22 (שהובאו קודם לכן לטמפרטורת החדר) על-ידי הצבת קטן טיפות על הצלחת. להשאיר את הצלחת פתוח למחצה עד הטיפה מתייבש. לאחר מכן לכסות את הצלחת, דגירה במהופך בתוך חממה 20 ° C כ- 44-48 שעות או עד התולעים מגיע שלב L4 מאוחר, כמו מאושרות באופן חזותי תחת stereomicroscope. עכשיו התולעים מוכנים להיבדק על SWIP.

3. SWIP

הערה: אנו מתארים את השיטה הידנית של הערכת SWIP בעיר וורמס פראי-סוג שטופלו AMPH. נדון בקצרה גם את המעקב אחר תולעים, ניתוח נוסף של תולעת קינטיקה באמצעות גשש תולעת אוטומטיים ותוכנות מעקב אשר שתוארו קודם לכן על-ידי הארדוויי ואח '10.

  1. שיטה ידנית כדי לבדוק את SWIP
    1. µL 40 aliquot של mOsm/L 200 סוכרוז פתרון עם או בלי 0.5 מ מ AMPH לתוך צלחת זכוכית ספוט. תחת סטריאוסקופ, לבחור בשלב מאוחר-L4 8-10 תולעים עם עפעף או פלטינה לבחור ויציפו האיסוף בצלחת המכילה את הפתרון עד תולעים תרדו האיסוף ולשחות אל הפתרון. הערה מספר תולעים בחרה לתוך הבאר, להתחיל את הטיימר, לצפות ולהקליט את המספר של תולעים המציגות SWIP כל סימן דקה.
    2. העתק את הנתונים הגולמיים לתוך גיליון אלקטרוני לחשב את האחוזים של תולעים משותק על ידי חלוקת מספר תולעים משותק בכל רגע על ידי המספר הכולל של תולעים נבדק ברחבי וזמינותו, להכפיל ב- 100. להעתיק את ערכי אחוזים כל יצירת גרפים ועצב תוכנה סטטיסטית, מגרש הנתונים עם ערכי אחוז על ציר Y זמן על ציר שימוש בגרף XY X.
    3. לבצע ANOVA דו-כיווני שלאחריה יבוא ניתוח פוסט-הוק (למשל, Bonferroni פוסט-מבחן) כדי לבדוק מובהקות סטטיסטית בין שליטה, קבוצות AMPH וזמן הטיפול.
  2. ניתוח אוטומטיות של SWIP
    1. לבצע ניתוח אוטומטיות על תולעת אחת בכל פעם. פרוטוקול כדי להגדיר את המצלמה, תוכנת המעקב התולעת ואת script להפעלת תוכנת מעקב ניתוח מתוארים בפירוט הארדוויי et al.16.
    2. בקצרה, מקום אנדרוגינוס הבמה L4 מאוחר יחיד לתוך צלחת זכוכית ספוט ניצול מכוש עפעף, כפי שמתואר השיטה הידנית בסעיף 3.1.2. להקליט קטעי וידאו שחיה של תולעת אחת בזמן ולהשתמש את תוכנת המעקב תולעת כדי לחשב את התדירות של הגוף מתכופף.
    3. בצע את קובץ ה-script מסופק עם תוכנת מעקב כדי להשיג את תדירות בהלקאה תולעת וכדי ליצור מפות חום מתוך נתוני בהלקאה תולעת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

נציג דוגמה SWIP assay המושרה על ידי טיפול AMPH. איור 1 מציג ייצוג סכמטי של ההתקנה assay כמתואר לעיל. עבור assay ידנית, בערך בגיל 8-10 מסונכרן תולעים בשלב מאוחר של L4 נאספים עם עפעף או פלטינה לבחור להציב לתוך צלחת ספוט זכוכית מלאים µL 40 של 200 סוכרוז mOsm/L (פתרון שליטה) או סוכרוז עם 0.5 מ מ AMPH ונבדק SWIP.

כאשר בעלי חיים מפסיקים לשחות (קרי: SWIP), תערוכה הם שוקעים לתחתית הבאר ואל תזוז מהר. לכן, הא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול שלב אחר שלב כדי לבצע וזמינותו התנהגותית, SWIP, ב- C. elegans. פרוטוקול זה הוא פשוט וישיר עם לא צבעוני טכנית ביצוע assay משתמש מאוד ידידותי. למרות זאת, ישנם כמה היבטים קריטיים זה צריכים לקחת בחשבון על מנת לבצע ביעילות וזמינותו.

