הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

דיסקציה של הרשתית הגולמי דרוזופילה אימונוהיסטוכימיה, ניתוח המערבי של RNA בידוד

8.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59299

⸱

15 במרץ 2019

 , 
1Department of Biology, Wesleyan University

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מציג שיטה כירורגית ניקוד דרוזופילה הרשתיות הגולמי יחד עם פרוטוקולים עיבוד רקמה אימונוהיסטוכימיה, ניתוח המערבי של RNA-חילוץ.

תקציר

הרשתית הגולמי דרוזופילה מספק מערכת דגם מעולה לחקר תהליכים morphogenetic במהלך הפיתוח. בנייר זה, אנו מציגים פרוטוקול אמין רוברט של הרשתית הגולמי עדין דרוזופילה . הגישה כירורגי שלנו מנצל כלים microdissection זמינים פתח הגלמים ולחלץ בדיוק מתחמי עין-מוח. אלה יכולים להיות קבוע, נתון אימונוהיסטוכימיה, הרשתיות ואז רכוב על גבי שקופיות מיקרוסקופ, עם תמונה, אם המטרה היא לזהות מבנים הסלולר או subcellular. לחלופין, הרשתיות מבולבל יכול להיות מבודד רקמת המוח, lysed במאגרי המתאים, מנוצל להפקת חלבון ג'ל אלקטרופורזה או mRNA (להעריך ביטוי חלבון או הגן, בהתאמה). אימון משמעותי וסבלנות עשויים להידרש כדי לשלוט פרוטוקול microdissection תיאר, אך שולט, הפרוטוקול מאפשר בידוד מהיר יחסית של הרשתית בעיקר ניזוק.

מבוא

הרשתית דרוזופילה מורכב כ-750 ommatidia מוקף תאים פיגמנטים מסודרים חלת דבש סריג1,2,3,4. כל ommatidium כוללת שמונה קולט אור נוירונים, תאי חרוט מפריש עדשה 4 שני תאי הפיגמנט העיקרי. סביב כל ommatidium הם תאים מייצרי פיגמנט סריג וקבוצות זיפים חושית. בשל הטבע שלאחר mitotic שלה סטריאוטיפית סידור משושה, הרשתית הגולמי דרוזופילה מספק מערכת דגם מעולה לחקר תהליכים morphogenetic כולל תא אדהזיה5,6, 7,8,9,10 ואפופטוזיס11,12,13,14,15.

מספר פרוטוקולים שפורסמו לנצל לחץ האוויר לחלץ עין-מוח מתחמי דרוזופילה הגלמים16,17,18. הפרוטוקול המתואר כאן במקום זה מנצל כלים microdissection בקפידה ולבודד בדיוק מתחמי מוח-עין עם המטרה של השגת רקמת רשתית ניזוק. דבר זה חיוני אם הרשתיות הן כדי להיות מנוצל עבור מורפולוגי, חלבון, או ביטוי גנים מנתח מאז נזק הרשתיות עלול לגרום מתח סלולארית או המוות, אשר יכול לשנות את הביטוי הסלולר של פנוטיפ או הגן. בנוסף, לאחר תרגול, יכול מבודדת 6 עד 10 עין-מוח מתחמי ב 10-15 דקות, דבר המקל על המטרה של צמצום השתנות גיל, שלב התפתחותי של רקמת העין גזור.

הקיבעון, immunostaining ופרוטוקול כולה-הר המתוארים להלן מתאים ההכנה של העיניים דרוזופילה מיקרוסקופ פלואורסצנטי. יכול להיות מודגרות הרשתיות עם נוגדנים מיקוד חלבונים עניין. כך למשל, נוגדנים למרכיבים צומת adherens יכול להיות מנוצל להמחיש circumferences הפסגה של תאים כך מאפיינים כולל סוג התא, הצורה ואת סידור יכולה להיות המוערך19. לפני קיבוע, העיניים יכול במקום להיות ביקע מהמוח לצורך חילוץ חלבון לניתוח המערבי, או RNA לשימוש ב- PCR לרביעיית או RNA-רצף.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. רקמות הכנה

