מאמר שיטה

מידור של תאי גזע האדם הנגזרים בתוך שבבי מיקרופלואידיג פלסטיק מורכבים מראש

DOI:

10.3791/59250

⸱

3 במאי 2019

 ,  ,  ,  , 
1UNC Neuroscience Center, 2UNC/NC State Joint Department of Biomedical Engineering, 3Xona Microfluidics, LLC

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מדגים את השימוש של שבבי microflu, ממדר מיקרופלואידים, הזרקה מחזורית אולפין קופולימר לנוירונים מתורבתים הבדיל מתאי גזע אנושיים. שבבים אלה מורכבים וקלים לשימוש מאשר התקנים ממוזגים פולי (diמתיל siloxane) מסורתיים. מספר תפיסות נסיוניות נפוצות מתוארות כאן, כולל תיוג נגיפי, בידוד פלואידיג, הוספת פיום וכתמים חיסוני.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שימוש במכשירים microflu, כדי למדר נוירונים מתורבתים הפכה לשיטה סטנדרטית במדעי המוח. פרוטוקול זה מראה כיצד להשתמש מראש התאספו שבב רב-ממדי שנעשו מחזורית אולפין (coc) כדי למדר נוירונים הבדיל מתאי גזע אנושיים. טביעת הרגל של שבבי COC אלה זהה לשקופית מיקרוסקופ רגיל והם תואמים באותה מידה למיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה. נוירונים מובלים מתאי גזע האדם העצבי (NSCs) לתוך הנוירונים glutamatergic בתוך השבב ומתוחזק במשך 5 שבועות, המאפשר זמן מספיק עבור נוירונים אלה כדי לפתח את הסינפסות ושעת הדנדריטים. יתרה מזאת, אנו מדגימים הליכים משותפים ניסיוניים מרובים באמצעות אלה שבבי multi-תא, כולל תיוג ויראלי, הקמת מיקרוסביבות, האקסון, ו אימונוטוקוכימיה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תא גזע האדם הבדיל נוירונים (hSC-נוירונים) משמשים יותר ויותר למחקר ביולוגי. נוירונים אלה, אשר ניתן לגזור מחומר המקור האנושי, הם בעלי עניין רב למחקר טרנסלטיות, כולל לימוד של פציעות מוח טראומטי והפרעות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר. לכן, כלים לשיפור ולהקל על המחקר של hSC-נוירונים הם ביקוש.

כדי ללמוד את מורפולוגיה מקוטב ייחודי של נוירונים, חוקרים רבים להשתמש מכשירים מיקרופלואידיג multi-מידור1,2,3,4,5,6, . 7,8,9,10,11 מכשירים אלה מאפשרים מדידות ומניפולציות של נוירונים ארוכים הקרנה עם גישה subcellular ייחודי. מכשירים מיקרופלואידים בעלי מספר רב מורכבים משני תאי מיקרו-פלואידים מקבילים באמצעות מיקרוחריצים, אשר מנחים את הצמיחה המיונלית. נוירונים או תאי גזע עצביים (NSCs) מצופים בתא הסודנדריטי, ולאחר מכן לדבוק בחלק התחתון של משטח התא לאחר דקות. נוירונים הבדיל לצמוח ולהאריך axons שלהם/תחזיות דרך האזור microgroove לתוך תא axons סמוך ומבודד. בעבר, התקנים אלה נעשו באופן בלעדי באמצעות פולי (diמתיל siloxane) (PDMS) דפוס העתק. התקני PDMS יש חסרונות רבים תיאר בעבר12, כולל hydrophobicity מתמשך ואת הצורך להרכיב שמיכות זכוכית מיד לפני השימוש. מורכב מראש הזרקה שבבים להתגבר על רבים מחסרונות אלה נמכרים מסחרית (ראה לוח חומרים)12. התאים של שבבים אלה נעשים לצמיתות הידרופילי והשבב כולו הוא הזרקה יצוק מחזורית שקופה אופטית אולפין (coc).

