מאמר שיטה

להמחיש ירידת ערך של המחסומים אנדותל, גליה של היחידה נוירו-וסקולריים במהלך ניסיוני אוטואימוניות דלקת המוח וחוט השדרה In Vivo

DOI:

10.3791/59249

⸱

26 במרץ 2019

 , 
1Theodor Kocher Institute, University of Bern

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לחקור ליקוי של היחידה נוירו-וסקולריים במהלך ניסיוני אוטואימוניות דלקת המוח וחוט השדרה ויוו. אנו הכתובת באופן ספציפי כיצד לקבוע את מחסום הדם - מוח חדירות ופעילות gelatinase מעורבים בהעברה ליקוציט לרוחב limitans עכשיו, דונלד.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יחידת נוירו-וסקולריים (NVU) מורכב microvascular תאי אנדותל ויוצרים את מחסום הדם - מוח (BBB), קרום המרתף אנדותל עם pericytes מוטבע, והלחין limitans עכשיו, דונלד על ידי קרום המרתף parenchymal, astrocytic סיום-feed חובק את ההיבט abluminal של מערכת העצבים המרכזית (CNS) microvessels. בנוסף לשמירה על מערכת העצבים המרכזית הומאוסטזיס NVU שולטת תא החיסון סחר לתוך מערכת העצבים. במהלך immunosurveillance של מערכת העצבים המספרים הנמוכים של לימפוציטים מופעל תוכלו לחצות את המכשול אנדותל מבלי לגרום BBB בתפקוד או מחלה קלינית. לעומת זאת, במהלך neuroinflammation כגון טרשת נפוצה או במודל חיה שלה ניסיוני אוטואימוניות דלקת המוח וחוט השדרה (EAE) מספר גדול של תאים חיסוניים יכולים לחצות BBB ובעקבות כך את limitans עכשיו, דונלד בסופו של דבר להגיע CNS parenchyma מובילים למחלות קליניות. נדידת תאים חיסוניים אל CNS parenchyma ולכן הוא תהליך בן שני שלבים זה כרוך העברה רציפה לאורך המכשול אנדותל, גליה של NVU העסקת ברורים המנגנונים המולקולריים. אם בעקבות מעבר שלהם על פני המכשול אנדותל, תאי T פוגשים אנטיגן cognate שלהם על תאים אנטיגן perivascular שלהם הפעלה מחדש המקומי תיזום מנגנונים הבאים מובילים לקראת הפעלת מוקד של gelatinases, אשר יאפשר תאי T לחצות את מחסום גליה ולהזין CNS parenchyma. לפיכך, הערכת, BBB חדירות והן פעילות MMP קורלציה מרחבית על הצטברות תאים חיסוניים בתוך מערכת העצבים במהלך EAE מאפשרת לציין אובדן שלמות של חסמי אנדותל, גליה NVU. אנו כאן מראים כיצד לגרום EAE בעכברים C57BL/6 על ידי חיסון פעיל וכיצד לנתח לאחר מכן BBB חדירות ויוו באמצעות שילוב של המשדרים פלורסנט אקסוגני. עוד נראה, כיצד להמחיש, בתרגום gelatinase הפעילות במוח EAE מאת באתרו zymogaphy מצמידים stainings immunofluorescent של BBB המרתף ממברנות ו CD45 + תאי מערכת החיסון הפולשים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת העצבים המרכזית (CNS) קואורדינטות הגוף וכל התפקודים המנטליים גולגולת, הומאוסטזיס CNS חיוני עבור תקשורת נאותה של נוירונים. CNS הומאוסטזיס היא מוצדקת על ידי היחידה נוירו-וסקולריים (NVU), אשר מגן על מערכת העצבים סביבה המשתנים של זרם הדם. NVU מורכב CNS microvascular אנדותל תאים, אשר מבחינה ביוכימית ייחודיים ולהקים את מחסום הדם - מוח (BBB) ב crosstalk רציפה עם pericytes, האסטרוציטים, נוירונים ורכיבים מטריצה חוץ-תאית (ECM), הקמת שני ממברנות המרתף ברורים1. קרום המרתף אנדותל ensheathes את ההיבט abluminal של תאי אנדותל BBB בנמלים מספר גבוה של pericytes והוא מורכב laminin α4 וα5 laminin, בנוסף חלבונים אחרים ECM2. לעומת זאת, קרום המרתף parenchymal מורכב laminin α1 ו laminin α2 ואת מוזמנת על ידי סיום astrocytic-מטר. קרום המרתף parenchymal יחד עם אסטרוציט הסוף-רגל מלחינה את limitans עכשיו, דונלד שמבודד הרשת העצבית CNS השדרתי מלא perivascular או חללים תת-עכבישי3. בשל הארכיטקטורה הייחודית של NVU, תא החיסון סחר לתוך מערכת העצבים היא נבדלת כי לתוך רקמות היקפיים כפי שהוא דורש תהליך בן שני שלבים עם תאים חיסוניים, קודם פורצים BBB אנדותל ובעקבות כך את limitans עכשיו, דונלד על מנת להגיע אל CNS parenchyma.

