Method Article

לימוד השפעות קרינת העור נורמלי באמצעות מטריקס הידרותאי הידרו

DOI:

10.3791/59304

⸱

July 24th, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Vanderbilt University, 2Department of Radiation Oncology, Stanford University, 3Depattment of Biomedical Engineering, Vanderbilt University, 4Department of Radiation Oncology, Vanderbilt University Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציג שיטה לdecellularization והיווצרות הידרוג'ל עוקבות אחר הקרנה של שומן החלב של מורלין לאחר ההקרנה vivo ex.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קרינה היא טיפול עבור חולים עם סרטן שד שלילי משולשת. ההשפעה של הקרינה על מטריצה החילוץ (ECM) של רקמת השד בריא תפקידה בהישנות המקומי באתר הגידול העיקרי אינם ידועים. כאן אנו מציגים שיטה לdecellularization, ליטוטיזציה ולייצור של הידרוג ECM הנגזרים מרפידות שומן החלב של מורלין. תוצאות מוצגות על האפקטיביות של התהליך decellularization, ופרמטרים rheological העריכו. GFP-ו לוציפראז-התווית תאים סרטן השד כדוריות בהידרוג הפגינו גידול התפשטות של הידרוג הוקרן. לבסוף, phalloidin כתמים המשלים היה מועסק להמחיש את הארגון השלד של תאים סרטניים כימוס. המטרה שלנו היא להציג שיטה עבור בדיית הידרולים עבור מחקר מתורבת המחקים את הסביבה רקמת השד vivo התגובה שלה קרינה על מנת ללמוד התנהגות תא הגידול.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סרטן מאופיין התפשטות עודפת של תאים שיכולים להתחמק אפופטוזיס וגם גרורות לאתרים מרוחקים1. סרטן השד היא אחת הצורות הנפוצות ביותר בקרב הנקבות בארה ב, עם מוערך 266,000 מקרים חדשים ו 40,000 מקרי מוות ב 20182. אגרסיבי במיוחד וקשה לטיפול סוג המשנה הוא סרטן שד שלילי משולשת (TNBC), אשר חסר קולטן אסטרוגן (ER), קולטן פרוגסטרון (PR), ואת גורם הצמיחה באפידרמיס האנושית (HER2). טיפול בהקרנות משמש בדרך כלל בסרטן השד כדי למנוע תאים סרטניים שיורית בעקבות כריתת גוש, אבל מעל 13% מהחולים TNBC עדיין לחוות הישנות באתר הגידול העיקרי3.

ידוע כי טיפול בהקרנות יעיל ב גרורות והישנות משום שילוב של כר....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לימודי בעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות ולפרוטוקולים המוסדיים שאושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת ואנדרבילט.