פרוטוקול זה מדגים כיצד להשתמש בשבב COC זה כדי להבדיל בין NSCs אנושיים לתוך הנוירונים, ולהפריד ולבודד את התחזיות הנוירואליות הארוכות שלהם. עבור הפגנה זו, נוירונים הובלו מאושר NIH תאי גזע H9. הליכים דומים ניתן להשתמש כדי להבדיל בין האדם המושרה pluripotent תאי גזע.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: איור 1A, B מציג סכמטי של שבב ה-coc המורכב מראש, כולל המיקומים של הערוצים הראשיים או התאים, הבארות והמיקרוחריצים. השבב מידור יכול להקים מיקרופיאידים ברורים בתוך תא כמו להפגין על ידי בידוד של צבע צביעה מזון (איור 1C). הפרוטוקול להכנת השבב הרב-ממדי של ההרכבה מראש מוענק בנגנדרן ואח ', סעיף12.

1. ציפוי שבבי מרובת-תאים עבור hSC-נוירונים

הערה: איור 2A מציג מבט כולל על הליכי הציפוי.

  1. התמוססות פולי-L-אורתך במים מזוקקים כיתה התרבות כיתה כדי להפוך את 600 μL של פתרון לכל שבב של 20 μg/mL פתרון העבודה.
  2. . אחרי שהכין את האסימונים מבארות כאשר אתה מורח, לוודא את העצה הפייפט הוא הרחק מפתח הערוץ.
    הערה: הערוצים המיקרופלואידים חייבים להישאר מלאים למשך כל הליך זה. אין לאכול נוזלים מן הערוצים/התאים, רק את הבארות.
  3. טעינת 150 μL של הפתרון העובד של פולי-L – אוראתה בחלק הימני העליון של הבאר. המתן 90 s או עד הנוזל מתחיל למלא את הטוב הימנית התחתונה. הוסף 150 μL של מדיה לימין הימני התחתון והמתן 5 דקות כדי לאפשר לנוזל לעבור דרך מיקרוחריצים.
  4. הוסף 150 μL של מדיה לפינה השמאלית העליונה. לחכות 90 s ולאחר מכן להוסיף 150 μL לימין השמאלי התחתון. עוטפים את מחזיק השבבים עם parafilm ומניחים ב -4 ° c בלילה.
    הערה: לחלופין, הניחו את השבב והמחזיק ב-37 ° c עבור 1 h.
  5. מוריד את המדיה מבארות, ומוודא שהקצה הפתוח של הערוץ ממוקם הרחק מפתח התעלה. הוסף 150 μL של מים עקרים לימין הימני העליון. המתן 90 s ולאחר מכן להוסיף 150 μL לימין הימני התחתון. המתן 5 דקות כדי לאפשר לנוזל לעבור את המיקרוחריצים.
  6. הוסף 150 μL של מים סטרילי לפינה השמאלית העליונה, לחכות 90 s ולאחר מכן להוסיף עוד 150 μL לפינה השמאלית התחתונה.
  7. חזור על שלבים 1.5-1.6.
  8. הפשרת למינציה באיטיות ב-2 ° צ' עד 8 ° צ' והכינו פתרון עבודה של 10 μg/mL.
  9. טען 150 μL של המילמינציה בפתרון העבודה לימין הימני העליון. המתן 90 s או עד הנוזל מתחיל למלא את הטוב הימנית התחתונה. Pipet 150 μL למטה בסדר גמור. המתן 5 דקות כדי לאפשר למילמינציה לעבור את המיקרוחריצים.
  10. הוסף 150 μL של למינציה לפינה השמאלית העליונה. לחכות 90 s ולאחר מכן להוסיף 150 μL לימין השמאלי התחתון. מודקת את השבב בתוך המחזיק שלה 2 h ב 37 ° c.
  11. לשטוף את השבב עם PBS (ללא Ca2 + ו-Mg2 +). טעינת 150 μL של PBS לימין הימני העליון. המתן 90 s או עד הנוזל מתחיל למלא את הטוב הימנית התחתונה. הוסף 150 μL של PBS לימין הימני התחתון והמתן 5 דקות כדי לאפשר ל-PBS לעבור את המיקרוחריצים.
  12. Pipet 150 μL של PBS למעלה השמאלית העליונה. אחרי 90 s pipet 150 μL לשמאל היטב שמאל.
  13. ולאחר מכן לשטוף את השבב עם מדיה המועצה לבטחון לאומי (ראה לוח חומרים). טען 150 μL של מדיה לימין הימני העליון. אחרי 90 s או כאשר הנוזל עובר דרך הערוץ הימני לתוך הטוב הימנית התחתונה, להוסיף 150 μL לימין הימני התחתון. המתן 5 דקות כדי לאפשר לתקשורת לזרום דרך המיקרוחריצים.
  14. הוסף 150 μL של מדיה לפינה השמאלית העליונה ועוד 150 μL לפינה השמאלית התחתונה. מודטה את השבב בחממה 37 ° c עם 5% CO2 כדי לקדם תנאי השבב עד מוכן seed NSCs.
    הערה: ניתן לעשות שבבים ממוזגים ללילה במידת הצורך.