טרשת נפוצה (MS) היא מחלה נפוצה neuroinflammatory של מערכת העצבים, שבו מספר רב של מחזורי תאים חיסוניים להזין את מערכת העצבים ולגרום neuroinflammation, demyelination, ואובדן מוקד של BBB שלמות4. ההפסד של BBB שלמות הוא סימן ההיכר המוקדמים של MS, כפי שצוין על ידי הנוכחות של ניגוד גדוליניום שיפור נגעים ב מערכת העצבים כמו על ידי תהודה מגנטית (MRI)5. ליקוציט extravasation לתוך מערכת העצבים מתרחשת ברמה של postcapillary venules; עם זאת, המנגנון המדויק מעורב diapedesis תא החיסון על-פני קרום המרתף BBB ובעקבות כך למכשול גליה נשארים כדי להבטיח את הזמנתכם. ניסיוני אוטואימוניות דלקת המוח וחוט השדרה (EAE) משמש במודל חיה עבור MS, והוא תרם באופן משמעותי את הידע הנוכחי שלנו על פתוגנזה MS. למשל, באמצעות מודל EAE זה כבר גילו כי ליקוציט extravasation מתרחשת בתהליך רב שלבי, כולל של הלכידה הראשונית, מתגלגל שלב מתווכת על-ידי selectins ומולקולות mucin דמוי כגון בחירת שמלות P ליגנד גליקופרוטאין (PSGL)-1, שהופעלו על ידי מעצר המשרד תלויי-אינטגרין סריקה של תאי T על תאי אנדותל BBB הצדדים מתירניות עבור diapedesis6.

ברגע T תאים חצו BBB אנדותל, קרום המרתף אנדותל, הם צריכים להיתקל שלהם אנטיגן cognate מקרופאגים או תאים דנדריטים לשפות אחרות באופן אסטרטגי את החללים leptomeningeal או perivascular. אינטראקציה זו גורם הייצור מוקד של מתווכים פרו-דלקתיים על ההדק המנגנונים הבאים הנדרשים לפלישה CNS רקמה של תאים חיסוניים באמצעות8,97,limitans עכשיו, דונלד. הפעלת מוקד של מטריקס-metalloproteinases (MMP)-2 ו- MMP-9 הפיצולים כימוקין הפעלה ומשרה השפלה של מטריצה חוץ-תאית רצפטורים על אסטרוציט סוף-כפות רגליים, המהווה תנאי הכרחי לקבלת החיסון תא העברה על-פני limitans עכשיו, דונלד לתוך CNS parenchyma, כדי לעודד הופעת התסמינים הקליניים של EAE10,11.

שילוב של זיהוי של CNS שחדר תא החיסון עם BBB זליגת ופעילות gelatinase בסעיפים רקמות CNS מספק מידע חשוב אודות שלמות פונקציונלית של המכשול אנדותל, גליה בהקשר של neuroinflammation. למשל, לאחרונה חקרנו. אובדן המכונן של המולקולה אדהזיה מהחיבור מולקולה צומת חזק אנדותל (ריבה)-B תא החיסון סחר לתוך מערכת העצבים בהקשר של EAE. לעומת עכברים C57BL/6 פראי-סוג בריא, בריא הארנבונים מאותה חשוכת-B-ריבה הראה אין ליקוי של BBB שלמות כפי שמוצג על ידי הערכת חדירות ויוו באמצעות המשדרים אנדוגני, כמו גם אקסוגני12. בהקשר של EAE, ריבה חשוכת-B C57BL/6 עכברים הראה תסמיני המחלה יושבחו, אשר היה קשור עם תאים דלקתיים השמנה leptomeningeal ו- perivascular רווחים12. לחקור תופעה זו והגשנו בקשה בחיי עיר zymography, המאפשר זיהוי של פעילות gelatinase כדי לבחון אם חוסר פעילות gelatinase בעכברים חשוכת-ריבה-B עשוי להיות אחראי על המספרים מופחתת של תאים חיסוניים מסוגל לפרוץ עכשיו, דונלד limitans12.

נתון הזמינות של שונות מהונדסים גנטית עכבר מודלים חסר, למשל, מולקולות צמוד לצומת BBB שונות העלולות לגרום שינויים בתפקוד BBB, מתודולוגיות על חקירת BBB שלמות חשובים. בנוסף, פיתח תרופות יכול להשפיע על NVU מחסומים. הנה אנחנו מראים כיצד לגרום EAE בעכברים C57BL/6 על ידי חיסון פעיל המיאלין אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין (ש א)-פפטיד aa35-55 adjuvants של שלמה פרוינד. אז נסביר איך למקם תא החיסון חדירה מעבר חסמי אנדותל, גליה NVU וכיצד לומדים המכשול אנדותל, גליה ויוו שלמות על ידי זיהוי באתרו של המשדרים אקסוגני ופעילות gelatinase, בהתאמה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל המחקרים נערכו תחת המנחים לפי החקיקה שוויצרי בנושא ההגנה על בעלי חיים ואושרו על-ידי המשרד הווטרינרי של קנטון ברן, שווייץ (הרשאה מספרים: להיות 31/17, להיות 77/18).