1. הכנה והקרנה vivo ex של MFPs

  1. הקריבו עכברים Nu/Nu (8 – 10 שבועות) באמצעות שיתוף2 חנק ואחריו פריקה צוואר הרחם.
  2. לנקות את העור באמצעות 70% אתנול.
  3. לאסוף רפידות שומן החלב (MFPs) מפני עכברים הוקרב באמצעות מספריים טרום מעוקר ומלקחיים בצינור 15 מ ל חרוט המכיל מדיה RPMI מלאה (RPMI שיושלם עם 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו-10% סרום בקר עוברי) (לראות את הטבלה של חומרים ).
  4. הקרינים דגימות ל-20 Gy באמצעות מקור צסיום.
  5. להביא את mfps לקרינה ומדיה מלאה RPMI לת....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MFPs היו decellularized בעקבות הקרנה באמצעות ההליך המוצג באיור 1A. MFPs pre-decellularization (איור 1B) ו-post-Decellularization (איור 1b) מוצגים. Decellularization אושרה באמצעות המטאוקסילין ו-אאוזין (H & E) כתמים, ו-1-([4-(Xylylazo) "אזו" -2-נפתלי מכתים שימש להערכת תוכן השומנים (איור 2). תכונות רטיולוגית של ההידרוג'ל ECM העריכו גם ב 37 ° צ' (איור 3). מודול האחסון היה גבוה יותר מאשר מודול ההפסד עבור כ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטה זו של יצירת הידרוג'ל תלויה במידה רבה בכמות של הרקמה ההתחלתית. מוריין MFPs הם קטנים, והתהליך הdecellularization מביא לירידה משמעותית בחומר (שולחן 1). התהליך יכול לחזור עם יותר MFPs כדי להגדיל את התשואה הסופית. כרסום הוא צעד חשוב נוסף שעלול לגרום לאובדן החומר. אחרים הראו הצלחה עם טחנת קריוגני, אבל פרוטוקול זה מבוסס על כרסום באמצעות מרגמה כף יד ומקדחה חשמלית עם אביזר מצורף8,17. הדבר מכיל את היתרון של עלויות הון נמוכות ומזעור אובדן חומרים, אך עש.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לד ר לאורה ל. ברוסארט על מתן התאים הגFP והלוציפריאז-4T1, ד ר אדוארד ל. לייורי לקבלת ייעוץ ב-1-([4-(Xylyzo) "אזו" -2-נפתלי כתמים, ד ר קרייג ל. דובאל עבור איביס וליטוליזר שימוש, וד ר סקוט א. גוכר לראומטר השתמש. מחקר זה היה נתמך כספית על ידי מלגת NIHR00CA201304.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10% פורמלין ניטרלי חוצץ, קובייה עם שקעVWR16004-128-2-מתילבוטן
אלפא Aesar19387-AR
2000ex ריאומטרTA Instruments10D4335ריאומטר
סרום בקר אלבומיןסיגמא-אולדריץ'A1933-25G-calcein
acetoxymethyl (calcein AM)בדיקות מולקולריות, בע"מ.C1430-D-לוציפרין
גחלילית, מלח אשלגןביוסינת' כימיה & ביולוגיהL-8820(S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic חומצה מלח אשלגן
DPX תושבת להיסטולוגיהSigma-Aldrich06522-500ML-Dulbecco
תמיסת מלח חוצצת פוספטGibco14040133-Eosin-Y
עם פלוקסיןריצ'רד-אלן סיינטיפיק71304אאוזין
אתידיום הומודימרבדיקות מולקולריות בע"מE1169אתידיום הומודימר-1 (EthD-1)
סרום בקר עובריסיגמא-אולדריץ'F0926-500ML-רקמת
בריאות פישר-פלוס O.C.T. תרכובתפישר סיינטיפיק23-730-571מדיום הטמעת קריוסטט
Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01מדיום הרכבה מבוסס מימי
FreeZone 4.5Labconco7751020ליופילייזר
Hoechst 33342 תמיסה (20 מ"מ)Thermo Scientific62249צבע פלואורסצנטי כחול
חומצה הידרוכלוריתסיגמא-אולדריץ'258148-500ML-IVIS
Lumina IIIPerkinElmerCLS136334מערכת הדמיה ביולומינסנציה
Kimtech Science KimwipesKimberly Clarkמגבוני
משימות עדיניםn-פרופנול (ללא חמצן/ריצוף), פישר ביו-ריאגנטיםפישר סיינטיפיקBP1130-500-שמן
אדום Oסיגמא-אולדריץ'O0625-25G1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol
OPS Diagnostics CryoGrinderOPS Diagnostics, LLCCG-08-02-PBS
(10X), pH 7.4איכות ביולוגית, בע"מ.119-069-151תמיסת מלח חוצצת פוספט
פניצילין-סטרפטומיציןגיבקו15140-122-פפסין
מרירית קיבה חזיריתסיגמא-אולדריץ'P6887-5Gפפסין
חומצה פראצטיתסיגמא-אולדריץ'77240-100ML-פלואידין-iFluor
594 מגיב (ab176757)abcamab176757מצומד
פלואידיןפרופילן גליקולסיגמא-אולדריץ'W294004-1KG-K-ריצ'רד-אלן
סדרת חתימה מדעית מגיב כחולריצ'רד-אלן סיינטיפיק7301Lחומר הכחול
ריצ'רד-אלן סיגנרל סיינטיפיק סדרת המטוקסילין 7211ריצ'רד-אלן סיינטיפיק7211-RPMI
בינוני 1640ג'יבקו11875-093-נתרן
דאוקסיכולאט, 98%Frontier ScientificJK559522חומצה דאוקסיקולית
סוכרוזSigma-AldrichS5016-Triton
x-100Sigma-AldrichX100-100MLem>t-Octylphenoxypolyethoxyethanol
Trypsin-EDTA (0.25%), פנול אדוםGibco25200-056-Whatman
נייר סינון איכותי, כיתה 4Whatman1004-110נייר סינון איכותי בדרגה 4
Xylenes (מוסמך ACS), פישר כימיקלפישר סיינטיפיקX5-4-
<

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
  3. Lowery, A. J., Kell, M. R., Glynn, R. W., Kerin, M. J., Sweeney, K. J.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Extracellular Matrix HydrogelsRadiation EffectsDecellularization ProcessMurine Mammary Fat PadHydrogel FabricationRheological PropertiesCell Proliferation AssayPhalloidin Conjugate StainingFluorescence MicroscopyScanning Electron Microscopy

Related Articles