  1. הגדרת דרוזופילה חוצה (כמתואר קודם לכן20) או זנים דרוזופילה ספציפיים כדי לקבל הגלמים של גנוטיפ הרצוי תרבות. כדי להבטיח כי מספר גדול של הגלמים מגיחים coincidently, להקים תרבויות אלה לעוף כפולים מדיה עשירות מזון או מזון סטנדרטיים מדיה בנדיבות בתוספת שמרים-הדבק.
  2. לשמור על תרבויות דרוזופילה ב 25 º C. צלבים ניצול מערכת UAS-GAL4, GMR-GAL4 הוא מנהל התקן אידיאלי הביע בתאים העין זחל דיסק אחורי את פארו morphogenetic וברחבי פיתוח הגולמי21,22,23, 24. משמשת UAS-lacZ X GMR-GAL4 לחצות פקד אידיאלי לחצות כמו זה משגע ביטוי של החלבון β-galactosidase שאינם אנדוגני ואדישה.
  3. השתמש קצה-6" במבוק סד שהיה רטוב עם מים מזוקקים בעדינות להרים את הגלמים קדם לבן (איור 1B) מהצד של תרבות בריא בקבוקונים (איור 1 א') ולמקם לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL (איור 1C).
  4. מניחים את הצינורות לתוך קופסת פלסטיק פיפטה עצה יחד עם חתיכה קטנה של רקמת ספוגה מים מזוקקים כדי לשמור על לחות מספיק כדי להגן על הגלמים מהתייבשות (איור 1D) תא הלחץ. דגירה הגלמים 25 ° c עד לנתיחה.
  5. להשתמש דחף בעדינות את הגלמים מהצינור microcentrifuge ו על שחורה לנתח תבשיל יבש-6" במבוק סד. שכב טריים נייר-דבק דו צדדי על המנה ויבתר מן הגלמים.
  6. בזהירות באמצעות זוג מלקחיים, המקום הצד הגבי הגלמים למעלה (קרי, operculums פונה כלפי מעלה, איור 1B) על גבי הקלטת (איור 2 א). ודא כי הגלמים לדבוק היטב הקלטת.
    הערה: לחות על המקרה הגולמי לעכב הדבקה מאובטח לקלטת, ובמקרה הזה, לאפשר הגלמים מילה נהדרת לפני הנחת על הקלטת דו-צדדית.

2. ניתוח של מתחמי עין-מוח

  1. להשתמש מלקחיים כדי להסיר את operculum של כל גולם (איור 2C).
  2. השתמש microdissection מספריים לחתוך או לפתוח את התיק הגולמי של כל גולם. דש פתח את האירוע הגולמי כדי לחשוף את הראש, החזה, הבטן הקדמי, המאבטחים את הקצוות של המקרה הגולמי בקלטת דו-צידית (איור 2C).
    הערה: אין צורך לחשוף לחלוטין הגלמים.
  3. לנקב את הבטן של כל גולם עם מלקחיים חדה, לתפוס את החיה, ולהסיר אותו מהתיק שלה הגולמי (איור 2C).
  4. מקום הגלמים על המנה לנתיחה שחור, הרחק הקלטת, ולכסות כ-400 µL של קרח פוספט-באגירה-פתרון (PBS, pH 7.4).
  5. לתפוס כל גולם על ידי הבטן עם מלקחיים, ועם microdissection מספריים, נעשה חתך נקי חתך דרך בית החזה כולו, חיתוך הגולם במחצית (איור דו-ממדי).
  6. להסיר את השריד האחורי של כל פגר PBS ולהניח בצד אחד על המנה ויבתר (לא למחוק, ראה שלב 3.2.1).
  7. באמצעות שני זוגות של מלקחיים בסדר, פתח את החזה ואת ראש כל גולם כדי לחשוף את המתחם עין-מוח (2E איור). כדי לעשות זאת, תופסים הקצוות לחתוך של האפיתל החזה והורס בהדרגה כדי לפתוח בית החזה ולאחר מכן ראש כמוסה, חשיפת העין-מוח מורכבים והוא הסמוכים רקמת השומן.
  8. בלי לתפוס את הרקמה, להשתמש מלקחיים מדריך המתחם עין-מוח מן השרידים של הקפסולה ראש או סקופ המתחם עין-מוח של הקפסולה ראש קרועה.
    הערה: המתחם עין-מוח הוא בצורת המשקולת תפר חוט רקמה אופווייט, שקוף יותר מאשר השומן בצבע קרם שמסביב (איור 2B, E).
  9. עם מלקחיים, הסר בזהירות את רוב השומן המשויך את מתחמי עין-מוח בלי לגעת רקמת העין.