1. דיור של עכברים C57BL/6 פתוגן מסוים התנאים (SPF) חינם

  1. מחזור בית עכברים בכלובים מאוורר בודד עם ה 12/12 בהירה-כהה. לספק מזון ומים libidum לספירה. כדי לפקח על איכות מיקרוביולוגית של העכברים, עברה קבוצה ניסיונית חודשיות בריאות פיקוח על-ידי זקיפים מצעים מלוכלך בעקבות המלצות FELASA13.
  2. שימוש אגרופים אוזן בנפרד לסמן עכברים C57BL/6 נקבה שבוע 8-12.

2. חיסון של עכברים C57BL/6

  1. אופן ההכנה של פתרונות14:
    1. עבור שלמה פרוינד אדג'וונט (CFA), לערבב 30 מ של אדג'וונט של פרוינד שלם עם 120 מ ג של חום טרי pestled להשבית שחפת Mycobacterium (H37RA) תחת ברדס fume. פתרון מלאי החנות ב 4 º C.
    2. עבור הפתרון מניות MOGaa35-55-פפטיד, להמיס MOGaa35-55-פפטיד ב- PBS סטרילי (4 מ"ג/מ"ל) ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס.
    3. הכן ש א-האמולסיה:
      1. לדלל פרנק 1:2 עם פתרון מניות ש א-פפטיד microtube מ ל 2.
      2. חותם את microtube עם איטום הסרט ולתקן על מערבל מערבולת על ידי מכסה לחלוטין את הצינור עם דבק. מערבולת אמולסיה במשך 4 שעות-4 מעלות צלזיוס.
    4. הכנת מזרקים עם אמולסיה יציבה:
      1. קח את microtube, במהירות ספין למטה האמולסיה באמצעות צנטריפוגה שולחן קטן. לאסוף אמולסיה לתוך מזרק באמצעות הזרקה במזרק 18G x 1½'' (1.2 מ"מ x 40 מ"מ).
      2. על פי מספר עכברים לכוונן את עוצמת הקול אמולסיה במזרק (µL 100/עכבר) והחלף את המחט 18 גרם הזרקה במזרק 27G x ¾'' (0.4 מ"מ x 19 מ"מ). חותם את המחט הזרקת המצורפת את המזרק עם איטום הסרט.
    5. עבור הפתרון רעלן (PTx) שעלת מניות, להמיס 50 µg של PTx lyophilized ב µL 500 ל- PBS סטרילי (100 ng/µL). פתרון מלאי החנות ב 4 º C.
    6. עבור הפתרון עובד PTx, מערבבים µL 97 ל- PBS סטרילי עם 3 µL של PTx מניות פתרון (300 ng/100 µL) לכל העכבר (לשימוש הזרקת בקרום הבטן מחט 30G x ½'' (0.3 מ"מ x 13 מ"מ)).
  2. אינדוקציה EAE
    1. עזים ומתנגד עכברים C57BL/6 עם isofluorane באמצעות מערכת מכשיר אידוי. כדי לגרום הרדמה בעכברים, לחשוף את העכבר כדי isofluorane 4.5% חמצן בתוך תא קטן הדגירה לפני העברת העכבר facemask עם 2.1% isofluorane. השתמש יחידת הרדמה מצויד עם חימום כרית כדי למנוע היפותרמיה של העכבר.
    2. לתקן את העכבר anesthetized ביד אחת, קודם להזריק 30 µL של MOG35-55/פרנק-אמולסיה subcutaneously לתוך רגלו האחורית האגפים (איור 1:1 + 2; ב סה כ 60 µL; לאגף שמאל µL, האגף הימני 30 µL 30) קרוב אל בלוטות הלימפה במפשעה.
    3. הנח את העכבר על הבטן שלו ולהזריק 20 µL של MOGaa35-55/פרנק-אמולסיה לתוך רקמת שומן הרכות ימין ועל שמאל בבסיס הזנב (איור 1:3 + 4; ב סה כ 40 µL; µL שורש 20 הזנב בצד שמאל ואת צד ימין זנב µL שורש 20) ו- droplet קטנה משביל ישראל MOGaa35-55/פרנק-אמולסיה o הצוואר של העכבר (איור 1: 5).
    4. להזריק 100 µL של פתרון PTx intraperitoneally לתוך העכבר. . תחזיק את הראש של העכבר מתחת מרכז הגוף הימנעות הזרקה אל המעי
    5. להחליף דיאטה תחזוקה (חומרים מזינים הגדולות extrudate: הפרוטאין הגולמי 18.5% שומן גולמי 4.5% סיבים גסים 4.5%; אפר גולמי 6.5%; עמילן 35%; אנרגיה מטבולית: 13.1 MJ/kg) רבייה דיאטה (חומרים מזינים הגדולות extrudate: חלבון גולמי 23.5%; גולמי שומן 5.5% סיבים גסים 3%; אפר גולמי 5.7%; עמילן 36%; אנרגיה מטבולית: 14.3 MJ/kg) על מנת לספק לעכברים עם האוכל של תוכן אנרגיה גבוהה יותר לפני ובמהלך המחלה הקלינית הצפויה.
    6. להסיר את מסיכת הפנים ולהעביר את העכבר בכלוב הביתה עם כרית חימום. ודא שהעכבר הוא ער לחלוטין, תאי לאחר 10 דקות.
    7. חזור על PTx הזריקה (2.2.4) 48 שעות לאחר הטיפול הראשון.