2. זריעת NSCs לתוך השבב הרב

הערה: פרוטוקול זה השתמש NSCs מסחרית רכשה, בניגוד לפרסום הקודם שלנו אשר החלה עם תאים מעובריים אנושיים5. בפרוטוקול זה בתאי גזע עצביים מצופים ישירות לתוך שבבי פלסטיק שבו הם להבדיל לנוירונים. התאים יכולים להיות מותר להתרבות כמו NSCs (ללא בידול) עבור עד 2 מעברים ומאוחסן בבקבוקונים N נוזלי2 לשימוש נוסף. פרוטוקול זה משתמש בבקבוקונים של המועצה לבטחון לאומי המאוחסנים ב-N הנוזל2 לאחר מעבר 1 או 2. איור 2B מציג סקירה של הליכי הציפוי.

  1. הפשרת NSCs על פי הוראות היצרן.
    הערה: הליך זה חל על NSCs H9 נגזר. קווי תאים אחרים ידרשו אופטימיזציה של צפיפות תאים.
  2. לספור את ריכוז התא באמצעות הומוציטוטומטר ולהתאים באמצעות מדיה לבטחון לאומי כדי לקבל ריכוז של 7 x 106 תאים לכל mL.
  3. מחלק מדיה מכל. חלק בשבב הימנע מלאחד מדיות מהערוצים המרכזיים.
  4. Pipet 5 μL של פתרון התא לימין הימני העליון, ואחריו 5 μL לימין התחתון טוב (70,000 הכולל תאים). ודא שהתאים מתצינורות לעבר פתחי הערוץ הראשי. השתמש במיקרוסקופ כדי לבדוק שתאים נכנסו לערוץ. לחכות 5 דקות לתאים לדבוק בחלק התחתון של השבב.
    הערה: ניתן להשתמש בשני התאים או בשניהם כדי לטעון תאים.
  5. Pipet ~ 150 μL של מדיה לבטחון לאומי לימין הימני העליון ולאחר מכן 150 μL לימין הימני התחתון. . חזור על הצד השמאלי דגירה ב 5% CO2, 37 ° c בתוך מיכל לחות מתאים מחולל.
  6. לאחר 48 שעות, מחלק את התקשורת המועצה לבטחון לאומי מן הבארות ולהחליף עם התקשורת בידול עצבי על ידי הוספת 150 μL לכל הטוב בראש כל היטב בתחתית.
  7. תרבות נוירונים ברדיוס של 5% CO2, 37 מעלות בחממה בתוך מיכל לחות מתאים.
    הערה: יש להחליף את המדיה כל 2-3 ימים. בגלל הכרכים הקטנים המשמשים את השבב, אידוי גם בתוך החממה מחולל לחות יכול להשפיע באופן משמעותי על הכדאיות התא. השתמשו במיכל משני מתאים כדי לספק לחות נוספת לתרבות ארוכת טווח של תאים עם השבב (ראו טבלת חומרים).

3. ויראלי תיוג פלורסנט של hSC-נוירונים בתוך השבב

הערה: וירוס מרובים ניתן להשתמש כדי לתייג נוירונים בתוך השבב. הוראות שלהלן מתארות את השימוש ב-G-כלבת-מדובדבן או בווירוס-eGFP. חומרים מדבקים העלולים להיות מטופלים על פי הכללים והתקנות הישימים, ועשויים לדרוש הכשרה נוספת ואישור מוסדי.

