הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

צמיחה ואפיון של אורגנואידים לקרינה מבלוטות החלב

7.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59293

⸱

3 במאי 2019

 ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Vanderbilt University, 2Department of Biomedical Engineering, Vanderbilt University, 3Department of Radiation Oncology, Vanderbilt University Medical Center

במאמר זה

סיכום

אורגנואידים פיתח מבלוטות החלב של העכבר היו לקרינה מאופיין להעריך תכונות אפיתל ואינטראקציות עם תאים חיסוניים. ניתן להשתמש באורגנואידים הניתנים לקרינה כדי להעריך טוב יותר את האינטראקציות של תאי התא שעלולות להוביל לגיוס תאי גידול ברקמה נורמלית שניתן לקרינה.

תקציר

אורגנואידים נגזר מרקמת מתעכל הם רב-תאיים תלת מימדי (3D) מבנים כי טוב יותר לכידה בתנאים vivo מאשר תא monolayers. למרות שהם לא יכולים לגמרי לדגמן במורכבות vivo, הם שומרים כמה פונקציונליות של האיבר המקורי. ב מודלים סרטניים, אורגנואידים משמשים בדרך כלל כדי ללמוד הפלישה תא הגידול. פרוטוקול זה מטרתו לפתח ולאפיין אורגנואידים מרקמת בלוטת החלב הרגילה והקרינה הרדיואקטיבית כדי להעריך את תגובת הקרינה ברקמות רגילות. האורגנואידים האלה יכולים להיות מיושמים על עתיד בלימודי סרטן מבחנה כדי להעריך את האינטראקציות של תאי הגידול עם אורגנואידים לקרינה. בלוטות החלב היו resected, הקרינה עד 20 Gy מתעכל בתמיסה בקולגן השמיני. אורגנואידים אפיתל הופרדו באמצעות בידול צנטריפוגלי, ו 3D אורגנואידים פותחו ב 96-היטב מיקרופלטות הדבקה נמוכה. אורגנואידים הביע את סימן האפיתל האופייני ציטוקרטין 14. מקרופאג האינטראקציה עם האורגנואידים נצפתה בניסויים בשיתוף תרבות. מודל זה עשוי להיות שימושי עבור לימוד אינטראקציות הגידול סטרומה, הסתננות של תאים חיסוניים, ו מקרופאג קיטוב בתוך סביבת מיקרו הקרינה.

מבוא

כ 60% של סרטן השד שליליים משולשת (TNBC) מטופלים בוחרים בשד-שימור טיפול (BCT) כסוג של טיפול1. במובן זה מודאליות, הגידול המכיל חלק של רקמת השד מוסר, ואת הרקמה הנורמלית המקיפה נחשפת קרינה מייננת להרוג כל שרידי תאים סרטניים. הטיפול מפחית הישנות יותר של אוכלוסיית סרטן השד; עם זאת, כ 13.5% של חולים מטופלים עם החוויה TNBC לוקליזציה מופעים חוזרים2. לכן, ללמוד כיצד קרינה יכול לגייס תאים סרטניים במחזור (ctcs) יוביל לתובנות חשובות להישנות המקומי3,4.

העבודה הקודמת הראתה כי הקרינה של רקמות נורמלי מגביר את הגיוס של סוגי תאים שונים5. במודלים טרום קליניים של TNBC, הקרנה של רקמה נורמלית גדל מקרופאג ולאחר מכן הגידול התא הגיוס לרקמות נורמלי5. המצב החיסוני השפיעו על גיוס תאים סרטניים לאתרים שנחשפו לקרינה, עם הגירה תא הגידול נצפתה בנושאים חיסוני. העברת האינטראקציות הללו תוך שימוש באורגנואידים הנגזרים מבלוטות החלב תאפשר צפייה בהעברת תאים ואינטראקציות תאים מסטרומה בזמן אמת עם מיקרוסקופ ודימות תאים חיים כדי לקבוע את התפקיד של נזקי קרינה בשנות התנהגות תא הגידול.

