הרכבה של Nanorods זהב לתוך כיראלי Metamolecules Plasmonic באמצעות תבניות אוריגמי דנ א

ה-DNA nanostructures, ה-DNA אוריגמי בפרט, היה בשימוש נרחב כדי לארגן מולקולות ורכיבים אחרים ננו (למשל, חלבונים ו חלקיקים [NPs]), בדייקנות ננומטר לתוך גיאומטריות כמעט שרירותי^{1,2 , 3 , 4 , 5}. היכולת לארגן NPs מתכת על ה-DNA אוריגמי תבניות עם תשואה גבוהה, דיוק מאפשר הזיוף של מבנים plasmonic עם מאפיינים אופטיים חדשניים^{6,7,8, 9 , 10}. דנ א אוריגמי טכניקה שימושית במיוחד עבור הדור של כיראלי מבנים plasmonic, אשר דורשים ארכיטקטורות באמת תלת מימדי^{11,12,13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20}.

פרוטוקול זה מתאר בפירוט את התהליך כולו של הזיוף של מכלולים כיראלי אוריגמי תבניות DNA של AuNRs. תוכנת עיצוב²¹ והוא מבנה חיזוי^22,23 של ה-DNA אוריגמי היא זמינה בחופשיות האינטואיטיביים. אוריגמי פבריקציה נוספת של סינתזה AuNR להשתמש נפוצות ציוד מעבדה בביוכימיה (למשל, thermocyclers, בג'ל, פלטות חמות, צנטריפוגות). המבנים מאופיינים בעזרת ספקטרוסקופיית TEM ו- CD רגיל.

הזיוף של nanostructures plasmonic דומה עם שיטות מלמעלה (למשל, ליתוגרפיה קרן של אלקטרונים) ידרוש ציוד יקר ומסובך למדי. בנוסף, ה-DNA אוריגמי תבניות מספקים את האפשרות לשלב reconfigurability מבנית הרכבות plasmonic^{24,25,26,27,28,29 ,30,31,32,33}, אשר הוא מאוד מאתגר עבור מבנים מפוברק עם טכניקות הדפס אבן. לעומת אחרים גישות מולקולריות^34,35,36,37, DNA מבוסס-אוריגמי פבריקציה נוספת מספק רמה גבוהה של דיוק המרחבית ויכולת תיכנות.

1. עיצוב של אוריגמי דנ א

1. זהה את הסידור המרחבי היחסי הרצוי של AuNRs ואת הצורה המתאימה של ה-DNA אוריגמי תבנית (איור 1א'). מעריכים את הפרמטרים מבנית של AuNRs של ואת התבניות אוריגמי. לאתר את מיקומם המשוער של סיכות זה נדרשים שינויים (איור 1B) נוספים.
2. הורד והתקן caDNAno¹⁸ כדי לעצב תבנית ה-DNA אוריגמי. ב- caDNAno, הובל לגרדום והידוק הגדילים בהתאם לצורה הרצויה של התבנית וצור את רצף רצועות הידוק על ידי לחיצה על הכלי Seq. לחץ על צבע כלי ולסמן הגדילים סיכות הדורשות בהמשך השינוי (איור 1C).
3. לחצו על כלי ייצוא לייצא רצפי דנ א סיכות (איור 1C) לקובץ csv.
4. עיצוב כפול גדילי מנעולים לתקן את זווית Θ בין שתי חבילות אוריגמי. בהתאם הכיוון היחסי של שתי חבילות, הבונה אוריגמי יכול להסתגל שמאל - או ימינה - handed (LH/לחות) כיראלי תצורת המרחב (איור 1B).
5. ייבוא הקובץ. csv של סיכות מהדק לתוך יישום גליונות אלקטרוניים. הוסף₁₀ תיקים עשויים רצף בסוף סיכות מהדק המשמש להרכבה AuNR (נקודות אחיזה). לשנות את הגדילים סיכות באתרים מעוצב נעילה עם מנעול רצפי.
   הערה: ההרכבות בתוצאות נציג להכיל 36 נקודות אחיזה בולטות בקצה 3' של גדילי סיכות, 18 על תתי אוריגמי דנ א, מופץ באופן שווה על שני מקבילים helices כל 21 nt. המרחק בין הראשונים ואת המיקום האחיזה האחרון הוא 168 nt, כ 57 nm (ראה קובץ מצורף caDNAno).