3. עיבוד של רקמות Immunofluorescence

  1. לנתח הגלמים לפחות 6-10 כפי שתואר (מדרגות 2.1-2.9).
    הערה: שלושה או ארבעה משכפל עצמאית של כל ניתוח נוטים תשואה מספיק נתונים כדי לבדוק השערה.
  2. כביסה, קיבוע
    1. חותכים את קצה P20 או עצה פיפטה P100 עם סכין גילוח נקי כדי להגדיל את הטיפ-פתיחת ~ 1 מ"מ ברדיוס ולסוך מאת pipetting שילוב של PBS ושומן למעלה ולמטה. השומן הזה ניתן להשיג שרידי הפגר שהוסר בשלב 2.6.
    2. להעביר את מתחמי עין-מוח µL ~ 400 ל- PBS בקערת זכוכית 9-. ובכן, על קרח. להשתמש את הטיפ משומנים, P20 או P100 על עקירה אוויר micropipette להעביר.
      הערה: עין-מוח מתחמי לדבוק טיפים ומקיאה במהלך pipetting, להיות ניזוק או אבד.
    3. להסיר את השומן הנותרים המשויכים רקמת העין על-ידי pipetting של PBS למעלה ולמטה כדי מערבולת בעדינות את מתחמי עין-מוח. זה, כל הצעדים הבאים כביסה, לא ישירות פיפטה עין-מוח מתחמי למעלה ולמטה כמו זו עתידה לפגוע רקמת העין שביר.
    4. להעביר את מתחמי עין-מוח באמצעי אחסון מינימלי (< 20 µL) ל- PBS לתוך µL לפחות 250 של מקבע. מערבבים על-ידי pipetting הפתרון למעלה ולמטה. תקופת דגירה של 35 דקות, על קרח.
      הערה: הטיפ משומנים אותו מוכן בשלב 3.1.1 ניתן להעברה זו.
    5. עם הטיפ פיפטה אותו, להעביר את מתחמי עין-מוח µL ~ 400 המכיל טוב ל- PBS. לערבב על-ידי pipetting הפתרון למעלה ולמטה, תקופת דגירה של 5-10 דקות על קרח, לרחוץ. חזור על השלב כביסה לפחות פעמיים.
      הערה: מתחמי עין-מוח יכול להישמר למשך מספר שעות בכביסה PBS הסופי, על הקרח, או 4 ° C, לפני שתמשיך לשלב 3.3.1.
  3. נוגדן מכתים
    1. כדי לחסום את הרקמה לפני חשיפה לפתרונות נוגדן, להעביר את מתחמי עין-מוח µL ~ 400 של PBT. השתמש את הטיפ משומנים P20 או P100 על עקירה אוויר micropipette להעברה. תקופת דגירה של 10 עד 60 דקות, על קרח.
    2. הכן את הפתרון נוגדן ראשוני על ידי דילול נוגדנים המתאימים ב- PBT. מכיוון עין-מוח מתחמי מודגרת ב 10 aliquots µL של נוגדן פתרון, האחסון מוכן יהיה שכפול של 10.
    3. Aliquot 10 µL של נוגדן פתרון לבאר נקי של מגש 72-טוב microwell (ראה דיון).
    4. חותכים את קצה טיפ פיפטה P10 עם סכין גילוח נקי כדי להגדיל את הטיפ-פתח ~0.5 מ"מ ברדיוס ולסוך מאת pipetting PBT למעלה ולמטה.
    5. העברה לא יותר מ-5 מתחמי עין-מוח, נפח של < µL 3 ל- PBS, לתוך כל µL 10 טוב של נוגדן פתרון באמצעות micropipette עקירה אוויר של P10 והטיפ משומנים.
    6. Homogenize הפתרון נוגדנים על ידי pipetting הפתרון למעלה ולמטה. לא pipette את מתחמי עין-מוח למעלה ולמטה כמו זו עתידה לפגוע הרקמה.
    7. כדי למזער את אידוי של הפתרון נוגדן, מניחים חתיכה קטנה של רקמת ספוגה מים מזוקקים במגש microwell, לאטום את המגש (למשל, עם המכסה מסופקים). דגירה בין לילה ב 4 º C.
    8. להעביר את מתחמי עין-מוח ממגש microwell µL ~ 400 של PBT בקערת זכוכית נקוו 9, לרחוץ. השתמש P10 אוויר הזחה micropipette ולהכין משיכור למר PBT טיפ (כפי שמתואר בשלב 3.3.4). מערבבים על-ידי pipetting הפתרון למעלה ולמטה. תקופת דגירה של 5-10 דקות על קרח.
