פרוטוקול זה מציג שיטה לdecellularization והיווצרות הידרוג'ל עוקבות אחר הקרנה של שומן החלב של מורלין לאחר ההקרנה vivo ex.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
לימוד השפעות קרינת העור נורמלי באמצעות מטריקס הידרותאי הידרו
במאמר זה
סיכום
תקציר
קרינה היא טיפול עבור חולים עם סרטן שד שלילי משולשת. ההשפעה של הקרינה על מטריצה החילוץ (ECM) של רקמת השד בריא תפקידה בהישנות המקומי באתר הגידול העיקרי אינם ידועים. כאן אנו מציגים שיטה לdecellularization, ליטוטיזציה ולייצור של הידרוג ECM הנגזרים מרפידות שומן החלב של מורלין. תוצאות מוצגות על האפקטיביות של התהליך decellularization, ופרמטרים rheological העריכו. GFP-ו לוציפראז-התווית תאים סרטן השד כדוריות בהידרוג הפגינו גידול התפשטות של הידרוג הוקרן. לבסוף, phalloidin כתמים המשלים היה מועסק להמחיש את הארגון השלד של תאים סרטניים כימוס. המטרה שלנו היא להציג שיטה עבור בדיית הידרולים עבור מחקר מתורבת המחקים את הסביבה רקמת השד vivo התגובה שלה קרינה על מנת ללמוד התנהגות תא הגידול.
מבוא
סרטן מאופיין התפשטות עודפת של תאים שיכולים להתחמק אפופטוזיס וגם גרורות לאתרים מרוחקים1. סרטן השד היא אחת הצורות הנפוצות ביותר בקרב הנקבות בארה ב, עם מוערך 266,000 מקרים חדשים ו 40,000 מקרי מוות ב 20182. אגרסיבי במיוחד וקשה לטיפול סוג המשנה הוא סרטן שד שלילי משולשת (TNBC), אשר חסר קולטן אסטרוגן (ER), קולטן פרוגסטרון (PR), ואת גורם הצמיחה באפידרמיס האנושית (HER2). טיפול בהקרנות משמש בדרך כלל בסרטן השד כדי למנוע תאים סרטניים שיורית בעקבות כריתת גוש, אבל מעל 13% מהחולים TNBC עדיין לחוות הישנות באתר הגידול העיקרי3.
ידוע כי טיפול בהקרנות יעיל ב גרורות והישנות משום שילוב של כר....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
לימודי בעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות ולפרוטוקולים המוסדיים שאושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת ואנדרבילט.
1. הכנה והקרנה vivo ex של MFPs
- הקריבו עכברים Nu/Nu (8 – 10 שבועות) באמצעות שיתוף2 חנק ואחריו פריקה צוואר הרחם.
- לנקות את העור באמצעות 70% אתנול.
- לאסוף רפידות שומן החלב (MFPs) מפני עכברים הוקרב באמצעות מספריים טרום מעוקר ומלקחיים בצינור 15 מ ל חרוט המכיל מדיה RPMI מלאה (RPMI שיושלם עם 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו-10% סרום בקר עוברי) (לראות את הטבלה של חומרים ).
- הקרינים דגימות ל-20 Gy באמצעות מקור צסיום.
- להביא את mfps לקרינה ומדיה מלאה RPMI לת....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
MFPs היו decellularized בעקבות הקרנה באמצעות ההליך המוצג באיור 1A. MFPs pre-decellularization (איור 1B) ו-post-Decellularization (איור 1b) מוצגים. Decellularization אושרה באמצעות המטאוקסילין ו-אאוזין (H & E) כתמים, ו-1-([4-(Xylylazo) "אזו" -2-נפתלי מכתים שימש להערכת תוכן השומנים (איור 2). תכונות רטיולוגית של ההידרוג'ל ECM העריכו גם ב 37 ° צ' (איור 3). מודול האחסון היה גבוה יותר מאשר מודול ההפסד עבור כ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שיטה זו של יצירת הידרוג'ל תלויה במידה רבה בכמות של הרקמה ההתחלתית. מוריין MFPs הם קטנים, והתהליך הdecellularization מביא לירידה משמעותית בחומר (שולחן 1). התהליך יכול לחזור עם יותר MFPs כדי להגדיל את התשואה הסופית. כרסום הוא צעד חשוב נוסף שעלול לגרום לאובדן החומר. אחרים הראו הצלחה עם טחנת קריוגני, אבל פרוטוקול זה מבוסס על כרסום באמצעות מרגמה כף יד ומקדחה חשמלית עם אביזר מצורף8,17. הדבר מכיל את היתרון של עלויות הון נמוכות ומזעור אובדן חומרים, אך עש.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