2. הרכבה של התבניות אוריגמי דנ א

1. להכין מלאי עבודה של מצרך גדילי (SM), לרבות גדילי עם ידיות מנעולי, על ידי ערבוב כמויות שוות של ריכוז מנורמל סיכות oligonucleotides (למשל, 100 מיקרומטר).
   הערה: אוריגמי מבנים מכילים בדרך כלל כמה מאות רצועות הידוק. סיכות נרכשים בדרך כלל מספקי המתמחה סינתזה כימיים של הדנ א oligonucleotides ב multiwell (למשל, 96-ובכן) צלחות.
2. עבור µL 500 של אוריגמי nM 10, מערבבים 50 µL של טריס-EDTA (טה, 10 x), µL 100 MgCl₂ (100 מ מ), µL 25 של NaCl (100 מ מ), µL 175 של H₂O, 100 µL של SM (0.5 מיקרומטר), 5 µL של מנעול קווצות (5 מיקרומטר) , ואת לפיגום 50 µL (100 ננומטר).
3. Anneal את התערובת ב thermocycler מ- 80 ° C עד 20 ° C כפי שמתואר בטבלה 1.

3. דנ א אוריגמי טיהור

הערה: סעיף זה מתאר את פרוטוקול agarose ג'ל לטיהור. ה-DNA אוריגמי תבניות אפשר גם לטהר באמצעות גישות אלטרנטיביות^38,39.

1. עבור 1% ג'ל, להמיס 1g של agarose ב- 100 מ של טריס-בוראט-EDTA (TBE, 0.5 x) על ידי חימום התערובת בתנור מיקרוגל. להוסיף 10 µL של 10,000 x DNA כתם בהתאם למפרט הכתם. כדי למזער את החשיפה לאור UV בשלב החילוץ (שלב 3.6), השתמש כתם DNA זה להיות visualized תחת עירור כחול.
2. הפתרון עד כ 40 ° צלזיוס וחותכים לאט להוסיף 1 מ"ל של MgCl₂ (1.3 M) תוך טלטול. הטלת ג'ל, תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר.
3. הגדר שההתקן אלקטרופורזה ויוצקים מאגר זורמים קרים (4 ° C) (0.5 x TBE עם 11 מ"מ MgCl₂) לתוך תיבת ג'ל. הצב את תיבת ג'ל באמבט מי קרח.
4. להוסיף טעינת מאגר דגימות אוריגמי (6 x טעינת מאגר מכיל 15% polysucrose 400 ו 0.25% bromophenol כחול במים). לטעון את הדגימות לתוך הבארות עם אמצעי אחסון נאות לפי המסרק בשימוש (למשל, 50 µL עבור פיזור 8-ובכן 1.5 מ מ עובי).
5. הפעל את אלקטרופורזה כבר שעתיים 80 V.
   הערה: כדי לאפיין את אוריגמי ולהפריד את מבנה פתוחים וסגורים, השתמש 2% ג'ל במקום 1%, להאריך את זמן הריצה ל 4 שעות.
6. תמונה את הג'ל עם הצלם ג'ל (איור 2). השתמש transilluminator אור כחול כדי להמחיש הלהקות, לחתוך את הלהקה אוריגמי, לרסק את הג'ל על מצלמות-מיקרוסקופים ולחלץ את הנוזל. התשואה השחזור הוא כ-40%.
7. Pipette את הנוזל לתוך יחידה צנטריפוגלי מסנן ומדידת הספין-x 3000 g עבור 5 דק קליטתם של הפתרון אוריגמי-260 ננומטר עם ספקטרומטר הגלוי סגול (UV-VIS). מעריכים את הריכוז של אוריגמי באמצעות מקדם של הכחדה של 1.3 x 10⁸ ז^-1·cm^-1.
   הערה: הריכוז טיפוסי של אוריגמי פתרון לאחר agarose ג'ל לטיהור הוא 1-2 ננומטר.
8. אחסן את התבניות אוריגמי מטוהרים ב 4 ° C לשימוש מאוחר יותר.