3. מניה של EAE עכברים

  1. לבדוק את מצב הבריאות של EAE עכברים כל בוקר על ידי לקיחת מבט בתוך הכלובים.
  2. ציון EAE עכברים בכל יום אחר הצהריים.
  3. לקחת כל העכבר בודדים הכלולים הניסוי EAE הכלוב ואת הסימון אם הזנב יש טונוס על-ידי הזזתה כלפי מעלה עם האצבע. עכבר בריא, אמשיך זנבו (הזנב יש טונוס של). אם EAE קליניים החלה, טונוס הזנב יהיה התחתון, גלוי על ידי הירידה ההדרגתית של הזנב. בסופו של דבר העכבר לא יוכלו להרים את זנבו בכלל.
  4. למקם כל עכבר בודדות הכלולים הניסוי EAE על הספסל נקי ולא לצפות ולתעד את התנהגות הליכה. ראה טבלה 115 עבור ניקוד קריטריונים להערכה של חומרת המחלה (התוצאה EAE).
  5. להעריך ולתעד את המשקל של כל עכבר כלול את הניסוי.
  6. כדי להבטיח ספיגת מים ואוכל נאותה על ידי עכברים הצגה של EAE קליניים הציון 1 לספק מזון בטעימת בצלחת פלסטיק בתחתית הכלוב ולרענן מדי יום.

4. אין ויוו חדירות assay

  1. ההכנות של פתרונות:
    1. פתרונות מניות לתוספי, להמיס 10 מ ג של 10 kDa לתוספי אלקסה עבור חיל הים 488, כמו גם 3 kDa לתוספי טקסס אדום ב- 500 µL של 0.9% נתרן כלורי פתרון (20 מ"ג/מ"ל).
    2. עבור הפתרון עובד לתוספי, רק לפני הזרקת µL pipet 55 של 10 kDa לתוספי אלקסה עבור חיל הים 488 במניה פתרון (20 מ"ג/מ"ל) על חתיכת איטום הסרט ולהוסיף µL 55 של kDa 3 לתוספי פתרון מניות טקסס אדום (20 מ"ג/מ"ל). לערבב, לאסוף 100 µL לתוך מזרק חד פעמיות בסדר (ריכוז סופי 2 מ"ג/100 µL).
    3. הפתרון פורמלדהיד (PFA) 10% מניות, לשלב 10 גרם של תוספת טהור אבקת מחברים, 100 מ של PBS ו 200 µL של NaOH 1N ב כוס זכוכית נקי ומחממים עד בדיוק 56 ° C תחת זע באמצעות של פגים; לשמור ב 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עד התפרקה לחלוטין כדורגלן; להתקרר לטמפרטורת החדר; להתאים את ה-pH ל 7.4; לסנן דרך מסנן נייר. החנות ב- 20 º C. יכול להיות מדולל הפתרון מניות נוספות באמצעות PBS.
  2. זמן קצר עזים ומתנגד בריא עכברים C57BL/6 או C57BL/6 עכברים הסובלים EAE עם איזופלוריין (העכבר יותר עבור 1 דקות). השתמש במערכת אוטומטית כמו שלב 2.2.1 (עכברים להיות חשופים לאיזופלוריין 4.5% חמצן ב חדר אינדוקציה, הועבר לאחר מכן facemask עם 2.1% איזופלוריין).
  3. למקם את העכבר anesthetized במיקום לרוחב על השולחן, אז דרך הווריד (למשל רטרו-orbitally) להזריק 100 µL של המשדרים פלורסנט לתוך העכבר לפני העכבר מתעוררת.
  4. מיד להסיר את facemask וודא שהעכבר הוא ער לחלוטין, תאי לאחר ההרדמה קצרה. תן את רכיב המעקב לזרום למשך 15 דקות.
  5. להמשיך עם שלב 5.1.

5. זלוף של עכברים

  1. להערכת חדירות ויוו:
    1. להתחיל את ההליך 15 דקות לאחר ההזרקה פלורסנט מעקב על ידי גרימת הרדמה עמוקה איזופלוריין. כדי לגרום הרדמה עמוקה בעכברים להשתמש 2.3% של איזופלוריין חמצן. להשתמש את רפלקס הנסיגה כפת לשפוט את עומק ההרדמה (צובטים את העור בין האצבעות; חוסר כיפוף מציין עומק מספיק), ולאחר בדיקה של הרפלקסים של גם את forelimb וגם את hindlimb בעכברים נתון EAE.
    2. לתקן את העכבר על גבו, לרסס את הבטן עם אתנול. פתיחת בית החזה בעזרת מספריים ולהסיר את הסרעפת. פתח את העלייה הימנית של הלב הפועם באמצעות מספריים, perfuse את העכבר דרך החדר השמאלי של הלב עם 10 מ"ל של PBS ואחריו 10 מ"ל של 4% מחברים ב- PBS.
      התראה: כדי למנוע שאיפת מחברים, perfuse את העכבר בשכונה fume.
    3. המשך סעיף 6.
  2. עבור בחיי עיר zymography:
    1. לגרום הרדמה עמוקה איזופלוריין באמצעות איזופלוריין 2.3% חמצן ב עכבר הסובלים EAE ובדוק את עומק ההרדמה כמו שלב 5.1.1.
    2. בשלב הבא, לתקן את העכבר על גבו, לרסס את הבטן עם אתנול. פתיחת בית החזה בעזרת מספריים ולהסיר את הסרעפת. פתח את העלייה הימנית של הלב הפועם באמצעות מספריים, perfuse את העכבר דרך החדר השמאלי של הלב עם 20 מ של PBS.
    3. המשך סעיף 6.