  1. חם ~ 400 μL של מדיה בידול עצבי חדש לכל שבב ל 37 ° c.
  2. הסר 50 μl של מדיה מבאר אחת של תא אקסון לתוך שפופרת צנטריפוגה ולאחר מכן להוסיף 100,000 יחידות ויראליות של וירוס כלבת שונה לצינור.
    הערה: כראוי להיפטר בילה טיפים pipet וצינורות צנטריפוגה המכיל וירוס.
  3. הסירו את מדיית הבידול העצבית הנותרת מהתא האקונאלי והניחו לצינור הצנטריפוגה. חנות ב37 ° c.
    הערה: ודא שהערוצים נותרים מלאים בנוזל.
  4. מערבבים את 50 μL של פתרון וירוס עם 150 μL של מדיה מחומם. Pipet 100 μl אחד היטב של תא אקסון ו 100 μl אל האקסון השני היטב. המשך 2 שעות בתוך החממה 37 ° c.
    הערה: ההבדל באמצעי האחסון בין התאים האקונאליות ובתאי הסומטיים מסייע להבטיח שהוירוס יישאר בתא האקונאליות בזמן הידבקות/דגירה.
  5. נסיגה והיפטר ממדיה המכילה וירוסים.
    התראה: אין להסיר נוזלים בתוך ערוצי המיקרו-פלואידים הסגורים.
  6. בעדינות pipet 75 μl של מדיה טרייה אחד אקסון תא היטב ולתת את זרימת התקשורת דרך הערוץ לתוך אקסון אחרים היטב.
  7. הסר מדיה מהתא אקסון והיפטר כראוי.
  8. חזור על שלבים 3.6 ו-3.7.
  9. מלא את תא ה-אקסון במדיה השמורה. Pipet נוסף 50 μL מדיה טרייה, במידת הצורך, ולאחר מכן להחזיר את השבב לחממה. מדיה חדשה נוספת היא לספור לקראת אובדן התקשורת במהלך העברה נוזלית והתאיידות במהלך התהליך.
    הערה: תיוג פלורסנט גלוי באמצעות אלה וירוסים ששונו כלבת מתרחשת על ידי 48 h ועד 8 ימים לאחר איזה תא מוות של נוירונים נגועים בדרך כלל מתרחשת עקב רעילות וירוסים. הדמיה תא העצב ניתן לבצע כמו בפלטפורמות אחרות התרבות הסטנדרטית (למשל, זכוכית מנות בתחתית), אבל שיקול מיוחד נדרש כדי לשמור על לחות מספקת כדי למנוע הפסדים התטיבי.

4. בידוד פלואידיק, פיום וכתמים בתוך השבב

  1. עקוב אחר בידוד פלואידיק, הפיום והמעבד החיסוני עם השבב כפי שמתואר בניונדרזו ואח '12.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאחר שבוע אחד (7-10 ימים) בשבב עם בידול מדיה, NSCs להבדיל לנוירונים ותחזיות עצבי להיכנס לתוך תא סיבי (איור 3). בתוך השבב, נוירונים לצרף ולהפיץ באופן שווה בתוך התא הסומטית. בהשוואה, נוירונים בתוך התקנים PDMS הקמת/צבירה מוקדם ככל 5 ימים תוספת ההודעה של בידול מדיה, המוביל בריאות התא נפרץ כפי שניתן לראות באיור 3B (יום 13 התמונה המוגדל). נוירונים בצ נראים בריאים עם axons ארוזות. נוירונים בריאים ניתן לשמור בתוך האסימונים עבור 4-5 שבועות.

כדי להמחיש התבגרות העצב ופיתוח עמוד השדרה הדנדריטי, וירוס כלבת שונה נמסר לעבר תא סיבי ביום 29 כדי התוויות הנוירונים נסיגה, כולל שדרה הדנדריטים, עם חלבון פלורסנט mcherry. ארבעה ימים לאחר זיהום וירוס הכלבת, נוירונים הארכת אקסונים לתוך תא אקסונים הביע mcherry. הנוירונים ב33 היום הראו היווצרות של השדרה הדנדריטי (איור 4). ויזואליזציה של השדרה הדנדריטי מראה כי הנוירונים המועצה הבין לאומי נגזר הבדיל בתוך השבבים בוגרים טופס.

השבב הרב-ממדי מתאים גם ללוקליזציה של כימיה חיסונית כדי להמחיש את ההתאמה התאית של חלבונים. לאחר 26 ימים של שמירה על נוירונים בחומרי הבחנה, הנוירונים סומנו לסמן הסינפטית הvGlut1 (איור 5). תוצאות אלה מראים כי virally התווית הנוירונים שיתוף לוקליזציה עם vGlut1 (איור 5E) ו תא העצב סמן ספציפי, β-טובולין III (איור 5E-H).

היכולת ליצור מיקרוסביבות שונות מבודדים לאקסונים הפגינו גם באמצעות אלקסה Fluor 488 הידרזידה, צבע פלורסנט נמוך במשקל מולקולרי (איור 6).