4. סינתזה של nanorods זהב

הערה: הפרוטוקול עבור סינתזה AuNR מותאמת מן הספרות הקודם⁴⁰ עם שינויים מזעריים.

1. לשטוף את כל כלי זכוכית עם aqua regia במשך 5 דקות, לשטוף אותו במים, sonicate אותו עם מים הנדסה גנטית, לייבש אותו לפני השימוש.
2. להכין 0.2 מ' hexadecyltrimethylammonium ברומיד (CTAB), 1 מ HAuCl₄, 4 מ מ AgNO₃, 64 מ מ L (+)-חומצה אסקורבית, ו 6 מ"מ NaBH₄. להשתמש במים קרים (4 ° C) להמיס NaBH₄ לשמור אותו במקרר ב 4 º C. חומצה אסקורבית שהפתרון צריך להיות מוכן טרי.
   התראה: CTAB. הוא דבר מסוכן במקרה של מגע עם העור (גירוי), קשר עין (גירוי), בליעה, שאיפה ללבוש ביגוד מגן מתאים. במקרה של אוורור לא מספיק, ללבוש ציוד הנשימה מתאים. NaBH₄ הוא מאוד מסוכן במקרה של מגע עם העור (גירוי), קשר עין (גירוי), בליעה, אינהלציה. ללבוש משקפי הפתיחה, חלוק מעבדה, כפפות, ומאושפז אדים ואבק. הקפד להשתמש מכונת ההנשמה אישרה/מוסמך או שווה ערך.
3. להכין זרעים Au.
   1. להוסיף 500 µL של CTAB (0.2 מ'), 250 µL של מים הנדסה גנטית, µL 250 HAuCl₄ (1 מ מ) לתוך בקבוקון זכוכית. מערבבים במהירות של סל ד 450 בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
   2. להגביר את קצב מלהיב עד 1200 סל ד. להוסיף 100 µL NaBH קר₄ פתרון (6 מ מ, 4 ° C). אחרי 2 דקות, לעצור את ערבוב של דגירה הפתרון באמבט מים ב 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפני השימוש.
4. להכין את AuNRs.
   1. להמיס 0.55 g של CTAB ו- 0.037 גרם חומצה 2, 6-dihydroxybenzoic 15 מ"ל של מים חמים (60-65 מעלות צלזיוס) בבקבוקון סיבוב המדרגה. לקרר את הפתרון של 30 מעלות צלזיוס, להוסיף µL 600 AgNO₃ (4 מ מ), ומערבבים -450 סל"ד למשך 2 דקות. אז תעזוב את הפתרון ללא הפרעה במשך 15 דקות ב- 30 ° C.
   2. להוסיף 15 מ"ל של HAuCl₄ (1 מ מ) הפתרון, ומערבבים במהירות של סל ד 450 במשך 15 דקות להוסיף 120 µL של L (+)-חומצה אסקורבית (64 מ מ), ו ואז, באופן מיידי, מערבבים-1,200 סל ד עבור 30-ס' 12 להוסיף µL של זרעים Au, וערבבו -1,200 סל ד ל 30 s.
   3. דגירה הפתרון באמבט מים ב 30 מעלות צלזיוס במשך 18 h. לא להפריע הפתרון ולהשתמש כובע כדי לסגור את הבקבוק.
   4. הפתרון הנובעת להעביר צינורות צנטריפוגה ולאחר צנטריפוגה ב 9,500 x g למשך 12 דקות ב 20 º C. למחוק את תגובת שיקוע, לפזר בגדר ב- 20 מ ל מים הנדסה גנטית, ולבצע צנטריפוגה בצעד אחד.
   5. לפזר בגדר הסופי ב- 3 מ ל מים מזוקקים. מעריכים את הריכוז של AuNRs מ- UV-VIS הקליטה מדידה באמצעות המקדם הכחדה התהודה פלזמון האורך. ניתן לחזות את מקדם הכחדה באמצעות פרמטרים של צורה AuNR⁴¹. אחסן את AuNRs ב 4 ° C לשימוש נוסף.