צריך לקחת כדי להבטיח כי התולעים המשמש וזמינותו לשובע, מאז ההגבלה תזונה משפיעה על SWIP17. עדין טיפול של תולעים בזמן לקטוף, כמו טיפול מתוזמן היטב כמו נתרן תת-כלורי/NaOH במהלך פירוק הם שלבים קריטיים, טראומה במהלך ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

המחברים רוצה להודות ד ר אוסמה Refai מהמעבדה של ד ר רנדי בלייקלי להדרכה עם ניתוח אוטומטיות של SWIP. עבודה זו נתמכה על ידי מימון NIH R01 DA042156 כדי LC.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נייר אלומיניוםריינולדס עוטף1091835
אמפטמיןסיגמא51-63-8   
חממת חיידקיםניו ברונסוויק מדעיתM1352-0000
כיתה בקטריולוגית, AgarLab Scientific, Inc  A466
Bacto (TM) פפטוןBDREF 211677
סידן כלורי (דיהידרט)מצלמת Sigma-AldrichC3881
 ThorlabsU-CMAD3
 Eppendorf 5810R 15ampE215059
כולסטרולSigma-Aldrich57-88-5
מים נטולי יוניםMilliporeZ00QSV0WWMilli-Q
דיכאון צלחת ספוט זכוכיתCorningCorning, Inc. 722085
בקבוק ErlenmeyerThermoFisher4103-0250PK
ריסים
שקופית זכוכיתFisherbrand12-550-15
תוכנת גרפים וסטטיסטיקהPrismGraphpad 5
HEPESSigma-AldrichRB=H3375 & H7006
היפוכלוריטהוקינסנתרן היפוכלוריט 4-6%, USP" מרק 1 גל
LB, מילרפישרBP1426
מגנזיום כלוריד (הקסהידרט)סיגמא-אולדריץ'RB=M0250500 גרם
מגנזיום גופרתי (הפטהידרט)Sigma-AldrichM1880
מוט ערבוב מגנטיפישרברנד16-800-510 
צינורות מיקרוצנטריפוגהThermoFisher69715
NA 22 חיידקיםCGC
NystatinSigma1400-61-9
אוסמומטרמכשירים מתקדמים, בע"מדגם 3320
פסטר פיפטספישרברנד13-678-20A
Petriplatesפלקון351007
מד pHאוריון VersaStar ProIS-68X591202-B 0514
צינורות חרוטיים פוליסטריןפלקון352095
אשלגן כלוריסיגמא-אולדריץ' P9541
אשלגן דימימן פוספטסיגמא-אולדריץ'7778-77-0
אשלגן פוספט - DIBASICסיגמא-אולדריץ'P-8281
אשלגן פוספט - MONOBASICסיגמא-אולדריץ'P0662
פיפטות סרולוגיותVWR10 מ"ל = 89130-898
שייקראמין מדעי55S 12x16
נתרן כלוריפישרRB=BP358-1
נתרן דימימן פוספטפישרRB=S381
גיליון אלקטרוניMS office
מיקרוסקופ סטריאו מיקרוסקופזייסדגם tlb3. 1 stemi2000
קצות פיפטה סטריליותשונות02-707-400
סוכרוזסיגמא-אולדריץ'RB=S5016
סופר-דבקלוקטיט1647358.14 אונקיות.
SwimR sofware10.18129/B9.bioc.SwimR
Tracker 2Worm Tracker 2.0www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/
תוכנת הקלטת וידאוVirtualdubhttp://www.virtualdub.org/
חיטוי צנטריפוגה

