אורגנואידים פיתח מבלוטות החלב של העכבר היו לקרינה מאופיין להעריך תכונות אפיתל ואינטראקציות עם תאים חיסוניים. ניתן להשתמש באורגנואידים הניתנים לקרינה כדי להעריך טוב יותר את האינטראקציות של תאי התא שעלולות להוביל לגיוס תאי גידול ברקמה נורמלית שניתן לקרינה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
אורגנואידים נגזר מרקמת מתעכל הם רב-תאיים תלת מימדי (3D) מבנים כי טוב יותר לכידה בתנאים vivo מאשר תא monolayers. למרות שהם לא יכולים לגמרי לדגמן במורכבות vivo, הם שומרים כמה פונקציונליות של האיבר המקורי. ב מודלים סרטניים, אורגנואידים משמשים בדרך כלל כדי ללמוד הפלישה תא הגידול. פרוטוקול זה מטרתו לפתח ולאפיין אורגנואידים מרקמת בלוטת החלב הרגילה והקרינה הרדיואקטיבית כדי להעריך את תגובת הקרינה ברקמות רגילות. האורגנואידים האלה יכולים להיות מיושמים על עתיד בלימודי סרטן מבחנה כדי להעריך את האינטראקציות של תאי הגידול עם אורגנואידים לקרינה. בלוטות החלב היו resected, הקרינה עד 20 Gy מתעכל בתמיסה בקולגן השמיני. אורגנואידים אפיתל הופרדו באמצעות בידול צנטריפוגלי, ו 3D אורגנואידים פותחו ב 96-היטב מיקרופלטות הדבקה נמוכה. אורגנואידים הביע את סימן האפיתל האופייני ציטוקרטין 14. מקרופאג האינטראקציה עם האורגנואידים נצפתה בניסויים בשיתוף תרבות. מודל זה עשוי להיות שימושי עבור לימוד אינטראקציות הגידול סטרומה, הסתננות של תאים חיסוניים, ו מקרופאג קיטוב בתוך סביבת מיקרו הקרינה.
מבוא
כ 60% של סרטן השד שליליים משולשת (TNBC) מטופלים בוחרים בשד-שימור טיפול (BCT) כסוג של טיפול1. במובן זה מודאליות, הגידול המכיל חלק של רקמת השד מוסר, ואת הרקמה הנורמלית המקיפה נחשפת קרינה מייננת להרוג כל שרידי תאים סרטניים. הטיפול מפחית הישנות יותר של אוכלוסיית סרטן השד; עם זאת, כ 13.5% של חולים מטופלים עם החוויה TNBC לוקליזציה מופעים חוזרים2. לכן, ללמוד כיצד קרינה יכול לגייס תאים סרטניים במחזור (ctcs) יוביל לתובנות חשובות להישנות המקומי3,4.
העבודה הקודמת הראתה כי הקרינה של רקמות נורמלי מגביר את הגיוס של סוגי תאים שונים5....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
לימודי בעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות ולפרוטוקולים המוסדיים שאושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת ואנדרבילט.
1. הכנת עכברים ורכישת תאים (מותאם מ-נגוין-Ngoc et al.11)
- להקריב את העכברים Nu/Nu (8-10 שבועות בן) באמצעות שיתוף2 חנק ואחריו פריקה צווארי. לנקות את העור באמצעות 70% אתנול.
- לכרות בלוטות החלב הבטן והאינרינאלה מעכברים באמצעות מספריים טרום מעוקר ומלקחיים. הסר בלוטות הלימפה לפני ההסרה. שטפו בתמיסת מלח מעוקר באגירה בגודל 1 x (PBS) (איור 1X).