5. functionalization של nanorods זהב עם דנ א חד גדילי

הערה: סעיף זה מתאר את פרוטוקול AuNR functionalization עם דנ א חד גדילי (ssDNA), עוקב התוואי כביכול pH נמוך מ ספרות הקודם⁴². AuNRs מכוסה עם ה-DNA וגופם מטוהר באמצעות צנטריפוגה; לחלופין, הטיהור יכול להתבצע באמצעות agarose בג'ל.

1. דגירה µL 20 של גדילי DNA תיול-functionalized polyT (1 מ"מ) עם µL 20 של טריות tris(2-carboxyethyl) הידרוכלוריד פוספין (TCEP, 14 מ מ) עבור h 1 להפחתת חוב דיסולפידי.
   הערה: טופס קבוצות תיול אג ח עם AuNRs, הרצף polyT hybridizes עם ידית₁₀ תיקים עשויים על אוריגמי, שבו זוגות בסיס מדי או מעט מדי עלול לגרום תקלה או הרכבה לא יציב.
   התראה: TCEP יכול לגרום כוויות חמורות העור ונזקי עין. ללבוש כפפות מגן/מגן בגדים/עין הגנה/הפנים הגנה.
2. תערובת 150 µL של AuNRs (10 ננומטר) ו- µL 40 של שטופלו TCEP תיול-DNA (0.5 מ מ). להוסיף 1% dodecyl נתרן גופרתי (מרחביות) הפתרון AuNR להגיע ריכוז מרחביות הסופי של 0.05%. להתאים את ה-pH ל- 2.5-3 עם ~ 1 µL של HCl (1 מ').
3. תקופת דגירה של 2 h תוך טלטול-סל ד 70.
   הערה: היחס AuNR-ל-DNA צריך להיות מסודר לפי 1:5, 000-15,000, בהתאם לגודל של המוטות. עבור AuNRs (70 nm x 30 ננומטר) הכין הפרוטוקול המתואר בסעיף 4, 13,000 עודף של תיול-DNA הוא המומלץ הבא.
4. הוסף NaCl כדי להגיע עם concertation NaCl הסופי של 0.5 M, דגירה במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר תוך כדי טלטול-סל ד 70.
   הערה: שינוי צבע בשלב זה עשוי לציין functionalization כושל של DNA.
5. להתאים את ה-pH ל ~8.5 עם מאגר TBE (10 x), דגירה בין לילה.
6. לשטוף את הדנ א-AuNRs 4 x על ידי ערבוב הדגימות עם 1 מ"ל לרחוץ את מאגר (0.5 x TBE עם 0.1% מרחביות), ואת צנטריפוגה ב x כ-7,000 גרם במשך 30 דקות להסיר את תגובת שיקוע, resuspend DNA-AuNRs בתוך הנוזל הנותר (~ 40 µL). מעריכים את הריכוז של ה-DNA-AuNRs מ- UV-VIS הקליטה מדידה כפי שמתואר בשלב 4.4.5.
   הערה: הפתרון עשוי להיות מעט "מעונן"-צעדים 5.3-5.4 עקב החלפת CTAB מפני השטח של AuNRs מאת תיול-DNA. הפתרון צריך להיות ברור על התחממות כדור הארץ עד ~ 35 º C למשך 5 דקות.