מקורות

  1. de Bono, M., Villu Maricq, A. Neuronal Substrates of Complex Behaviors in C. elegans. Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 451-501 (2005).
  2. Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. C. elegans Locomotory Rate Is Modulated by the Environment through a Dopaminergic Pathway and by Experience through a Serotonergic Pathway. Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).
  3. McDonald, P. W., et al. Vigorous Motor Activity in Caenorhabditis elegans Requires Efficient Clearance of Dopamine Mediated by Synaptic Localization of the Dopamine Transporter DAT-1. Journal of Neuroscience. 27 (51), 14216-14227 (2007).
  4. Carvelli, L., Blakely, R. D., DeFelice, L. J. Dopamine Transporter/Syntaxin 1A Interactions Regulate Transporter Channel Activity and Dopaminergic Synaptic Transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14192(2008).
  5. Carvelli, L., Matthies, D. S., Galli, A. Molecular mechanisms of amphetamine actions in Caenorhabditis elegans. Molecular Pharmacology. 78 (1), 151-156 (2010).
  6. Refai, O., Blakely, R. D. Blockade and reversal of swimming-induced paralysis in C. elegans by the antipsychotic and D2-type dopamine receptor antagonist azaperone. Neurochemistry International. , (2018).
  7. Bermingham, D. P., et al. The Atypical MAP Kinase SWIP-13/ERK8 Regulates Dopamine Transporters through a Rho-Dependent Mechanism. The Journal of Neuroscience. 37 (38), 9288-9304 (2017).
  8. Nass, R., et al. A genetic screen in Caenorhabditis elegans for dopamine neuron insensitivity to 6-hydroxydopamine identifies dopamine transporter mutants impacting transporter biosynthesis and trafficking. Journal of Neurochemistry. 94 (3), 774-785 (2005).
  9. Hardaway, J. A., et al. Forward genetic analysis to identify determinants of dopamine signaling in Caenorhabditis elegans using swimming-induced paralysis. G3. 2 (8), Bethesda, Md. 961-975 (2012).
  10. Hardaway, J. A., et al. Glial Expression of the Caenorhabditis elegans Gene swip-10 Supports Glutamate Dependent Control of Extrasynaptic Dopamine Signaling. Journal of Neuroscience. 35 (25), 9409-9423 (2015).
  11. Felton, C. M., Johnson, C. M. Dopamine signaling in C. elegans is mediated in part by HLH-17-dependent regulation of extracellular dopamine levels. G3. 4 (6), Bethesda, Md. 1081-1089 (2014).
  12. Lanzo, A., et al. Silencing of Syntaxin 1A in the Dopaminergic Neurons Decreases the Activity of the Dopamine Transporter and Prevents Amphetamine-Induced Behaviors in C. elegans. Frontiers in Physiology. 9 (576), (2018).
  13. Safratowich, B. D., Lor, C., Bianchi, L., Carvelli, L. Amphetamine activates an amine-gated chloride channel to generate behavioral effects in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 288 (30), 21630-21637 (2013).
  14. Safratowich, B. D., Hossain, M., Bianchi, L., Carvelli, L. Amphetamine Potentiates the Effects of -Phenylethylamine through Activation of an Amine-Gated Chloride Channel. Journal of Neuroscience. 34 (13), 4686-4691 (2014).
  15. Carvelli, L. Amphetamine activates / potentiates a ligand-gated ion channel. Channels (Austin). 8 (4), 294-295 (2014).
  16. Hardaway, J. A., et al. et al.An open-source analytical platform for analysis of C. elegans swimming-induced paralysis. Journal of Neuroscience Methods. 232, 58-62 (2014).
  17. Lüersen, K., Faust, U., Gottschling, D. -C., Döring, F. Gait-specific adaptation of locomotor activity in response to dietary restriction in Caenorhabditis elegans. The Journal of Experimental Biology. 217, Pt 14 2480-2488 (2014).
  18. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019(2012).
  19. Lamitina, S. T., Morrison, R., Moeckel, G. W., Strange, K. Adaptation of the nematode Caenorhabditis elegans. to extreme osmotic stress. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), 785-791 (2004).
  20. Masoudi, N., Ibanez-Cruceyra, P., Offenburger, S. -L., Holmes, A., Gartner, A. Tetraspanin (TSP-17) Protects Dopaminergic Neurons against 6-OHDA-Induced Neurodegeneration in C. elegans. PLoS Genetics. 10 (12), 1004767(2014).
  21. Jayanthi, L. D., et al. The Caenorhabditis elegans gene T23G5.5 encodes an antidepressant- and cocaine-sensitive dopamine transporter. Molecular Pharmacology. 54 (4), 601-609 (1998).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

C. elegansטיפול באמפתמיןמוטנט DAT-1אנליזה בסטראאוסקופתוכנת Worm Trackerיצירת מפת חוםתדירות התפתלותניתוח שונות דו-כיווני (Two-Way ANOVA)
שחייה המושרה שיתוק כדי להעריך דופמין איתות ב Caenorhabditis elegans
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.