אורגנואידים של העכבר עזרו להבהיר שלבי מפתח בהתפתחות בלוטת החלב. מבנה החלב הוא מגוון, שלושה מימדים המבנה של אפיתל החלב בודד כי הוא גדול יותר 50 יקרומטר6,7,8,9,10. באמצעות מארגני האפיתל העיקרי, Simian ואח ' העריך את הגורמים הדרושים עבור הסתעפות בבלוטת החלב7. שמיר ואח ' גילה כי הפצת יכול להתרחש ללא האפיתל למעבר mesenchymal, מתן תובנה האשד הגרורתי8. שיטות להפקת ואפיון אורגנואידים מרקמת בלוטת החלב מבוססים היטב6,11,12,13. עם זאת, על הידע שלנו, שיטות לגידול מאורגנואידים לקרינה מבלוטות החלב לא דווחו. פרוטוקול לגידול ולאפיון של אורגנואידים הקרינה יהיה צעד מכריע בארגון לכידה של הקרינה הנגרמת החיסונית והגידול תאים.

במאמר זה, אנו מדווחים על שיטה לגידול ולאפיון אפיתל הפטמות המנואידים במיקרופלטות נמוכות מצופות בפולימר הידרופילי התומך בהיווצרות הספרואידים. האורגנואידים האלה היו שותפים לתרבות עם מקרופאגים כדי לבחון קינטיקה חיסונית הסתננות של תאים. עבודה זו ניתן להרחיב כדי לכלול co-culturing אורגנואידים עם תאים האדיפוז מאפייני החלב, תאים סרטניים השד כדי להמחיש הזרקור תאים הגידול, ו CD8 + T תאים ללמוד גידול-אינטראקציות תאים חיסוניים. ניתן להשתמש בפרוטוקולים שנקבעו בעבר כדי להעריך את האורגנואידים הניתנים לקרינה. מוקדם יותר דגמים שיתוף החלב אורגנואידים ותאים חיסוניים יש לשפוך אור על מנגנונים של גרורות והפצת. DeNardo ואח ' מצא כי CD4 + T בוויסות התאים של מקרופאגים הקשורים הגידול משופרת פניטיפ גרוטיפים של הפטמות אדנוקרצינומות14. בנוסף, נעשה שימוש במודלים של תרבות משותפת כדי להבהיר מנגנונים לפיתוח ביולוגי. פלקס ואח ' הבהיר את תפקידה של CD4 + T כתאי הרגולטורים של החלב באורגאוגנזה15. עם זאת, הקבוצה שלנו היא הראשונה להקים הליך להמחיש כיצד הקרנה רקמה נורמלית משפיע על התנהגות התא החיסונית. מכיוון הקרנה רקמה נורמלית הוכח לשפר את הגיוס תאים סרטניים5, פרוטוקול זה ניתן לפתח עוד כדי לנתח כיצד התנהגות התאים הסרטניים משתנה על ידי הקרנה של רקמות ותאים נורמליים, המוביל להבנה רבה יותר של סרטן הישנות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

לימודי בעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות ולפרוטוקולים המוסדיים שאושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת ואנדרבילט.

1. הכנת עכברים ורכישת תאים (מותאם מ-נגוין-Ngoc et al.11)