6. הרכבה של nanorods זהב על תבניות אוריגמי דנ א

1. להוסיף MgCl₂ הפתרון של מטוהרים הדנ א-AuNRs, כדי ריכוז סופי של 10 מ מ. מערבבים את הדנ א-AuNRs מטוהרים ואת אוריגמי יחס של 10:1.
   הערה: יחס נמוך יותר עשויה להקטין את התשואה של המוצר⁴³.
2. Anneal את התערובת במיקסר עם בקרת טמפרטורה של 40 ° צלזיוס עד 20 מעלות צלזיוס תוך טלטול-400 סל ד, בעקבות ההליך בטבלה מס ' 2.
   הערה: עבור תקליטור אפיון, המדגם ניתן למדוד לאחר שלב זה ללא טיהור נוסף.
3. להשתמש בג'ל 0.7% agarose (3.5 h 80 V) כדי לטהר את המבנים אוריגמי הסופי-AuNR.
4. השתמש transilluminator אור לבן עבור הדמיה. לחתוך את הלהקה המוצר (דימר אוריגמי-AuNR) (איור 3), לרסק את הג'ל על מצלמות-מיקרוסקופים ולחלץ את הנוזל. פיפטה הנוזל לתוך יחידת צנטריפוגלי מסנן ספין-x 3000 g עבור 5 דק Resuspend אוריגמי-AuNRs בפתרון. התשואה שחזור של הג'ל הוא כ- 50%.
5. מעריכים את הריכוז של המבנים אוריגמי-AuNR מ- UV-VIS הקליטה מדידה כפי שמתואר בשלב 4.4.5.

7. הילוכים מיקרוסקופ אלקטרונים הדמיה

הערה: זו formate uranyl (UFo) צביעת פרוטוקול זה ממאמרו של ספרות הקודם⁴⁴.

1. מיקס 200 µL של פתרון UFo (0.75%) µL 1 של NaOH (5 מ'), מערבולת מיידית לתקופה מינימלית של 2-3 Centrifuge הפתרון הכתם למשך 3-4 דקות ב 14,000 x g. להגן על הכתם מפני חשיפה קלה (למשל, על ידי ליפוף זה בנייר אלומיניום).
   התראה: UFo הוא רעיל אם נשאף או בלע יכול לגרום לגירוי העין. במקרה של חשיפה קצרה או זיהום נמוכה, להשתמש בהתקן מסנן בדרכי הנשימה. במקרה של חשיפה אינטנסיבית או יותר, השתמש בהתקן עצמאי מגן נשימתי. ללבוש כפפות. החומר הכפפות חייב להיות אטום ועמיד בפני UFo ופתרונות שלה. ללבוש משקפי סגור בחוזקה.
2. זוהר-פריקה פחמן/formvar-מצופה רשתות TEM 6 s רק לפני השימוש כדי להגביר את hydrophilicity ולקדם דבק של המבנים. פיפטה 5 טיפות מדגם µL על הרשת TEM, תקופת דגירה של 5-8 דקות והסר את המסירה על-ידי נגיעה בעדינות על נייר סינון עם הקצה של הרשת.
3. פיפטה אחד גדול (µL ~ 20), אחת קטנה (~ 10 µL) ירידה של הפתרון כתם על מצלמות-מיקרוסקופים. לשים את הרשת על הירידה פתרון כתם קטן ויבש באופן מיידי על-ידי נגיעה נייר הסינון עם הקצה של הרשת. . אז תלבש אותה הטיפה פתרון כתם גדול ב-30 s.
4. הסר את הנוזל על הרשת על-ידי נגיעה נייר הסינון עם הקצה של הרשת. מקם את הרשת בעל רשת. לחכות רשת לייבוש על פחות 10 דקות.
5. לאפיין את הדגימות של אוריגמי (איור 4), AuNRs (איור 5), אוריגמי-AuNRs (איור 6) מאת TEM.

8. קיווטות מדידה

1. נקה את ספקטרומטר CD עם N₂ למשך 20 דקות.
   הערה: רוב ספקטרומטרים CD לדרוש מנקה עם N₂ לפני מנורה ההצתה. בדוק את המדריך ספקטרומטר CD.
2. הגדר את רוחב הפס, טווח סריקה, ואת שלב הרכישה.
   הערה: טווח סריקה תלוי התכונות האופטיות של AuNRs, אשר תלויים בגודל של AuNRs.
3. מדד תקליטור ריק עם מאגר.
4. למדוד את ספקטרום תקליטור של אוריגמי-AuNR דגימות (איור 7).
   הערה: השתמש ליטרים או זכוכית וואקום למדידה CD. פלסטיק וואקום הזדהמו CD ספקטרוסקופיה. גם, רוב ספקטרומטרים CD מאפשרים רכישת סימולטני הקליטה ונתונים תקליטורים.