- מניחים אותו 15 מ ל צינורות עם 10 מ ל של דולבקה שונה מדיה נשר/תערובת מזינים F12 (Dמאמ/F1....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בלוטות החלב שנחשפו לקרינה התקבלו בהצלחה מבלוטות החלב של העכבר, מעובדות ומתרבות על לוחות הדבקה נמוכה (איור 1). תשואה אורגאיד נבדקה על ידי זריעה בסביבות גידול שונות (איור 2A-G). זורעי תאים ישירות על תרבות רקמות שטופלו 10 ס מ לוחות התא הניבו צמיחה יתר של תאים פיברובסט. המיקרותקיעות זוהו תחת מיקרוסקופ לעומת הפאזה או בסמוך לאותו מישור של מיקוד, והם גדלו במהירות מאורגנואידים מצופים תוך ימים ספורים. הצמיחה של פיברותקיעות נצפתה גם כאשר אורגנואידים היו הנזרע קרום המרתף מטריצות חלבון .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בפרוטוקול זה פיתחנו שיטה לצמיחה ואפיון של מארגני הפטמות הקרינה (איור 1). מינון הקרנה של 20 Gy הוחל על מראה הקודם במודלים vivo של הזרקור של תא הגידול5. הקרנה של בלוטות החלב לשעבר vivo לפני היווצרות אורגאיד מותר לבידוד של אפקטי נזק קרינה ללא חדירה מתאימה של תאים חיסוניים. התפתחות של מודל רקמה נורמלית לקרינה מחוץ לתמונה מאפשרת צפייה בזמן אמת של אינטראקציות סלולר שעשויות לתרום CTC גיוס המושרה11,12.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
אנו מודים ד ר לורה ל. ברוסארט עבור מתן GFP ו-dTomato התווית RAW 264.7 מקרופאגים. מחקר זה היה נתמך כספית על ידי מלגת NIHR00CA201304.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 10% פורמלין ניטרלי חוצץ | VWR | 16004-128 | |
| אנטי ציטוקרטין 14 | abcam | ab181595 | לוט: GR3200524-3 |
| סרום בקר אלבומין | סיגמא | A1933-25G | |
| קולגן סוג I | קורנינג | 354236 | |
| קולגנאז מ- Clostridium Histolyticum, סוג VIII | Sigma | C2139 | |
| קולגנאז I | Gibco | 17018029 | |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 11320-033 | |
| DNAse | Roche | 10104159001 | |
| DPBS | Fisher | 14190250 | |
| E-Cadherin | Cell Signaling | 24E10 | Lot: 13 |
| FBS | Sigma | F0926 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750 | |
| עיזים נגד ארנב אבקם משני | ab150077 | green לוט: GR3203000-1 | |
| עז נגד ארנב abcam משני | ab150080 | אדום לוט: GR3192711-1 | |
| Hoechst 33342 | Fisher | 62249 | Lot: TG2611041 |
| אינסולין (10 מ"ג/מ"ל) | Sigma | I9278 | |
| אינסולין-טרנספרין-סלניום, 100x | Gibco | 51500-056 | |
| ממברנת מרתף מטריג'ל (קרום הבסיס המופק מסרקומה של עכבר אנגלברת-הולם-נחיל) | קורנינג | 356237 | |
| מעבדות וקטור | סרום עיזים | רגיל S-1000 | |
| Nuclon Sphera 96 צלחות באר | Thermo | 174927 | |
| PBS | VWR | 10128-856 | |
| עט/סטרפטוקוס | פישר | ||
| Phalloidin | abcam | ab176757 | Lot: GR3214582-16 |
| חלבון צומת הדוק 1 | Novus | NBP1-85047 | Lot: C115428 |
| Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol) | Sigma | X100-100ML | |
| Trypsin | Gibco | 27250-018 | |
| Tween-20 (פוליאתילן גליקול סורביטן מונולאורט) | סיגמא | P1379-100 מ"ל |
מקורות
- Lautner, M., et al. Disparities in the Use of Breast-Conserving Therapy Among Patients With Early-Stage Breast Cancer. Journal of the American Medical Association Surgery. 150 (8), 778-786 (2015).
- Lowery, A., Kell, M., Glynn, R., Kerin, M., Sweeney, K.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