  1. להקריב את העכברים Nu/Nu (8-10 שבועות בן) באמצעות שיתוף2 חנק ואחריו פריקה צווארי. לנקות את העור באמצעות 70% אתנול.
  2. לכרות בלוטות החלב הבטן והאינרינאלה מעכברים באמצעות מספריים טרום מעוקר ומלקחיים. הסר בלוטות הלימפה לפני ההסרה. שטפו בתמיסת מלח מעוקר באגירה בגודל 1 x (PBS) (איור 1X).
  3. מניחים אותו 15 מ ל צינורות עם 10 מ ל של דולבקה שונה מדיה נשר/תערובת מזינים F12 (Dמאמ/F12) עבור הובלה. ניתן להשאיר דגימות בין לילה ב -4 ° c או בעיבוד מיידי. . המשיכו לאכול
  4. הקרינים דגימות ב 20 Gy באמצעות מקור צסיום (איור 1B).
  5. 45 דקות לאחר ההקרנה, המקום בלוטות החלב בלוח 35 מ"מ תא סטרילי והומה עם אזמלים (איור 1C, D). האוהב עם כ 40 משיכות עד הרקמה מרגיע וחתיכות מתקבלים כי הם לא גדולים יותר כ 1 מ"מ2 באזור.
  6. העבר לפתרון הקולגן בתוך צינור הצנטריפוגה 50 mL. הפתרון מורכב 2 מ"ג/mL הקולגן (ראה טבלה של חומרים), 2 מ"ג/ml טריפסין, 5% v/v סרום בקר העוברי (fbs), 5 Μg/ml אינסולין, ו 50 Μg/ml GENTAMICIN ב Dmem/F12 מדיה. השתמש ב-10 מ"ל הפתרון הקולגן לכל עכבר.
  7. מניחים באמבט מים ב 37 ° c, vortexing כל 10 דקות עבור 30-60 דקות. העיכול מושלם כאשר התמיסה הקולגן מעונן (איור 1E, F).
  8. לסובב את הפתרון מתעכל ב 450 x g עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT). שלוש שכבות יובחנו. הסופרנטאנט מורכב משומן, השכבה האמצעית היא פתרון מימית, והתחתית היא גלולה. הגלולה יופיע אדום כפי שהוא תערובת של תאים אפיתל, בודדים סטרומה תאים, וכדוריות הדם האדומות (איור 1G).
  9. העבר את כל הפיפטות, עצות הפיפטה וצינורות הצנטריפוגה עם התמיסה של סרום השור (BSA) לפני המגע. הפתרון BSA מורכב 2.5 w/v% BSA בתוך מלוחים פוספט באגירה של Dulbecco (DPBS). לציפוי מראש, פשוט להוסיף ולאחר מכן להסיר פתרון BSA לתוך החלק הפנימי של הצנרת וצינורות. ניתן לעשות שימוש חוזר בפתרון BSA, למרות שהוא אמור להיות מסונן לפני כל ניסוי.
  10. להתאוששות נוספת, להעביר את הסופרנטאנט לצינור BSA טרי מצופה שפופרת 15 mL. פיפטה למעלה ולמטה במרץ כדי לפזר שכבת שומן. צנטריפוגה ב 450 x g עבור 10 דקות ב-RT. ולאחר מכן, מותיר כמות קטנה של מדיה בצינור, כדי להימנע מלבשל את הגלולה הסלולרית.
  11. מנקז את השכבה הימית. מהצינור עם הגלולה המקורית
  12. הוסף 10 מ ל של DMEM/F12 לצינור עם הגלולה המקורית להעביר את הצינור השני. פיפטה במרץ כדי לשלב ולהשעות את שתי החבילות.
  13. צנטריפוגה ב 450 x g עבור 10 דקות ב-RT. משלחים את הסופרנטאנט ומוסיפים 4 מ ג/F12 לצינור.
  14. להוסיף 40 μL של deoxyribonuclease (DNase) אל ההשעיה בעדינות לנער ביד עבור 2-5 דקות ב RT. DNase פתרון מורכב 4 U/mL DNase ב DNASE/F12.
  15. הוסף 6 מ ל של Dמאמ/F12 ו פיפטה ביסודיות. צנטריפוגה את הצינור ב 450 x g עבור 10 דקות ב RT.
  16. . מפני שהוא מסמן את ה0.5 השהה מחדש ב-10 מ ל של Dמאמ/F12 ופיפטה ביסודיות.
  17. דופק 450 x g ולעצור 4 s לאחר שהגיע במהירות זו.
  18. חזור על הצעדים 1.16-1.17 עוד שלוש פעמים כדי לטהר את האורגנואידים באמצעות בידול צנטריפוגלי. הגלולה צריך עכשיו להיות צבע מחוץ ללבן המורכב של רק אורגנואידים אפיתל (איור 1H).
    הערה: אורגנואידים ניתן גם לסנן באמצעות רשת סטרילית 40 יקרומטר מסננים. לאחר שלב 1.16, מדיה פיפטה המכיל אורגנואידים דרך מסנן לתוך שפופרת צנטריפוגה, ולאחר מכן לשטוף עם 5 כדי 10 מ ל של Dמאמ/F12 מדיה. הפוך את המסנן מעל שפופרת צנטריפוגה חדשה 50 mL. העבר 10 מ ל של DMEM דיה/F12 דרך, הולך בדרך הפוכה לשטוף כל רטינטאט. הרטינטאט צריך להיות מורכב מאורגנואידים, והפילטרט צריך להיות מורכב בעיקר של תאים סטרומה, אשר ניתן להיפטר או לשמור במידת הצורך.