6. ניתוח וקופא של המוח

  1. הכנת אמבט קירור:
    1. מילוי מיכל דיואר שטוח עם קרח יבש כתוש ולהוסיף 2-methylbutane (איזופנטאן) עד שהנוזל מגיע בערך 1 ס מ מעל חבילת קרח יבש. חיפוי עם מכסה רופף – למשל דלי קרח.
  2. קליפ ראש של העכבר perfused עם מספריים חדות ולהסיר את העור ואת האוזניים באמצעות קבוצה קטנה יותר של מספריים.
  3. בזהירות לנתח הכיפה על ידי גזירה מן מאגנום נקב לחזית-השמאל וצד ימין המאפשר upfold הכיפה מעל המוח. . אז, בזהירות להרים המוח ללא פגע בבסיס הגולגולת תוך ניתוק העצבים אופטי באמצעות מרית מתכת שטוחים.
  4. במקום מוח על רדיד אלומיניום וחותכים את המוח לשלושה חלקים (פרונטלית המוח, המוח האמצעי, ואת המוח הקטן + גזע המוח) על ידי הצבת שני חתכים הילתית.
  5. למלא cryomold (25 מ מ x 20 מ מ x 5 מ מ) את הרבעון הראשון עם מטריקס חיתוך (O.C.T.) לטמפרטורה אופטימלית, מניחים פרוסות המוח עם הצד הקדמי של כל חתיכה המוח פונה כלפי מטה לתוך cryomold, ו כיסוי רקמות לחלוטין עם O.C.T. מטריקס.
  6. מניחים את cryomold עם רקמת כיוון אופקי לתוך האמבט 2-Methylbutane ולוודא כי הרקמה קופא מלמטה למעלה בתוך דקה 1 על ידי הימנעות טובלים את הבלוק כולו רקמה לתוך האמבט.
  7. העברת רקמות קפוא-80 מעלות לאחסון והמשך עם סעיף 7.

7. הכנת קטעי רקמה קפוא

  1. Equilibrate טמפרטורה מרקמות קפוא מ-80 מעלות צלזיוס ל-20 ° C ב- cryostat למשך 30 דקות.
  2. הסרת רקמת לחסום cryomold ואת הר על בעל רקמה cryostat (מוגדר לטאוואנג) באמצעות מטריצת O.C.T..
  3. לקצץ את הקצוות של רקמה מבלוק את המחזיק cryostat באזמל חד, להתחיל לחתוך לתוך הרחוב רקמות על-ידי הסרת סעיפים 20 מיקרומטר עם הסכין cryostat עד הרקמה יהיה גלוי.
  4. לניתוח של חדירות BBB ויוו:
    1. לחתוך 6-10 מיקרומטר רקמות מקטעים, לאסוף אותם בשקופיות זכוכית אדהזיה, מיד תמונה הסעיפים מכוסה עם מכסה באמצעות מיקרוסקופ זריחה.
    2. להעריך את המראה של כלי הדם במוח (לשים לב חדה גבולות של כלי הדם הלא-דולפים לעומת טשטוש פלורסצנטיות דפוסים שנצפו כלי הדם דולפים). כפקד חיובית, ודא לדליפת רכיב המעקב לתוך stroma של האברים circumventricular או מקלעת דמית העין שחסרה של BBB.
  5. עבור בחיי עיר zymography:
    1. לחתוך 6 מקטעים רקמות של מיקרומטר, באמצעות cryostat לאסוף אותם בשקופיות זכוכית אדהזיה, הקפאת רקמת סעיפים ב-20 ° C בתוך קופסה מקפיא המכילה סיליקה ג'ל במכסה.