    9. חזור על השלב כביסה לפחות פעמיים. להשתמש micropipette עקירה אוויר P20 או P100 א משיכור למר PBT טיפ כדי להעביר את מתחמי עין-מוח בין שטיפת פתרונות.
    10. הכן את הפתרון נוגדנים משניים על ידי דילול המתאים מתויג fluorophore משני נוגדנים ב- PBT כנדרש. µL 100 של נוגדנים משניים פתרון מספיקה לכל קבוצה של 6-10 הגלמים. Aliquot הפתרון נוגדנים משניים לתוך תבשיל חיתוך זכוכית נקוו-9.
    11. להעביר את מתחמי עין-מוח בתוך תמיסת נוגדנים משניים. להשתמש micropipette עקירה אוויר P20 או P100 א משיכור למר PBT טיפ להעברה.
    12. דגירה את מתחמי עין-מוח בפתרון נוגדנים משניים עבור 1-2 h בטמפרטורת החדר, או h 3-5-4 מעלות צלזיוס. למניעת הלבנת של fluorophores על ידי אור, לכסות את ההכנה עם נייר כסף.
      הערה: אופטימלית משך הדגירה בפתרון נוגדנים משניים עשויים להשתנות לפי הנוגדנים והמשניים בשימוש.
    13. להעביר את מתחמי עין-מוח µL ~ 400 של PBT בקערת זכוכית 9-ובכן, לרחוץ. מערבבים על-ידי pipetting הפתרון למעלה ולמטה. תקופת דגירה של 5-10 דקות על קרח. שלב זה כביסה יש לחזור לפחות פעמיים.
  4. קיבוע משני
    1. עבור יציבות משנית, להעביר את מתחמי עין-מוח µL לפחות 200 של מקבע, תקופת דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר או 35 דקות ב 4 º C.
      הערה: קיבוע משני נעמד לו רקמת העין, אשר מסייע הרכבה (שלב 3.5).
    2. להשתמש micropipette עקירה אוויר P20 או P100 א עצה PBT-יכולתי להעביר עין-מוח מתחמי לתוך ~ 400 µL של PBT בקערת זכוכית 9-. ובכן, על קרח, לרחוץ למשך 5 דקות.
    3. חזור על השלב כביסה לפחות פעם אחת.
    4. שימוש P20 או P100 אוויר הזחה micropipette ואת משיכור למר PBT עצה כדי להעביר את מתחמי עין-מוח µL ~ 400 ל- PBS בקערת זכוכית 9-. ובכן, על קרח, לשטוף במשך 1-2 דקות לשמור את הרקמה בתנועה על ידי pipetting PBS, אבל לא את הרקמה , למעלה ולמטה כדי למנוע עין-מוח מתחמי מ מתפשרת והקפדה על המנה זכוכית במהלך שטיפה PBS.
  5. הרכבה
    1. להעביר את מתחמי עין-מוח µL ~ 200 הגוברת מדיה. להשתמש micropipette עקירה אוויר P20 או P100 א משיכור למר PBT טיפ כדי להעביר את מתחמי עין-מוח. לאפשר את הרקמה כדי equilibrate ב הרכבה מדיה עבור h 1-2.
    2. המקום טיפה µL 5-8 של הרכבה טריים מדיה לשקופית נקי במיקרוסקופ.
    3. חותכים טיפ P10 עם סכין גילוח נקי להגדיל את הטיפ-פתח ~0.5 מ"מ ברדיוס ולהשתמש זה, micropipette הזחה P10 אוויר כדי להעביר את מתחמי עין-מוח ב- 5-8 µL של הרכבה מדיה לתוך הירידה של הרכבה מדיה בשקופית.
    4. השתמש שתי מחטים טונגסטן להפריד את העיניים אופטיים אונות. להצמיד תסביך עין-מוח לשקופית עם מחט טונגסטן חסון, פורסים כל עין מן האונה אופטיים המשויכת שלה עם מחט בסדר טונגסטן (2F איור).
    5. השתמש את המחט טונגסטן בסדר לתמרן בכל עין אל פני השטח של השקופית מיקרוסקופ עם משטח הבסיס של כל עין סמוכים לשקופית. בעדינות להוריד את הכיסוי-תגית נקי על הרקמה ולאבטח עם לק.
      הערה: סידור העיניים בשקופית כך הם קרובים אחד לשני או בקו יקל מיקרוסקופ עוקבות.
    6. תמונה באדמומיות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי או פלורסנט.
      הערה: שקופיות צריך להיות מאוחסן ב 4 ° C אם לא עם תמונה מיד.