המחברים מודים לד ר לאורה ל. ברוסארט על מתן התאים הגFP והלוציפריאז-4T1, ד ר אדוארד ל. לייורי לקבלת ייעוץ ב-1-([4-(Xylyzo) "אזו" -2-נפתלי כתמים, ד ר קרייג ל. דובאל עבור איביס וליטוליזר שימוש, וד ר סקוט א. גוכר לראומטר השתמש. מחקר זה היה נתמך כספית על ידי מלגת NIHR00CA201304.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 10% פורמלין ניטרלי חוצץ, קובייה עם שקע | VWR | 16004-128-2-מתילבוטן | |
| אלפא Aesar | 19387-AR | ||
| 2000ex ריאומטר | TA Instruments | 10D4335 | ריאומטר |
| סרום בקר אלבומין | סיגמא-אולדריץ' | A1933-25G-calcein | |
| acetoxymethyl (calcein AM) | בדיקות מולקולריות, בע"מ. | C1430-D-לוציפרין | |
| גחלילית, מלח אשלגן | ביוסינת' כימיה & ביולוגיה | L-8820 | (S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic חומצה מלח אשלגן |
| DPX תושבת להיסטולוגיה | Sigma-Aldrich | 06522-500ML-Dulbecco | |
| תמיסת מלח חוצצת פוספט | Gibco | 14040133-Eosin-Y | |
| עם פלוקסין | ריצ'רד-אלן סיינטיפיק | 71304 | אאוזין |
| אתידיום הומודימר | בדיקות מולקולריות בע"מ | E1169 | אתידיום הומודימר-1 (EthD-1) |
| סרום בקר עוברי | סיגמא-אולדריץ' | F0926-500ML-רקמת | |
| בריאות פישר-פלוס O.C.T. תרכובת | פישר סיינטיפיק | 23-730-571 | מדיום הטמעת קריוסטט |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | מדיום הרכבה מבוסס מימי |
| FreeZone 4.5 | Labconco | 7751020 | ליופילייזר |
| Hoechst 33342 תמיסה (20 מ"מ) | Thermo Scientific | 62249 | צבע פלואורסצנטי כחול |
| חומצה הידרוכלורית | סיגמא-אולדריץ' | 258148-500ML-IVIS | |
| Lumina III | PerkinElmer | CLS136334 | מערכת הדמיה ביולומינסנציה |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark | מגבוני | |
| משימות עדיניםn-פרופנול (ללא חמצן/ריצוף), פישר ביו-ריאגנטים | פישר סיינטיפיק | BP1130-500-שמן | |
| אדום O | סיגמא-אולדריץ' | O0625-25G | 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol |
| OPS Diagnostics CryoGrinder | OPS Diagnostics, LLC | CG-08-02-PBS | |
| (10X), pH 7.4 | איכות ביולוגית, בע"מ. | 119-069-151 | תמיסת מלח חוצצת פוספט |
| פניצילין-סטרפטומיצין | גיבקו | 15140-122-פפסין | |
| מרירית קיבה חזירית | סיגמא-אולדריץ' | P6887-5G | פפסין |
| חומצה פראצטית | סיגמא-אולדריץ' | 77240-100ML-פלואידין-iFluor | |
| 594 מגיב (ab176757) | abcam | ab176757 | מצומד |
| פלואידיןפרופילן גליקול | סיגמא-אולדריץ' | W294004-1KG-K-ריצ'רד-אלן | |
| סדרת חתימה מדעית מגיב כחול | ריצ'רד-אלן סיינטיפיק | 7301L | חומר הכחול |
| ריצ'רד-אלן סיגנרל סיינטיפיק סדרת המטוקסילין 7211 | ריצ'רד-אלן סיינטיפיק | 7211-RPMI | |
| בינוני 1640 | ג'יבקו | 11875-093-נתרן | |
| דאוקסיכולאט, 98% | Frontier Scientific | JK559522 | חומצה דאוקסיקולית |
| סוכרוז | Sigma-Aldrich | S5016-Triton | |
| x-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | em>t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| Trypsin-EDTA (0.25%), פנול אדום | Gibco | 25200-056-Whatman | |
| נייר סינון איכותי, כיתה 4 | Whatman | 1004-110 | נייר סינון איכותי בדרגה 4 |
| Xylenes (מוסמך ACS), פישר כימיקל | פישר סיינטיפיק | X5-4 | - |
מקורות
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
- Lowery, A. J., Kell, M. R., Glynn, R. W., Kerin, M. J., Sweeney, K. J.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