8. בחיי עיר zymography בשילוב עם laminin/CD45 immunofluorescence מכתים

  1. הכן פתרונות:
    1. להכין פתרון ההטבעה:
      1. מערבבים 6 גר' גליצרול (אנליטית כיתה), 2.4 g של פולי (ויניל אלכוהול), 6 מ של ddH2O ו- 12 מ ל 0.2 מ' טריס מאגר, pH 8, ומערבבים (פגים) הפתרון במשך 4 שעות ב- RT.
      2. להעביר את הפתרון שפופרת צנטרפוגה 50 מ ל ולתת לו לנוח 2 h-RT. לאחר מכן דגירה הפתרון עבור 10 דקות ב 50 מעלות צלזיוס (אמבט מים), צנטריפוגה כעשרים דקות ב g x 2,700 בטמפרטורת החדר.
      3. . קח את תגובת שיקוע ומקפיאים ב- aliquots ב-20 ° C.
    2. להכין פתרון ג'לטין קר:
      1. להמיס 0.1 גר' ג'לטין קר מן העור שור ב- 10 מ"ל של ddH2O.
      2. תן לזה משרים למשך לפחות יום אחד ולאחסן aliquots ב 4 º C.
    3. הכנת קרח מתנול (-20 ° C):
      1. שמים 100% מתנול בצנצנת coplin ומגניב ל-20 ° C.
    4. להכין פתרון מניות של אזיד הנתרן של 10%:
      1. להוסיף 10 מ של ddH2O 1g של אזיד הנתרן ולאחסן בטמפרטורת החדר.
    5. הכנת 0.1% נתרן אזיד הפתרון עובד:
      1. מיקס 99 µL של ddH2O עם µL 1 של פתרון מניות של אזיד הנתרן של 10%.
    6. להמיס 1 מ ג של fluorescein מצומדת מתרצה-צבען (DQ) ג'לטין מן חזיר העור ב 1 מ"ל של אזיד הנתרן עובד פתרון וחנות aliquots µL 100 מוגן מפני אור ב 4 º C.
    7. לפזר 30 מ"ג של 1,10-phenanthroline monohydrate ב µL 76 של אתנול וביו -חנות ב-20 ° C.
    8. להכנת 25 x מעכב פרוטאז פתרון:
      1. להוסיף 1 טבליה של EDTA מעכב פרוטאז חינם 2 מ של ddH2O. חנות ב-20 ° C.
    9. לפני השימוש, הכנת התגובה פתרון (150 µL סעיף):
      1. Centrifuge הפתרון ג'לטין 1 מ"ג/מ"ל DQ 5 דקות ב x ומכרה כ-13,300 g.
      2. מיקס 127.2 µL של ddH2O, 15 µL של 10 x מאגר התגובה (Gelatinase/Collagenase Assay קיט; ראה טבלה של חומרים), µL 0.3 של ג'לטין קר 20 מ"ג/מ"ל, µL 1.5 של 1 מ"ג/מ"ל DQ ג'לטין ו 6 µL של 25 x פתרון מעכב פרוטאז.
    10. לפני השימוש, הכן phenantroline שליטה שלילי התגובה פתרון (150 µL סעיף):
      1. מיקס 125.2 µL של ddH2O, 15 µL של 10 x תגובת מאגר, 0.3 µL של ג'לטין קר 20 מ"ג/מ"ל, µL 1.5 של 1 מ"ג/מ"ל DQ ג'לטין, µL 6 של 25 x מעכב פרוטאז EDTA חינם 2 µL של 2 מ' 1,10-phenantroline (MMP מעכב).
    11. לפני השימוש, הכן ג'לטין קר בקרה שלילית (שאינם פלורסנט) התגובה פתרון (150 µL סעיף):
      1. מיקס 128.7 µL ddH2O, µL 15 של 10 x תגובת מאגר, 0.3 µL של ג'לטין קר 20 מ"ג/מ"ל ו 6 µL של מעכב פרוטאז 25 x ללא EDTA.
    12. להכין נוגדן ראשוני קוקטייל עבור counterstaining, לדוגמה, 0.95 נוגדן anti-laminin ארנב polyclonal µg/mL, נוגדן anti-CD45 עכברוש polyclonal µg/מ"ל ב- BSA 1% ב- PBS, ולהכין isotype המתאים שליטה נוגדן ראשוני קוקטיילים.
    13. להכין נוגדן משני פתרון, לדוגמה, 7.5 µg/mL Cy3 עז אנטי חולדה + 15 µg/mL אנטי-ארנב AMCA ב- BSA 1% ב- PBS (להגן מפני אור).
  2. הפשרת מקטעים רקמת מוח שאינו קבוע מיקרומטר 6 מ EAE עכברים בתוך הקופסה מקפיא פלסטיק המכילה סיליקה ג'ל במכסה בשכונה fume למנוע שמירה של מים ברקמות ולהפריד 2 סעיפים רקמות על שקופית אחת על ידי ציור קווים עם מים לדחיית עט
  3. הכנת התגובה פתרונות (צעדים 8.1.9-8.1.11), צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 13,400 x g -בטמפרטורת החדר, וחמים מראש עד 37 ° C שימוש באמבט מים.
  4. נתרענן הסעיפים רקמות עבור 5 דקות ב 37 ° C באמצעות 1 x תגובת מאגר. לאחר מכן, יוצקים את ה 1 x תגובת מאגר להוסיף תגובה פתרון על הסעיפים רקמות, דגירה במשך 4 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס. שטיפת שקופיות 5 פעמים ב- ddH2O.
  5. לתקן מקטעים עבור 5 דקות עם מתנול כקרח ב-20 ° C, אחר כך לשטוף חלקים פעם אחת עם PBS בטמפרטורת החדר.
  6. מוסיפים 1% BSA PBS לסעיפים, תקופת דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר (להגן מפני אור). לאחר מכן, למחוק BSA 1% ב- PBS מן הסעיפים על ידי flipping השקופיות על רקמות, להוסיף קוקטייל נוגדן ראשוני ולאחר תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר (להגן מפני אור).
  7. לשטוף את המקטעים פעמיים עם PBS, להוסיף נוגדנים משניים קוקטייל ולאחר תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר (להגן מפני אור).
  8. לשטוף את המקטעים פעמיים עם PBS, הר של השקופיות עם הטמעת פתרון, תן הנטען בסעיפים יבש במשך הלילה בטמפרטורת החדר (להגן מפני אור). לבסוף, לנתח סעיפים מוכתמים רקמות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערכה של מהלך קליני EAE בעכברים C57BL/6 צריך לגרום בעקומה המחלה כפי שהיא מתוארת דמות 2A ושינויים במשקל הגוף העכבר כפי שהוצג באיור 2B. עכברים C57BL/6 חיסון עם MOGaa35-55 בדרך כלל להתחיל לפתח תסמיני המחלה סביב 10-12 יום לאחר חיסון פעיל (איור 1 א'). בדרך כלל, עכברים לחסן מראים ירידה ארעית של משקל הגוף יום לאחר ההזרקה של האמולסיה והמנה הראשונה של שעלת רעלן (איור 1B). מיום 2 לאחר EAE אינדוקציה, משקל הגוף של ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול זירוז ולפקח EAE בעכברים C57BL/6 הנשי. נקבות מעדיפים נבחרו, ואין שיעור של נשים: הגברים של 3:1 ב- MS. כדי להעריך את חומרת EAE, עשינו שימוש גיליון הבקיע 3 נקודות. חומרת EAE הוא הבקיע בדרך כלל ביחס לחומרת בתפקוד מוטורי. עכברים עם מתקדמים בשלבים של EAE, קרי מפגין ציון מעל 2 צריך להקריב כדי למנוע סבל מיותר של בעלי החיים. לפיכך, מומלץ לצבור העכברים במרווחים קרובים למשל פעמיים ביום כפי שהוסבר בפרוטוקול.  ישנם מספר הבקיע רוטינות המועסקים, להגיע מגיל 0-3 נקודות 0-6 נקודות16,