2. קביעת צפיפות וציפוי מאורגנואידים

  1. להשעות את הגלולה ב 10 מ ל/F12. פיפטה ביסודיות ליצירת פתרון הומוגנית.
  2. העבר 50 μL ל 30 מ"מ צלחת פטרי, ולהציג תחת מיקרוסקופ הניגודיות שלב ב 20x. תספור את מספר האורגנואידים. עם מונה מספרים
    הערה: הנה טיפים פיפטה שימשו בעקביות עם קוטר מינימלי של 457 μm, וזה 5-10 פעמים קוטר של האורגנואידים כי הם הנזרע. להעברת כרכים של 2 מ ל או יותר (למשל, שלבים 1.16 ו-2.1), יש להשתמש בפיפטות נסיולוגיים עם קצה קוטר של 1,500 μm.
  3. חישוב צפיפות האורגאיד באמצעות המשוואה הבאה:
    figure-protocol-1
    הצפיפות הרצויה היא 1,000 אורגנואידים/mL כדי לפשט דילול נוסף. אם הצפיפות נמוכה מדי, צנטריפוגה ב 450 x g עבור 5 דקות ומדי התקשורת. הוסף מדיה הדרושים כדי להגיע ל-1,000 אורגנואידים/mL, ופיפטה ביסודיות ליצירת תערובת הומוגנית.
    1. כדי לגדל אורגנואידים במטריצה חלבון, אורגנואידים הזרעים בריכוז של 1 אורגאיד/L בסוג קולגן 1 מדולל 87% או בקרום המרתף שחולצו מ אנגלברth-הולם-סרקומה של העכבר. , בזמן שעבדתי עם דגימות. המשיכו לאכול
    2. כדי להקפיא אורגנואידים, העבר את העוצמה הרצויה לשפופרת צנטריפוגה נפרדת. ספין למטה ב 450 x g עבור 5 דקות. התקשורת ולאחר מכן להוסיף את אותו כמות של 90% fbs/10% dmso. , להשעות את האורגנואידים. ואז להיכנס לקריוצינורות העברה ל-80 ° c ולאחר מכן לחנקן נוזלי בתוך שבוע אחד.
    3. להפשיר, להתחמם באמבט מים ב37 מעלות צלזיוס לדקה אחת. צנטריפוגה ב 450 x g עבור 5 דקות, ולאחר מכן הקפאת מדיה הקפאה. לשטוף עם DPBS סטרילי, ולאחר מכן צנטריפוגה שוב. . ולהוסיף מדיה ארגונית
  4. פיפטה 50 μL (50 אורגנואידים) לתוך כל באר של לוחית הדבקה נמוכה (איור 1I).
  5. הוסף 150 μL של מדיה ארגונית כדי להביא את נפח העבודה הכולל ל 200 μL. אורגנואיד מדיה מורכב 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו-1% אינסולין-הועבר-סלניום (שלה) ב-Dמאמ/F12 מדיה.
  6. כל יומיים מחליפים את המדיה בקפידה.
    הערה: לוחיות הדבקה נמוכות אינן מטופלות בתרבות הרקמה; לכן, ניתן להתנתק בקלות בתאים. מנושף את התקשורת באיטיות על-ידי הטיית הצלחת והחדרת הקצה של הפיפטה בקצה של כל באר. השאירו כמות קטנה של מדיה בתחתית הבאר. הוסף באיטיות מדיה חדשה כדי להימנע מהחלת כוחות הטיה לא נחוצים לאורגנואידים.