TEM תמונות של ה-DNA אוריגמי תבניות, AuNRs הרכבות אוריגמי הסופי-AuNR מוצגים באיור 4, איור 5ו- איור 6א, בהתאמה. עקב העדפתן איגוד לרשתות TEM, הרכבות אוריגמי-AuNR נראים בדרך כלל כמו אוריגמי מקבילים חבילות, מוטות (איור 6א). חישול תרמי נדרש היישור הנכון של AuNRs על תבניות אוריגמי (איור 6A, B). הפרוטוקול מאפשר תפוקה גבוהה של ההרכבה של AuNRs לתוך metamolecules כיראלי עם חזק תגובות CD plasmonic (איור 7).

טבלה 1: טמפרטורות ואת המחירים עבור חישול תרמי של ה-DNA אוריגמי תבניות.

בטבלה 2: טמפרטורות והשעות מחזיק עבור חישול של תבניות אוריגמי AuNRs ודנ א. בקצב קירור בין השלבים מוגדר ב- 0.1 º C/דקה. דגימות ה-DNA אוריגמי-AuNR הם annealed תוך טלטול-400 סל ד.

איור 1 : העיצוב של metamolecules כיראלי אוריגמי תבניות דנ א. (א) לזהות את הסידור המרחבי היחסי הרצוי של nanorods זהב (AuNRs), צורה מתאימה של אוריגמי תבנית ה-DNA. (B) להעריך את הפרמטרים מבנית של AuNRs (DAuNR, L 'AuNR), התבנית אוריגמי (Wאוריגמי, Lאוריגמי, Θ). לאתר את מיקומם המשוער של סיכות מהדק זה נדרשים שינויים נוספים. תכנון (C) של ה-DNA אוריגמי תבניות באמצעות caDNAno. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2 : Agarose בג'ל של אוריגמי- (א) טיהור עם 1% agarose בג'ל עבור 2 h 80 נגד אפיון (B) עם 2% agarose בג'ל במשך 4 שעות 80 נ' אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3 : הטיהור agarose ג'ל אלקטרופורזה של אוריגמי-AuNRs. ג'ל (0.7%) הופעלה עבור 3.5 h 80 V על הדגימות שהוכן בעקבות ההליך הרכבה עם יחסים DNA-AuNR-כדי-אוריגמי שונים (20:1, 5:1) ודוגמאות (יחס ה-DNA-AuNRs-כדי-אוריגמי 10:1) עם או בלי חישול בהליך. לתמונות TEM של הדגימות בלהקות 1, 2 ו- 3, ראה איור 6. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4 : תמונת TEM נציג של תבניות אוריגמי דנ א. המבנה אוריגמי מורכב שתי חבילות 14-סליל (80 nm x 16 nm x 8 ננומטר) מקושרים יחד על ידי סטרנד לגרדום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 5 : תמונת TEM נציג AuNRs. הממדים הממוצע של AuNRs מסונתז הם 70 x 30 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 6 : TEM תמונות מכלולים אוריגמי-AuNR. (א) AuNR הדימרים על אוריגמי לאחר חישול (פס 1 באיור3). (B) AuNR הדימרים על אוריגאמי ללא מחזק (פס 2 באיור3). (ג) אוריגמי-AuNR אגרגטים (להקת 3 באיור3). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 7 : CD ספקטרום של ההרכבות אוריגמי-AuNR. ספקטרום תקליטור של המבנים סגורים (התבניות אוריגמי קבוע על ידי מנעול גדילי לתוך תצורה ימני, עם 50° בין שתי חבילות אוריגמי) ואת המבנה פתוח (התבניות אוריגמי ללא מנעול גדילי). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

המחברים אין לחשוף.