4. הכנה של רקמת העין עבור סופג המערבי:

  1. לנתח 10-16 גלמי (מדרגות 2.1-2.9) עם השינויים הבאים: א) לאסוף, לנתח את הגלמים בשתי קבוצות, 10-15 דקות אחד מהשני ומנתחים ב) ב- PBS בתוספת מעכבי פרוטאז, פוספטאז (PBS + pi).
  2. להעביר את מתחמי עין-מוח באמצעות P20 או P100 אוויר micropipette הזחה, יכולתי עצה (להכין כמו שלב 3.2.1) לתוך ~ 400 µL של PBS + pi בקערת זכוכית 9-. ובכן, על קרח, לשטוף בקצרה.
    הערה: המידע משומנים הזה יכול לשמש עבור והשלבים 4.3 ו- 4.4.
  3. חזור על השלב יש לשטוף פעמיים.
  4. העברת כל מתחמי עין-מוח לתוך ~ 400 µL של PBS קר קרח + pi יידרשו על גבי צלחת ויבתר שחור נקי.
  5. להסיר כל עין של האונות הראייה באמצעות מחט טונגסטן חסון (לייצב את המתחם עין-מוח) ומספריים גילוח בסדר או microdissection כדי לחתוך מהוללים כל עין מן האונה אופטיים.
    הערה: עיניים "סטיקי" בשלב זה, עלול לדבוק המנה ויבתר בקלילות. לזה יש יתרון זה יכול לעזור להקל על הסרת העיניים של האונות אופטיים (ראה דיון).
  6. "לטאטא" כל העיניים לערימה' ' ב- PBS + פאי על המנה ויבתר, באמצעות סכין אחד של זוג מלקחיים נאה.
  7. חותכים טיפ P10 עם סכין גילוח נקי כדי להרחיב את הפתח העצה ~0.5 מ"מ ברדיוס ולסוך העצה-הפנים על ידי pipetting המערבי רקמות פירוק מאגר (WTLB) למעלה ולמטה.
  8. להעביר את מתחמי עין-מוח ב 5 µL של PBS + pi לתוך צינור microcentrifuge µL 500. השתמש זו עצה משומנים micropipette עקירה אוויר P10 להשלים את ההעברה.
  9. במקום הצינור microcentrifuge על הקרח. להוסיף נפח 1 (5 µL) WTLB כדי המדגם, ו 10 µL 2 x ופרוטאין מרוכז דוגמת המאגר (או 2.5 µL 5 x ופרוטאין מרוכז דוגמת המאגר). מערבבים על-ידי הקשה.
  10. מערבולת microcentrifuge צינור בקצרה, ספין למטה מדגם באמצעות צנטריפוגה המצומצמת של שולחן העבודה.
  11. לאחסן את הדגימה ב-20 ° C עד הניתוח. לנתח באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים.

5. הכנה של רקמת העין לחילוץ רנ א:

  1. ללבוש כפפות, benchtop נקי, מיקרוסקופ, כלי ניתוח ושחור לנתח מנה ראשונה עם אתנול 70% ולאחר מכן RNase טיהור ריאגנט. אפשר להתייבש.
  2. לנתח 30-40 הגלמים כפי שתואר (מדרגות 2.1-2.9) עם השינויים הבאים:) אוספים ומנתחים הגלמים 6 עד 8 בקבוצות, 15-20 דקות בנפרד; b) לנתח ללא נוקלאז PBS ו c) לבודד כל אצווה של העיניים בנפרד אבל לצבור כל רקמת רשתית לתוך הצינור microcentrifuge אותו (שלב 5.5).
    הערה: יש שני אנשים לנתח בו-זמנית. נאיץ את הבידוד יעיל של רקמת עין טובה.
  3. עבור כל אצווה, לבודד את העין-מוח מתחמי (מדרגות 2.1-2.9) ואת העברת לתוך ~ 400 µL של נוקלאז ללא PBS בקערת זכוכית 9-ובכן לשטוף בקצרה, על קרח, באמצעות micropipette עקירה אוויר P20 או P100 משומנים עצה (להכין כפי שמתואר בשלב 3.1.2).
    הערה: המידע משומנים הזה יכול לשמש עבור שלבים שלאחר מכן 5.4, 5.5 ו- 5.8.
  4. חזור על השלב יש לשטוף פעמיים.
  5. העבר את מתחמי עין-מוח לתוך טיפה µL 400 טריים של PBS חינם נוקלאז קפואים על שחור נקי לנתח את המנה.
  6. להסיר כל עין של האונות הראייה באמצעות מחט טונגסטן חסון (לייצב בראש העין מורכבת) ומספריים גילוח בסדר או microdissection כדי לחתוך מהוללים כל עין מן האונה אופטיים.
    הערה: עיניים "סטיקי" בשלב זה, עלול לדבוק המנה ויבתר בקלילות. לזה יש יתרון זה יכול לעזור להקל על הסרת העיניים של האונות אופטיים (ראה דיון).
  7. "לטאטא" כל העיניים לערימה' ' ב ללא נוקלאז מגניב על המנה ויבתר, באמצעות סכין אחד של זוג מלקחיים נאה.
  8. להעביר את העיניים ללא RNase microcentrifuge צינור סטרילי, הקפאה של חנקן נוזלי.
  9. חזור על ניתוח (שלבים 5.3-5.8) שכל אצווה של הגלמים. העברת כל אצווה של עיניים לתוך הצינור microcentrifuge אותו נשמרה בחנקן נוזלי (שלב 5.5) לצבור כל העיניים בצינור אחד.
  10. לאחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס עד החילוץ-RNA.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