3. Co-culturing עם מקרופאגים

  1. שמור על GFP או dTomato-מקרופאגים RAW 264.7 במדיה DTOMATO בתוספת 10% FBS ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין. Seed 1 x 104, 5 x 104, או 1 x 105 תאים/mL לתוך מדיה ארגונית.
  2. השתמש בניגוד לשלב החי של התאים והדמיה פלואורסצנט לניטור הסתננות מקרופאג לאורך זמן.

4. כתמים מאימונולואורנציה של אורגנואידים

הערה: הארגון יכול להיות מוכתם בבארות הדבקה נמוכות או שניתן להעבירו לשקפים קאמריים. כדי להעביר, הפיפטה בעדינות למעלה ולמטה עד שהאורגנואידים התנתק מלוחות. העברה לשקופיות קאמרית ו-דגירה עבור 4-8 h כדי לאפשר לאורגנואידים לדבוק משטח הצלחת.

  1. הסר את המדיום האורגאידית מבארות על-ידי הסרת האספירין בזהירות. לתקן דגימות עם 10% המאגר ניטרלי באגירה עבור 15 דקות ב RT.
  2. שטוף 3 x 5 דקות ב-1x PBS. במקרה הצורך, ניתן לאחסן דגימות קבועות ב-4 ° צ' למשך שבוע עבור כתמים נוספים.
  3. החדירות עם 0.1% 4-(1, 1, 3, 3-טטרמתיבוטיל) פניאיל-פוליאתילן גליקול 5 דקות.
    הערה: כדי להכתים את F-actin, מדגמים מודורים עם phalloidin מדולל 1:1000 ו 1.67 ננומטר ביבנזימיד לצבוע גרעינית 1% PBS/BSA עבור 1 h ב RT. . אז, המשך לשלב 4.8
  4. ברימיוז עם 0.5 PBS. דגימות יכולות להיות מאוחסנות בתמונות 4 העתק ותמונות מוחיסורמיות. מנגנונים שתורמים CTC rlock עם סרום עז 5% רגיל ב 0.1% PBS/פוליאתילן גליקול ביתן monolaurate (PBST) עבור 1 h ב RT. לשטוף את 3x 5 דקות עם PBS.
  5. דגירה עם אנטי ציטוקרטין 14 מדולל 1:1000, E-קדהרין מדולל 1:200, או הדוקה החלבון הצומת 1 מדולל 1:100 ב 1% NGS ב PBST עבור 1 h ב RT. לשטוף את 3x 5 דקות ב PBST.
  6. דגירה עם עז נגד ארנב משני מדולל 1:200 עם 1% NGS/PBST עבור 1 h ב RT. לכסות עם נייר כסף כדי למנוע חשיפה לאור.
  7. שטוף 3 x 5 דקות ב-PBS. השתמש בצבע הגרעיני (ראה טבלת חומרים) כדי להכתים גרעינים.
  8. שטוף 3 x 5 דקות ב-PBS. , אם אתה משתמש במגלשה. הר עם שמיכות החנות עטופה בנייר כסף ב -4 ° c עד שבועיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בלוטות החלב שנחשפו לקרינה התקבלו בהצלחה מבלוטות החלב של העכבר, מעובדות ומתרבות על לוחות הדבקה נמוכה (איור 1). תשואה אורגאיד נבדקה על ידי זריעה בסביבות גידול שונות (איור 2A-G). זורעי תאים ישירות על תרבות רקמות שטופלו 10 ס מ לוחות התא הניבו צמיחה יתר של תאים פיברובסט. המיקרותקיעות זוהו תחת מיקרוסקופ לעומת הפאזה או בסמוך לאותו מישור של מיקוד, והם גדלו במהירות מאורגנואידים מצופים תוך ימים ספורים. הצמיחה של פיברותקיעות נצפתה גם כאשר אורגנואידים היו הנזרע קרום המרתף מטריצות חלבון ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בפרוטוקול זה פיתחנו שיטה לצמיחה ואפיון של מארגני הפטמות הקרינה (איור 1). מינון הקרנה של 20 Gy הוחל על מראה הקודם במודלים vivo של הזרקור של תא הגידול5. הקרנה של בלוטות החלב לשעבר vivo לפני היווצרות אורגאיד מותר לבידוד של אפקטי נזק קרינה ללא חדירה מתאימה של תאים חיסוניים. התפתחות של מודל רקמה נורמלית לקרינה מחוץ לתמונה מאפשרת צפייה בזמן אמת של אינטראקציות סלולר שעשויות לתרום CTC גיוס המושרה11,12.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