מחקרי הפציעה axon מבוצעים בדרך כלל בתוך מכשירים מידור. הוכחה של ניסוי עקרוני בוצעה באופן סלקטיבי לפגוע אקסונים של נוירונים הבדיל עם שבב coc התאספו מראש (איור 7). התוצאות היו שוות ערך למכשירים מידור סיליקון6,13,14.

figure-results-1
איור 1: ה-COC התאספו מראש, שבב מיקרופלואידיג רב-ממדי. (א) ציור של השבב המזהה את הבארות העליונות והתחתונות. גודל השבב הוא 75 mm x 25 מ"מ, בגודל של שקופיות מיקרוסקופ רגיל. (ב) אזור מוגדלת המציג את הערוצים והמיקרוחריצים המפרידים בין הערוצים. פרטים נוספים מסופקים בנינדרדרן ואח '12. (ג) צילום זה ממחיש את היצירה של מיקרוסביבות מבודדות בתוך כל תא באמצעות צבע צביעה מזון. . כל הדמות הזו שושנה מ -12 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: ציפוי שבב ממדר פלסטיק והציפוי של תאים למועצה לבטחון לאומי. (א) שבבים מרובי פלסטיק היו מצופים בתמיסה טרום-ציפוי, ולאחר מכן פולי-אל-אורתך ולמינציה לפני התניה מראש עם מדיה של המועצה לבטחון לאומי. (ב) NSCs מצופים עם 7 x 104 תאים בתא הסומטיים של השבב. התאים גדלו בתקשורת של המועצה לבטחון לאומי במשך 24 שעות ואז התקשורת הוחלפה בתקשורת הבחנה עצבית. נוירונים הבדיל נצפו על ידי 7-10 ימים לאחר בידול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: השוואת הגדילה hSC-תא השוואה ב אסימונים ו-PDMS התקנים. (א) תמונת חדות פאזה של hsc-נוירונים גדל 13 ימים לאחר בידול שבב מרובה הפלסטיק. (ב) מוגדלת באזור של hsc-נוירונים תרבותי בתוך התיבה הלבנה (א) ואזור שווה ערך בתוך מכשיר pdms (מימין). hSC-נוירונים בתוך האסימונים לצרף היטב. הטופס מצטבר אשכולות בהתקנים מבוססי PDMS. נציג 2 ניסויים עצמאיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: הנוירונים לבטחון לאומי הנגזרים מראים מורפולוגיה של עמוד השדרה הדנדריטים. רטרוגרדי בעלי תווית של תא עצב mCherry בבידול יום 33 גדל בתוך השבב. האזור המוגדל המתואר באדום, מדגיש את הנוכחות של הקוצים הדנדריטים, אשר מספקים ראיות התומכות בפיתוח של הסינפסות glutamatergic בוגרת. החיצים האדומים מצביעים. לעבר השדרה הדנדריטית אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: האדם המועצה לבטחון לאומי הנגזרת מהנוירונים המתורחיים בתוך התצוגה הסינפסות. כתמים בוצע בבידול יום 26. הדמיה של תא העצב בוצעה בתוך תא הסומטיים. A) vGlut1 (ירוק) ו-(ב) dapi (כחול) האימונואולבלינג. (ג) משתמשים בנגיף הכלבת המסומן בווירוס שהשתנה. (ד) מיקרוגרף פלורסנט ממוזג של (A-C). (ה) השדרה הדנדריטית ו vGlut1 חיובי מקומי עם הדנדריטים mcherry-חיובי, המוצג באזור מוגדלת מ (ד). מיקרוגרפים מבוססי מיקרו-גרף (F) תא מיוחד סמן, β-טובולין III (מגנטה) ו (G) vGlut1 (ירוק). (ח) כיסוי של β-טובולין III ו-vGlut1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6: התמרה וסתית ' מהנוירונים מרחיבים את התחזיות לתוך מיקרו-סביבה מקומית הוקמה בתוך שבב COC התאספו מראש. (A) מצ התווית תא העצב להאריך אקסונים דרך מיקרוחריצים של השבב לתוך האקסון מבודד תא. בידוד של תא אקסון הוא דמיינו באמצעות אלקסה fluor 488 הידרזידה. הדמיה של נוירונים התרחשה בבידול יום 26 ו 3 ימים לאחר הידבקות עם וירוס כלבת שונה. (ב) התמונה הפלואורסצנטית ב (א) ממוזגת עם תמונה DIC. שים לב למיקום המיקרו-חריצים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7
איור 7: האקפיום מבוצע בתוך שבב מרובת התאים של COC. (א) מצ'רי הנקראת נוירונים ב33 היום היתה התמונה לפני הפיום. שולחן המראה של ' אש ' בצבע. (ב) מיד לאחר הפיום, מראה שאקטונים נותקו לחלוטין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