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שאין ניגודי אינטרסים הכריז.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו להכיר בהכרת תודה לידיה סורוקין, מי שיתף אותה המקורי באתרו zymography פרוטוקול10 איתנו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נוגדן נגד ארנב AMCAJackson ImmunoResearch111-156-045חנות ב-4 מעלות; C; להגן מפני
אור נוגדן נגד CD45 (30F11)Pharmingen07-1401חנות ב-4 מעלות; C
נוגדן אנטי למיניןDAKOZ0097חנות ב-4 מעלות; C
גידול מזוןלמשל PROVIMI KLIBA SA3336
כלובים מאווררים בנפרד, קו כחול מסוג II או IIIלמשל Tecniplast 1145T, 1285L
BSA fraction VApplichemA1391חנות ב-4 מעלות; C
ג'לטין קרSigma-AldrichG 9391
צנצנת קופלין + מתלהלמשל Carl Roth GmbH + Co. KGH554.1; H552.1
Cy3 נוגדן נגד חולדותJackson ImmunoResearch111-156-144חנות ב-4 מעלות; C; להגן מפני אור
החלקות כיסוי 24 x 40 מ"מ # 1למשל Thermo Scientific85-0186-00
Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW)למשל בדיקות מולקולריותD22910חנות ב -20 מעלות; C; להגן מפני אור
Dextran Texas Red (3000 MW)חנות InvitrogenD3328ב -20 מעלות; C; להגן מפני אור
EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit תרמו פישר סיינטיפיק; חנות EnzCheckE12055ב-20 מעלות; C; להגן על הצורה הקלה
נקבה C57BL/6J עכברים (8-12 שבועות)למשל Janvier Labsנקבות, 8-12 שבועות
קופסת הקפאה לשקופיות היסטולוגיותלמשל Carl Roth GmbH + Co. KG2285.1
18G x 1½ ’ ’ (1.2 מ"מ x 40 מ"מ) מחט הזרקהלמשל BD, BD Microlance 3304622
27G x ¾ ’ ’ – מס' 20 (0.4 מ"מ x 19 מ"מ) מחט הזרקהלמשל BD, BD Microlance 3302200
30G x ½ ’ ’ (0.3 מ"מ x 13 מ"מ) מחט הזרקהלמשל BD, BD Microlance 3304000
פרוינד לא שלם' אדג'ובנט (IFA)למשל חנות Santa Cruz Biotechnologysc-24648ב-4° C
מזון תחזוקה, למשל PROVIMI KLIBA SA3436
MOGaa35-55 פפטידלמשל חנות GenScriptב-80 מעלות;
שקופיות מיקרוסקופ C (Superfrost Plus)Thermo ScientificJ1800AMNZ
Mycobacterium tuberculosis H37RAלמשל BD231141לאחסן ב-4 מעלות; C 
NaCl 0.9B. Braun3535789
תרכובת O.C.T. (Tissue-TekSakura4583
Omnican 50 30G x ½ ’ 'B. Braun9151125S
ParaformaldehydeMerck30525-89-4
רעלן שעלתלמשל List biological laboratories, Inc.180חנות ב-4 מעלות; C
poly (אלכוהול ויניל) (Mowiol 4-88)Sigma-Aldrich81381
מעכב פרוטאז ללא EDTA (Roche)חנות Sigma-Aldrich4693132001ב -4 מעלות;
עט דוחה C למשל עט DAKODAKOS2002
למשל Parafilm Mלמשל Sigma-AldrichP7793
סיליקה ג'ללמשל Carl Roth GmbH + Co. KG9351.1
מספריים תפריםFST15012-12
מזרק 1 מ"ללמשל PRIMO62.1002
מזרק 10 מ"ללמשל CODAN Medical 2022-05
Univentor 400UNO. BV
, % ) למשל סרט איטום מערכת אידוי ApS