העין הגולמי היא רקמות נגיש בקלות המשמש כמודל מצוין לחקור תהליכים פיתוחיים מורפוגנזה כונן זה. כאן, יש פרקנו הרשתיות להשתמש immunofluorescence כדי לזהות את צמתי adherens הפסגה (איור 3 א, ג) או את קספאז Dcp-1 (איור 3D) הופעלה במהלך אפופטוזיס (איור 3)25. גישות אלה לאפשר אחד להתבונן בבירור תאים במהלך תהליכי morphogenetic מפתח כולל גיוס, מורפוגנזה התאים הראשי (מתוך 18 h APF), העיבור של סריג תאים סב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השיטה של ניתוח העין הגולמי דרוזופילה המתוארים כאן מאפשר הבידוד של 6 עד 10 מתחמי עין-מוח בתוך 10 עד 15 דקות. עם זאת, תרגול וסבלנות חיוניים על מנת לשלוט בטכניקה לנתיחה, לשפר את האיכות ואת המהירות של ניתוח. הפעם ניתוח קצר מבטיח בכל עין כ אותו התפתחותית הבמה, הפחתת השתנות בביטוי פנוטיפ או הגן של הרשתית בערכת נתונים. בעוד פרוטוקולים אלטרנטיבית עשויים לדרוש פחות התמחות להתמחות, פרוטוקול שלנו נועד באופן שיטתי לבודד רקמת רשתית עדינה תוך מזעור הסיכון של קריעה או הטיה, כי נזק לעין יכול לגרום מתח מסלול הפעלה או אפילו מוות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