אנו מודים ד ר לורה ל. ברוסארט עבור מתן GFP ו-dTomato התווית RAW 264.7 מקרופאגים. מחקר זה היה נתמך כספית על ידי מלגת NIHR00CA201304.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10% פורמלין ניטרלי חוצץVWR16004-128
אנטי ציטוקרטין 14abcamab181595לוט: GR3200524-3
סרום בקר אלבומיןסיגמאA1933-25G
קולגן סוג Iקורנינג354236
קולגנאז מ- Clostridium Histolyticum, סוג VIIISigmaC2139
קולגנאז IGibco17018029
DMEM/F12Thermofisher11320-033
DNAseRoche10104159001
DPBSFisher14190250
E-CadherinCell Signaling24E10Lot: 13
FBSSigmaF0926
GentamicinGibco15750
עיזים נגד ארנב אבקם משניab150077green
לוט: GR3203000-1
עז נגד ארנב abcam משניab150080אדום
לוט: GR3192711-1
Hoechst 33342Fisher62249Lot: TG2611041
אינסולין (10 מ"ג/מ"ל)SigmaI9278
אינסולין-טרנספרין-סלניום, 100xGibco51500-056
ממברנת מרתף מטריג'ל (קרום הבסיס המופק מסרקומה של עכבר אנגלברת-הולם-נחיל)קורנינג356237
מעבדות וקטורסרום עיזיםרגיל S-1000
Nuclon Sphera 96 צלחות בארThermo174927
PBSVWR10128-856
עט/סטרפטוקוספישר
Phalloidinabcamab176757Lot: GR3214582-16
חלבון צומת הדוק 1NovusNBP1-85047Lot: C115428
Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol)SigmaX100-100ML
TrypsinGibco27250-018
Tween-20 (פוליאתילן גליקול סורביטן מונולאורט)סיגמאP1379-100 מ"ל
15140122