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
  2. Wu, C., et al. Endothelial basement membrane laminin alpha5 selectively inhibits T lymphocyte extravasation into the brain. Nature Medicine. 15, 519-527 (2009).
  3. Hannocks, M. J., et al. Molecular characterization of perivascular drainage pathways in the murine brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 38, 669-686 (2018).
  4. Kermode, A. G., et al. Breakdown of the blood-brain barrier precedes symptoms and other MRI signs of new lesions in multiple sclerosis. Pathogenetic and clinical implications. Brain. 113 (Pt 5), 1477-1489 (1990).
  5. Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. Neuroimaging techniques to assess inflammation in Multiple Sclerosis. Neuroscience. , (2017).
  6. Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochimica Biophysica Acta. 1862, 461-471 (2016).
  7. Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462, 94-98 (2009).
  8. Kyratsous, N. I., et al. Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, E6381-E6389 (2017).
  9. Lodygin, D., et al. A combination of fluorescent NFAT and H2B sensors uncovers dynamics of T cell activation in real time during CNS autoimmunity. Nature Medicine. 19, 784-790 (2013).
  10. Agrawal, S., et al. Dystroglycan is selectively cleaved at the parenchymal basement membrane at sites of leukocyte extravasation in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Experimental Medicine. 203, 1007-1019 (2006).
  11. Song, J., et al. Focal MMP-2 and MMP-9 activity at the blood-brain barrier promotes chemokine-induced leukocyte migration. Cell Reports. 10, 1040-1054 (2015).
  12. Tietz, S., et al. Lack of junctional adhesion molecule (JAM)-B ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain, Behavior, and Immunity. 73, 3-20 (2018).
  13. Mähler Convenor, M., Berard, M., Feinstein, R., Gallagher, A., Illgen-Wilcke, B., Pritchett-Corning, K., Raspa, M. FELASA working group on revision of guidelines for health monitoring of rodents and rabbits. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab Anim. 48 (3), 178-192 (2014).
  14. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visual Experiments. , (2014).
  15. Tietz, S. M., et al. Refined clinical scoring in comparative EAE studies does not enhance the chance to observe statistically significant differences. European Journal of Immunology. 46, 2481-2483 (2016).
  16. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
  17. Miller, S. D., Karpus, W. J. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. 15, Chapter 15 Unit 14 (2007).
  18. Sobel, R. A., Tuohy, V. K., Lu, Z. J., Laursen, R. A., Lees, M. B. Acute experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice induced by a synthetic peptide of myelin proteolipid protein. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 49, 468-479 (1990).
  19. Westarp, M. E., et al. T lymphocyte line-mediated experimental allergic encephalomyelitis--a pharmacologic model for testing of immunosuppressive agents for the treatment of autoimmune central nervous system disease. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 242, 614-620 (1987).
  20. Klotz, L., et al. B7-H1 shapes T-cell-mediated brain endothelial cell dysfunction and regional encephalitogenicity in spontaneous CNS autoimmunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E6182-E6191 (2016).
  21. Tietz, S. M., et al. MK2 and Fas receptor contribute to the severity of CNS demyelination. PLoS One. 9, e100363(2014).
  22. Coisne, C., Mao, W., Engelhardt, B. Cutting edge: Natalizumab blocks adhesion but not initial contact of human T cells to the blood-brain barrier in vivo in an animal model of multiple sclerosis. Journal of Immunology. 182, 5909-5913 (2009).
  23. Korner, H., et al. Critical points of tumor necrosis factor action in central nervous system autoimmune inflammation defined by gene targeting. Journal of Experimental Medicine. 186, 1585-1590 (1997).
  24. Krueger, M., et al. Blood-brain barrier breakdown involves four distinct stages of vascular damage in various models of experimental focal cerebral ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35, 292-303 (2015).
  25. Hawkins, B. T., Egleton, R. D. Fluorescence imaging of blood-brain barrier disruption. Journal of Neuroscience Methods. 151, 262-267 (2006).
  26. Graesser, D., et al. Altered vascular permeability and early onset of experimental autoimmune encephalomyelitis in PECAM-1-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 109, 383-392 (2002).
  27. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in Immunopathology. 31, 497-511 (2009).
  28. Owens, T., Bechmann, I., Engelhardt, B. Perivascular spaces and the two steps to neuroinflammation. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 67, 1113-1121 (2008).
  29. Sixt, M., et al. Endothelial cell laminin isoforms, laminins 8 and 10, play decisive roles in T cell recruitment across the blood-brain barrier in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Cell Biology. 153, 933-946 (2001).
  30. Grewal, I. S., et al. CD62L is required on effector cells for local interactions in the CNS to cause myelin damage in experimental allergic encephalomyelitis. Immunity. 14, 291-302 (2001).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

in situC57BL 6

מאמרים קשורים