שבבים פלסטיים מרובי-תאהתקנים מרובי-מחלקה של PDMS
בידוד אקטונסבידוד אקטונס
יצירת סביבות מיקרויצירת סביבות מיקרו
אקאוטומיזציה לנוירוניםאקאוטומיזציה לנוירונים
שקוף בצורה אופטיתשקוף בצורה אופטית
תואם לדימות ברזולוציה גבוההתואם לדימות ברזולוציה גבוהה
תואם למיקרוסקופיה פלואורסצנטיתתואם למיקרוסקופיה פלואורסצנטית
התאספו במלואוהרכבה למצע הדרוש
אקסונים בריאים > 21 ימיםאקסונים בריאים > 14 ימים
משטח culturing הידרופיליידרופוביות
גז אטוםניתן לחדור לגז
מיקרוחריצים וערוצים מעוגליםמיקרוחריצים ישרים
לא תואם אבלציה לייזרניתן להשתמש עבור אבלציה לייזר כאשר התאים PDMS מורכבים על שקופיות תואם אבלציה לייזר מיוחד.
אין אפשרות לשנות את ההתקן כדי להסיר את החלק העליוןהעליון הוא נשלף לצביעת בתוך מיקרו-חריצים
לא תואם שמני טבילה מבוססי שמן מינרלים (שמנים מבוססי סיליקון הם בסדר)תואם שמני טבילה מבוססי שמן מינרלי
בלתי מסוגל למולקולות קטנות וממיסים אורגנייםספיגת מולקולות קטנות & ממיסים אורגניים
אין בעיות דליפה עם השבבציפוי בעזרת פולי אל אורתך ולמינציה להפוך את המכשירים לדליפה
נוירונים הבדיל להישאר מופץ באופן שווה (> 4 שבועות) בצפיפויות התא נבדקנוירונים הבדיל מתחילים לצבור אחרי 3-4 ימים בתרבות בצפיפויות התא נבדק

טבלה 1: השוואת שבבי COC מרובי-תאים ומתקני סיליקון לנוירונים בתפירה

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שבב COC מראש multi-תא הוא קל לשימוש הפלטפורמה מידור כדי להבדיל ולשמור על האדם NSCs לתוך נוירונים לטווח ארוך (> 4 שבועות). בפרוטוקול זה, אנו מדגימים את הבידול של האדם NSCs לתוך הנוירונים glutamatergic, לעצב העצב הרטרוגרדי, לבצע החיסונית, הדמיה מורפולוגיה של עמוד השדרה הדנדריטי ולבצע היפוך. שבבים אלה תואמים הדמיה ברזולוציה גבוהה, אין פלואורסצנטית אוטומטי עם COC12.

COC שבבי multi-תא הם שווי מבחינה פונקציונלית התקנים ממוזגים מבוססי סיליקון, ויש להם יתרונות וחסרונות כמתואר בעבר12. טבלה 1 משווה שבבי coc מרובי-תאים והתקני סיליקון עבור Culturing hsc-נוירונים. שבבי COC ממדר מספקים משטח הידרופילי טוב יותר להחזקה ואחזקה של תאי גזע לאורך תקופת תרבות ארוכה. התקנים מבוססי PDMS צריך להיות מורכב ומצורף כיסוי זכוכית. הטבע ההידרופובי של התקני PDMS גורם לצבירת תאי גזע5; זה מוביל את שני האתגרים בהדמיה ברמה התאית ורגישות גבוהה יותר לנזק פיזי עקב התנועה של אגרגטים תאים במהלך שינויי מדיה. שבב הפלסטיק גובר על האתגרים הללו. COC הוא אטום גז, בניגוד PDMS, כך האוויר כיסים לכודים או נוצר בתוך הערוצים יש להסיר על ידי המשתמש. הפתרון טרום ציפוי מפחית את האפשרות אוויר להיות לכוד בערוצים. פתרון זה כולל אתנול וסוכנים אחרים. פרוטוקול שפורסם בעבר עבור נוירונים culturing מורטין בתוך שבבי פלסטיק אלה מספק פרטים נוספים על ליטוף תאים ומדיה בתוך האסימונים12. NSCs הם שבריריים יותר כי נוירונים מורטין, כך יש לטפל בעדינות רבה יותר. זה גם קריטי לערבב את תאי הגזע ביסודיות לפני ציפוי על ידי מלטף אותם בעדינות למעלה ולמטה.