אנו מודים זאק תוף וסוקרים שלנו עבור הערות מועילות על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי R15GM114729.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Adobe Photoshopתוכנת עיבוד תמונהAdobe
סדים במבוק, 6 אינץ' טד פלה בע"116
בטא מרקפטואתנולסיגמא-אולדריץ'M3148
בטא-גליצרול פוספטסיגמא-אולדריץ'50020
צלחתצלחת פטרי מזכוכית ממולאת עד השפה עם SYLG170 או SYLG184 (בצבע שחור עם אבקת פחם טחונה דק). השאירו בטמפרטורת החדר למשך 24-48 שעות לפילמור.
מחזיק להבFine Science Tools10053
אלבומין סרום בקרסיגמא-אולדריץ'A7906
cOmplete, טבליות קוקטייל מעכבות פרוטאז ללא EDTAקונפוקלי Roche
(Zeiss LSM 501)קרל זייסאו מיקרוסקופ דומה
דיאתיל פירוקרבונט (DEPC)סיגמא-אולדריץ'40718
סרט דו צדדי3M665
Drosophila מדיה למזון, עשיר בחומרים מזינים 7.5% סוכרוז, 15% גלוקוז, 2.5% אגר, 20% שמרי בירה, 5% פפטון, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20
Drosophila מדיה למזון, בלומינגטון דרוזופילה סטוק סנטר.  (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html)
חומצה אתילנדיאמינטטראצטיתסיגמא-אולדריץ'E6758
תמיסה4% פורמדהיד ב-PBS, pH 7.4.
מיקרוסקופ פלואורסצנטי (מיקרוסקופ TCS SP5 DM)Leica Microsystemsאו מיקרוסקופ דומה
מלקחיים יש לחדד מלקחייםFine ScienceTools 91150-20
פורמלדהידתרמו סיינטיפיק28908
כלי זכוכית 9 בארות קורנינג7220-85ידוע גם בשם מנות 9 בארות 
כיסויי זכוכית (22 x 22 מ"מ)פישר סיינטיפיק12-542-B
שקופיות מיקרוסקופ זכוכית (25 x 75 x 1 מ"מ)פישר סיינטיפיק12-550-413
צלחת פטרי זכוכיתקורנינג3160-100BO
גליצרולסיגמא-אולדריץ'G5516
Image Studio גרסת תוכנה 5.2.5LI-COR Biosciencesתוכנת עיבוד תמונה לכימות כתמים מערביים.
מאגר דגימת LaemmliBio-Rad161-07372X מאגר דגימת חלבון מרוכז, תוספת עם בטא מרקפטואתנול לפי הוראות היצרן.
מאגר דגימה להפחתת סמני נתיב ThermoFisher Scientific390005X מאגר דגימת חלבון מרוכז.
צינורות מיקרוצנטריגורה AxygenMCT-175-C
מספריים מיקרו-דיסקציה מגשי Microwell של Fine Science Tools15000-03
(72 x 10 ומיקרו; L wells)Nunc438733
אמצעי0.5% N-propylgallate ו-80% גליצרול ב-PBS
N-propylgallateSigma-AldrichP3130
ללא נוקלאז PBS (PBS ב-0.1% DEPC, pH 7.4)הוסף נפח מתאים של DEPC ל-PBS, ערבב היטב ודגר למשך הלילה בטמפרטורת החדר תוך ערבוב מתמיד. חיטוי למשך 20 דקות לפחות. יש לאחסן בטמפרטורה של 4&00 מעלות; C
PBS (חוצץ פוספט עם תמיסת מלח pH 7.4)Sigma-AldrichP5368הכן לפי הוראות היצרן
PBS+pi (PBS בתוספת מעכבי פרוטאז ופוסהטאז)10mM NaF, 1 מ"מ בטא-גליצרול פוספט ו-1 מ"מ Na3VO4 ב-PBS, pH 7.4.   
PBT0.15% TritonX ו-0.5% אלבומין בסרום בקר ב-PBS, pH 7.4
מחזיק פיניםFine ScienceTools 26016-12
נוגדן ראשוני: עז אנטי-GAPDHImgenexIMG-3073לכתמים מערביים. בשימוש ב-1:3000
נוגדן ראשוני: ארנב אנטי-שסוע Dcp-1איתות תאים9578Sלאימונופלואורסצנטיות. בשימוש בשעה 1:100
נוגדן ראשוני: מחקרים התפתחותיים נגד DEcad של חולדותבנק היברידומהDCAD2לאימונופלואורסצנטיות. בשימוש בשעה 1:20
נוגדן ראשוני: אנטי-DEcad של חולדהDOI: 10.1006/dbio.1994.1287DCAD1  מתנה מטדאשי אומורה. בשימוש בשעה 1:100.
ערכת תוספת RNA: ערכת Relia Prep לרקמת RNA Miniprep PromegaZ6110
מגיב טיהור Rnase (RNase Away)מוצרים ביולוגיים מולקולריים7002
להבי אזמלFine Science Tools10050נתק חתיכה קטנה של להב סקיפל ואבטח במחזיק הלהב.
נוגדן משני: 488-מצומד  חמור נגד חולדות IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch712-545-153לאימונופלואורסצנטי. בשימוש בשעה 1:200
נוגדן משני: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch111-165-144לאימונופלואורסצנטי. בשימוש בשעה 1:100
נוגדן משני: HRP מצומד עז נגד חולדות IgG (H+L)טכנולוגיית איתות תאים7077לכתמים מערביים. בשימוש בשעה 1:3000
נוגדן משני: ארנב מצומד HRP נגד עזים IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch305-035-003לכתמים מערביים. בשימוש ב 1:3000
נתרן כלורידסיגמא-אולדריץ'S3014
נתרן פלואורידסיגמא-אולדריץ'215309
נתרן ונדאטסיגמא-אולדריץ'50860
ספקטרופוטומטר (NanoDrop)ThermoFisher Scientific2000c 
מיקרוסקופ ניתוח סטריאו (M60 או M80)Leica Microsystemsאו מיקרוסקופ דומה
Sylgard (שחור)Dow CorningSYLG170
Sylgard (שקוף)Dow CorningSYLG184צבע שחור עם אבקת שרקול טחונה דק
רקמה: KimwipesKIMTECH34120
TritonXSigma-AldrichT8787
Trizma hydrochloride pH7.5Sigma-AldrichT5941
מחט טונגסטן, עדינהFine Science Tools10130-10הכנס למחזיק סיכה
מחט טונגסטן, FineScience Tools10130-20הכנס למחזיק סיכה
WTLB (מאגר ליזה של רקמות מערביות)150 מ"מ NaCl, 1.5% טריטון X-100, 1 מ"מ EDTA, 20% גליצרול, 10 מ"מ NaF, 1 מ"מ בטא-גליצרול פוספט ו-1 מ"מ Na3VO4 ב-50 מ"מ Tris-HCl (pH 7.5). תוסף עם שולחן קוקטייל פרוטאז cOmplete אחד לכל תמיסה של 10 מ"ל.
משחת שמרים(סופרמרקט מקומי)כ -2 כפות שמרים פעילים יבשים של פליישמן (או דומים) מומסים ב ~ 20 מ"ל מזוקק H2< / sub>O
מ חיתוך שחורה מיקרוסקופ 4693132001 מתכון קמח תירס סטנדרטי של מקבעת של לעתים קרובות. הרכבה