מקורות

  1. Lautner, M., et al. Disparities in the Use of Breast-Conserving Therapy Among Patients With Early-Stage Breast Cancer. Journal of the American Medical Association Surgery. 150 (8), 778-786 (2015).
  2. Lowery, A., Kell, M., Glynn, R., Kerin, M., Sweeney, K. Locoregional recurrence after breast cancer surgery a systematic review by receptor phenotype. Breast Cancer Research and Treatment. 133, 831-841 (2012).
  3. Kim, M. Y., et al. Tumor Self-Seeding by Circulating Cancer Cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
  4. Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy. Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).
  5. Rafat, M., et al. Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence following Radiotherapy in Immunosuppressed Patients. Cancer Research. 78 (15), 4241-4252 (2018).
  6. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  7. Simian, M., Hirai, Y., Navre, M., Werb, Z., Lochter, A., Bissell, M. J. The interplay of matrix metalloproteinases, morphogens and growth factors is necessary for branching of mammary epithelial cells. Development. 128, Cambridge, England. 3117-3131 (2001).
  8. Shamir, E. R., et al. Twist1-induced dissemination preserves epithelial identity and requires E-cadherin. Journal of Cell Biology. 204 (5), 839-856 (2014).
  9. Ewald, A. J., Brenot, A., Duong, M., Chan, B. S., Werb, Z. Collective Epithelial Migration and Cell Rearrangements Drive Mammary Branching Morphogenesis. Developmental Cell. 14, 570-581 (2008).
  10. Nguyen-Ngoc, K. -V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), E2595-E2604 (2012).
  11. Nguyen-Ngoc, K. -V., Shamir, E. R., Huebner, R. J., Beck, J. N., Cheung, K. J., Ewald, A. J. 3D Culture Assays of Murine Mammary Branching Morphogenesis and Epithelial Invasion. Tissue Morphogenesis: Methods and Protocols. 1189, 135-162 (2015).
  12. Ewald, A. J. Isolation of mouse mammary organoids for long-term time-lapse imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 8 (2), 130-133 (2013).
  13. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews. , (2018).
  14. DeNardo, D. G., et al. CD4+T Cells Regulate Pulmonary Metastasis of Mammary Carcinomas by Enhancing Protumor Properties of Macrophages. Cancer Cell. 16 (2), 91-102 (2009).
  15. Plaks, V., et al. Adaptive Immune Regulation of Mammary Postnatal Organogenesis. Developmental Cell. 34 (5), 493-504 (2015).
  16. Mandl, I., McLennan, J. D., Howes, E. L. Isolation and Characterization of Proteinase and Collagenase Fromcl. Histolyticum. The Journal of Clinical Investigation. 32, 1323-1329 (1953).
  17. Mandl, I., Zaffuto, S. F. Serological Evidence for a Specific Clostridium histolyticum Geltinase. The Journal of General Microbiology. 18, 13-15 (1958).
  18. Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the Individual Collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).
  19. Zhang, L., et al. Establishing estrogen-responsive mouse mammary organoids from single Lgr5+cells. Cellular Signalling. 29, 41-51 (2016).
  20. Sokol, E. S., Miller, D. H., Breggia, A., Spencer, K. C., Arendt, L. M., Gupta, P. B. Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds. Breast Cancer Research. 18 (1), 1-13 (2016).
  21. Richert, M. M., et al. An atlas of mouse mammary gland development. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 227-241 (2000).
  22. Maier, P., Hartmann, L., Wenz, F., Herskind, C. Cellular pathways in response to ionizing radiation and their targetability for tumor radiosensitization. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).
  23. LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
  24. Campbell, J. J., Botos, L. A., Sargeant, T. J., Davidenko, N., Cameron, R. E., Watson, C. J. A 3-D in vitro co-culture model of mammary gland involution. Integrative Biology (United Kingdom). 6, 618-626 (2014).
  25. Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 14 (7), 2293-2306 (2011).
  26. Chua, A. C. L., Hodson, L. J., Moldenhauer, L. M., Robertson, S. A., Ingman, W. V. Dual roles for macrophages in ovarian cycle-associated development and remodelling of the mammary gland epithelium. Development. 137, Cambridge, England. 4229-4238 (2010).
  27. Ingber, D., Folkman, J. Mechanochemical switching between growth and differentiation during fibroblast growth factor-stimulated angiogenesis in vitro: role of extracellular matrix. The Journal of Cell Biology. 109 (July), Available from: http://jcb.rupress.org/content/109/1/317.abstract (1989).
  28. Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S. Understanding Adipocyte Differentiation. Physiological Reviews. 78 (3), 783-809 (1998).
  29. Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current Methods of Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
  30. Gabryś, D., Greco, O., Patel, G., Prise, K. M., Tozer, G. M., Kanthou, C. Radiation Effects on the Cytoskeleton of Endothelial Cells and Endothelial Monolayer Permeability. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 69 (5), 1553-1562 (2007).
  31. Ewald, A. J. Practical considerations for long-term time-lapse imaging of epithelial morphogenesis in three-dimensional organotypic cultures. Cold Spring Harbor Protocols. 8, 100-117 (2013).
  32. Zhang, M., et al. A high M1/M2 ratio of tumor-associated macrophages is associated with extended survival in ovarian cancer patients. Journal of Ovarian Research. 7 (1), 1-16 (2014).
  33. Ma, J., Liu, L., Che, G., Yu, N., Dai, F., You, Z. The M1 form of tumor-associated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time. BioMed Central Cancer. 10, 112(2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

14
צמיחה ואפיון של אורגנואידים לקרינה מבלוטות החלב
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.