השימוש בנוירונים הנגזרים מתוך הבדיל בתאי גזע האדם הופך להיות פופולרי יותר ויותר ברפואה ובמחקר. נוירונים אלה חשובים עבור מחקר ויישומים קליניים עבור הפרעות המוח הרבות, כולל מחלות ניווניות ופציעות מוחית טראומטית. הנוירונים האלה דומים מאוד. לנוירונים העוברי אדם15 בעתיד, הנוירונים בגילאי כראוי יכול להיווצר מתאי גזע לחקות פונקציה עצבית הקשורים לגיל ומשמש בשילוב עם המכשירים האלה מידור. התקנים אלה יקל על המחקר במחלות המשפיעות על בריאות ותפקוד של אקסון כגון ליקויים אקסון הנוירונים של חולים שאובחנו עם הפרעות ספקטרום האוטיזם התחדשות אקסון לאחר פציעה16,17.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פ מ ו-T.N. לא מצהירים על אינטרסים פיננסיים מתחרים. סמנכ ל הוא עובד של Xona מיקרופלואידיקה, LLC. J.H. הוא חבר של Xona מיקרופלואידיקה, LLC. A.M.T. הוא ממציא של קאמרית/שבב מיקרופלואידים (ארה ב 7419822 B2, אריתרופואיטין 2719756 B1) והוא חבר של Xona מיקרופלואידיקה, LLC.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מכירים את התמיכה של Xona Microfluidics LLC, המכון הלאומי לבריאות הנפש (R42 MH097377), ואת המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות שבץ (R41 NS108895, P30 NS045892). התוכן הינו באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את ההשקפות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Alexa Fluor hydrazide 488ThermoFisher ScientificA10436
נוגדנים משניים של Alexa FluorThermoFisher Scientific1:1000
anti_beta-tubulin IIIAvesTUJ1:1000
נוגדן anti-vGATSynaptic Systems131 0031:1000
נוגדן anti-vGlut1NeuroMab75-066שיבוט N28/9, 1:100
מדיה מלאה של תאי גזע עצביים:
  REC EGF
10 UG BIOSOURCE (TM) 		ThermoFisher ScientificPHG031420ng/mL 
REC HU FGF BASIC
10 UG BIOSOURCE (TM) 		ThermoFisher ScientificPHG002420ng/mL 
תוסף GlutaMAX (100X)ThermoFisher Scientific350500612mM 
נוקאאוט DMEM/F-12ThermoFisher Scientific 
תוסף עצבי StemProThermoFisher ScientificA10508012%
מערכת הדמיה אפיפלואורסצנטיתEVOS מערכת הדמיה פלואורסצנטיתAMF4300פלואורי אובייקטיבי 10x
אמריקאי Durafilm50A0.5 מיל עובי
פלואורומאונט GThermoFisher Scientific00-4958-02
Gibco DPBS ללא סידן ומגנזיוםThermoFisher Scientific14190144
ערכת GIBCO HUMAN NSC (H9) ערכה
משולבת
 