מקורות

  1. Cagan, R. L., Ready, D. F. The emergence of order in the Drosophila pupal retina. Developmental biology. 136 (2), 346-362 (1989).
  2. Wolff, T., Ready, D. The development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview. 1277-1325 (1993).
  3. Carthew, R. W. Pattern formation in the Drosophila eye. Current opinion in genetics & development. 17 (4), 309-313 (2007).
  4. Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Developmental Dynamics. 241 (1), 136-149 (2012).
  5. Hayashi, T., Carthew, R. W. Surface mechanics mediate pattern formation in the developing retina. Nature. 431, 647(2004).
  6. Bao, S., Cagan, R. Preferential Adhesion Mediated by Hibris and Roughest Regulates Morphogenesis and Patterning in the Drosophila Eye. Developmental Cell. 8 (6), 925-935 (2016).
  7. Cordero, J. B., Larson, D. E., Craig, C. R., Hays, R., Cagan, R. Dynamic Decapentaplegic signaling regulates patterning and adhesion in the Drosophila pupal retina. Development (Cambridge, England). 134 (10), 1861-1871 (2007).
  8. Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. Cellular behavior in the developing Drosophila pupal retina. Mechanisms of development. 125 (3-4), 223-232 (2008).
  9. Martín-Bermudo, M. D., Bardet, P. L., Bellaïche, Y., Malartre, M. The vav oncogene antagonises EGFR signalling and regulates adherens junction dynamics during Drosophila eye development. Development. 142 (8), 1492-1501 (2015).
  10. Chan, E. H., Chavadimane Shivakumar, P., Clément, R., Laugier, E., Lenne, P. F. Patterned cortical tension mediated by N-cadherin controls cell geometric order in the Drosophila eye. eLife. 6, e22796(2017).
  11. Lin, H. V., Rogulja, A., Cadigan, K. M. Wingless eliminates ommatidia from the edge of the developing eye through activation of apoptosis. Development. 131 (10), 2409-2418 (2004).
  12. Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye. Mechanisms of development. 121 (12), 1523-1530 (2004).
  13. Mendes, C. S., et al. Cytochrome c‐d regulates developmental apoptosis in the Drosophila retina. EMBO reports. 7 (9), 933-939 (2006).
  14. Monserrate, J., Brachmann, C. B. Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye. Cell Death & Differentiation. 14 (2), 209-217 (2007).
  15. Bushnell, H. L., et al. JNK is antagonized to ensure the correct number of interommatidial cells pattern the Drosophila retina. Developmental Biology. 433 (1), 94-107 (2018).
  16. Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, (2007).
  17. Hsiao, H. Y., et al. Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas. Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4347(2012).
  18. Tea, J. S., Cespedes, A., Dawson, D., Banerjee, U., Call, G. B. Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (93), e52315(2014).
  19. Johnson, R. I., Cagan, R. L. A Quantitative Method to Analyze Drosophila Pupal Eye Patterning. PLoS ONE. 4 (9), e7008(2009).
  20. Greenspan, R. J. Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).
  21. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  22. Ellis, M. C., O'Neill, E. M., Rubin, G. M. Expression of Drosophila glass protein and evidence for negative regulation of its activity in non-neuronal cells by another DNA-binding protein. Development. 119 (3), 855-865 (1993).
  23. Duffy, B. J. GAL4 system in drosophila: A fly geneticist's swiss army knife. genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  24. Li, W. Z., Li, S. L., Zheng, H. Y., Zhang, S. P., Xue, L. A broad expression profile of the GMR-GAL4 driver in Drosophila melanogaster. Genet Mol Res. 11 (3), 1997-2002 (2012).
  25. Song, Z., McCall, K., Steller, H. DCP-1, a Drosophila Cell Death Protease Essential for Development. Science. 275 (5299), 536-540 (1997).
  26. Hay, B. A., Wassarman, D. A., Rubin, G. M. Drosophila homologs of baculovirus inhibitor of apoptosis proteins function to block cell death. Cell. 83 (7), 1253-1262 (1995).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

קומפלקס עין-מוחפרוטוקול מיקרו-דיסקציהאנליזת אימונוהיסטוכימיהאנליזת Western Blotשיטה לבידוד RNAדיסקציית עין של בובהפרוטוקול קיבוע רקמותאינקובציית נוגדניםהרכבת זכוכית למסגרת מיקרוסקופית
דיסקציה של הרשתית הגולמי דרוזופילה אימונוהיסטוכימיה, ניתוח המערבי של RNA בידוד
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.