 		GibcoN7800200
Gibco LamininThermoFisher Scientific23017015
פיפטות פסטר זכוכיתSigma-AldrichCLS7095D5X SIGMAבאורך 5.75 תאי
גזע עצביים HU שמקורם ב-H9
1E6 תאים/בקבוקון; 1 מ"ל 		ThermoFisher Scientific510088
Hibernate-E MediumThermoFisher ScientificA1247601
Incubator, 5% CO2 37 & deg; C
מערכת הדמיה קונפוקלית סריקת לייזראולימפוסFV3000RS 30x שמן סיליקון אובייקטיבי
שונה וירוסהכלבת מכון סאלק למחקרים ביולוגייםG-deleted Rabies-eGFPהסכם העברת חומרים נדרש
מר פרוסטי ThermoFisher Scientific5100-0001
Neural Differentiation mediaPer 100 mL. 
אנטיביוטיקה-אנטי-פטריית (100x)ThermoFisher Scientific152401121 מ"ל (100X)
חומצה אסקורביתסיגמא אולדריץ'A8960200mM 
BDNFThermoFisher ScientificPHC707440 ננוגרם/מ"ל 
תוסף תזונה Gibco B27 Plus (50X)FisherScientificA35828012 מ"ל (50X)
תוסף תזונה Gibco CultureOne (100X) FisherScientificA33202011 מ"ל (100X)
Gibco Neurobasal PlusMedium FisherScientificA3582901
StemPro Accutase Cell Dissociation ReagentThermoFisher ScientificA1110501
Taylor Wharton Liquid N2 dewarFisherScientific20HCB11M
triton X-100ThermoFisher Scientific28314
ציפוי מקדים XC Xona Microfluidics, LLCXC Pre-Coatכלול ב-XonaChips
XonaChipXona Microfluidics, LLCXC450450 ומיקרו; מגש מכשיר אדים מחסום מיקרו-חריץ באורך m
מגש מכשירXona Microfluidics, LLC
12660012 סרט אתילן פרופילן אדים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. Axonal translation of beta-catenin regulates synaptic vesicle dynamics. The Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).
  2. Virlogeux, A., et al. Reconstituting Corticostriatal Network on-a-Chip Reveals the Contribution of the Presynaptic Compartment to Huntington’s Disease. Cell Reports. 22 (1), 110-122 (2018).
  3. Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
  4. Pinto, M. J., et al. The proteasome controls presynaptic differentiation through modulation of an on-site pool of polyubiquitinated conjugates. The Journal of Cell Biology. 212 (7), 789-801 (2016).
  5. Bigler, R. L., Kamande, J. W., Dumitru, R., Niedringhaus, M., Taylor, A. M. Messenger RNAs localized to distal projections of human stem cell derived neurons. Scientific Reports. 7 (1), 611(2017).
  6. Nagendran, T., et al. Distal axotomy enhances retrograde presynaptic excitability onto injured pyramidal neurons via trans-synaptic signaling. Nature Communications. 8 (1), 625(2017).
  7. Van Laar, V. S., et al. Evidence for compartmentalized axonal mitochondrial biogenesis: Mitochondrial DNA replication increases in distal axons as an early response to Parkinson's disease-relevant stress. The Journal of Neuroscience. , (2018).
  8. del Río, J. A., Ferrer, I., Gavín, R. Role of cellular prion protein in interneuronal amyloid transmission. Progress in Neurobiology. 165-167, 87-102 (2018).
  9. Jia, L., et al. MiR-34a Regulates Axonal Growth of Dorsal Root Ganglia Neurons by Targeting FOXP2 and VAT1 in Postnatal and Adult Mouse. Molecular Neurobiology. , (2018).
  10. Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses. Neuron. 66 (1), 57-68 (2010).
  11. Menon, S., et al. The E3 Ubiquitin Ligase TRIM9 Is a Filopodia Off Switch Required for Netrin-Dependent Axon Guidance. Developmental cell. 35 (6), 698-712 (2015).
  12. Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons. Journal of visualized experiments : JoVE. (141), (2018).
  13. Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
  14. Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).
  15. Oh, J. H., Jung, C. R., Lee, M. O., Kim, J., Son, M. Y. Comparative analysis of human embryonic stem cellderived neural stem cells as an in vitro human model. International Journal of Molecular Medicine. 41 (2), 783-790 (2018).
  16. Lazar, M., Miles, L. M., Babb, J. S., Donaldson, J. B. Axonal deficits in young adults with High Functioning Autism and their impact on processing speed. Neuroimage Clinical. 4, 417-425 (2014).
  17. DePaul, M. A., Lin, C. Y., Silver, J., Lee, Y. S. Combinatory repair strategy to promote axon regeneration and functional recovery after chronic spinal cord injury. Scientific Reports. 7 (1), 9018(2017).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Human Stem Cell NeuronsMicrofluidic Chip CompartmentalizationCyclic Olefin Copolymer ChipsNeural Differentiation ProtocolViral Labeling ProcedureAxotomy TechniqueImmunocytochemistry MethodGlutamatergic Neuron CultureSynapse Development AnalysisDendritic Spine Formation

מאמרים קשורים