Method Article

לאחר בידול מחדש של תא גזע האדם Pluriפוטנטי-הנוירונים הנגזרים עבור הקרנת תוכן גבוה של Neuritogenesis והתבגרות סינפסה

DOI:

10.3791/59305

⸱

August 28th, 2019

 ,  ,  , 
1Division of Biological Sciences, University of California, San Diego, 2Sanford Consortium for Regenerative Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר הליך מפורט עבור השעיית מחדש ו culturing תא גזע אנושי נגזר שהיו הבדיל בעבר מושלתי עצביים בתוך מבחנה במשך שבועות מרובים. ההליך מאפשר הדמיה מבוססי מבוסס על neurites, סינפסות, וסמנים מאוחר ביטוי עצבי בפורמט תואם עם מיקרוסקופ אור והקרנת תוכן גבוה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נוירונים הבדיל בתרבות דו מימדית מפני הגזע האנושי האנטי-עוצמה הנגזר של התאים (NPCs) מייצגים מערכת מודל רבת עוצמה כדי לחקור מנגנוני מחלות ולבצע הקרנת תוכן גבוה (HCS) כדי לחקור תרכובת ספריות או לזהות פנוטיפים מוטציה של גנים. עם זאת, עם התאים האנושיים המעבר NPC כדי פונקציונלי, בוגרת תא העצב דורש מספר שבועות. הסינפסות בדרך כלל להתחיל להיווצר לאחר 3 שבועות של בידול בתרבות דופלקס, ומספר חלבונים ספציפיים לעצב, למשל מאוחר יותר המבטא פאן-עצבי סמן neun, או השכבה 5/6 מוחין תא העצב הקליפת המוח סמן CTIP2, להתחיל לבטא סביב 4-5 שבועות לאחר בידול. זמן זה בידול ארוך יכול להיות בלתי תואם עם תנאי התרבות האופטימלית המשמש נפח קטן, multi-היטב פלטפורמות HCS. בין האתגרים הרבים הינם הצורך בתאים מבוזרים ומפוזרים בצורה אחידה עם אשכולות תאים מינימליים, והליכי תרבות המאומצים על הכדאיות ארוכת הטווח וההבשלה הפונקציונלית של הסינפסה. גישה אחת היא להבדיל נוירונים בפורמט גדול נפח, ואז לשחזר אותם בשלב מאוחר יותר ב HCS תואם multi-בארות. כמה אתגרים עיקריים כאשר משתמשים בגישה זו ציפוי מחדש מודאג הכדאיות ויכולת התאים, בשל שיבוש מלחיץ של רשת הדנדריטים והאקונאליות. כאן אנו מדגימים הליך מפורט ואמין עבור השעיית האדם המושרה בצורה מבחינה אנזיבית (היפנוטית)-נגזר הנוירונים לאחר הבידול שלהם עבור 4-8 שבועות בפורמט גדול של נפח, העברת אותם 384-היטב microtiter צלחות, ו culturing אותם לעוד 1-3 שבועות עם הישרדות תא מעולה. זה ציפוי מחדש של נוירונים אנושיים לא רק מאפשר את המחקר של הרכבה סינפסה בתוך שבועיים מחדש, אבל גם מאפשר מחקרים של התחדשות neurite ומאפיינים חרוט הצמיחה. אנו מספקים דוגמאות של asuritogenesis ו synaptogenesis באמצעות פלטפורמת 384-היטב.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תא גזע האדם בעוצמה מרבית (היפנוטית)-הנוירונים הנגזרים רלוונטיים יותר ויותר בתחומים של מחקר בסיסי, פיתוח סמים, ורפואה משובי. זרימות עבודה ופרוצדורות כדי לייעל את התרבות שלהם ואת התחזוקה, ולשפר את היעילות של בידול לתוך תת נוירואליות ספציפיים, מתפתחים במהירות1,2. כדי לשפר את השירות ואת עלות האפקטיביות של תאי גזע האדם הנגזרים הנוירונים כמו מערכות מודל הקלה לניתוח תוכן גבוה בגילוי סמים ואימות היעד, זה שימושי כדי להקטין את זמן culturing הנדרש כדי ליצור בוגרת, פונקציונלי נוירונים, תוך שמירה על החוסן המקסימלי, התוכסות, ו-פנוטיפ. למרות תרבויות תלת ממדיות אורגנואיד הם הנהיגה פריצות דרך במחקר נוירופיתוח מחקר3, 2-מימדי התרבויות תואמות במיוחד עם יישומים מבוססי הדמיה אוטומטית בשל עובי רקמת מינימלי שלהם.

עם זאת, הסתגלות של שיטות הסינון המבוססות על הדמיה למודלים של מחלה נוירולוגית ונוירו-התפתחותית של האדם פרצופים אתגר גדול. מפרקי הזמן הארוכים שבהם מערכת העצבים האנושית מתבשלה בvivo מחייבת הארכה של התרבות כדי להכיל תוכניות טבעיות של ביטוי גנים ולהשיג התבגרות עצבית.

אחת ההשלכות המעשיות של התוכנית הארוכה בידול עצבי הוא כי התחזוקה של תרבויות מונאולאייה הנגזרות חייב להיות מתמשך במשך שבועות רבים כדי להשיג בגרות סינפסה נאותה. בתקופה זו, הושלתי העצביים שנותרו מובחן ממשיכים להתחלק. אלה יכולים להגדיל במהירות את התרבות ולגזול את התוכן התזונתי הנדרש כדי לשמור על הנוירונים קיימא postmitotic. במרץ מחלק את התאים העצביים (NPCs) יכול גם להתחרות עם נוירונים עבור המצע הצמיחה. זה יכול להפוך את התרבויות כגון בעיות של הדבקה גרועה, מצב בלתי מתאים עבור הדמיה מבוססי assays אומר. יתר על כן, חוקרים רבים מוצאים כי נפח התרבות קטן יותר, הקושי לשמור על אוכלוסיות בריאות של נוירונים הבדיל מספיק זמן כדי להתבונן בשלבים המאוחרים של בידול עצבי. במילים אחרות, בחני התבגרות סינפסה באמצעות הקרנת תוכן גבוה (hcs) גישות יכול להיות מאוד מאתגר עבור נוירונים אנושיים נגזר.

כדי לעקוף כמה בעיות אלה, הליך של השעיית מחדש וציפוי מחדש שונות בעבר נוירונים הנגזרים הנגזרות השתמשו. ראשית, זה מאפשר את המחקר של neurite מוצלח (או, מדויק יותר, neurite התחדשות) באוכלוסייה של נוירונים מחויבים לחלוטין. שנית, את הציפוי של הנוירונים הבדיל בעבר מתבנית נפח גדול (כמו 10 לוחות ס"מ או גדול יותר), למטה לתבניות נפח קטן (כמו hcs תואם 96-או 384-ובכן מיקרוטיטר צלחות) מאפשר הפחתה משמעותית בזמן הכולל culturing ב המצב הקטן של אמצעי האחסון. זה מקל על המחקר של הרכבה סינפסה והתבגרות במשך השבועות הבאים בתוך מבחנה.

עם זאת, הציפוי של נוירונים בוגרים שכבר הקימו neurites ארוך ורשת קישוריות מורכבת מציג אתגרים מספר, אחד מהם הוא שיעור גבוה לפעמים משתנה של מוות תאים. כאן, אנו מתארים הליך מחדש שתוצאתו הישרדות תא מעולה והתוכסות. בדרך כלל, נוירונים חשופים אנזימים פרוטטרמין לתקופות דגירה קצר (בדרך כלל ~ 3-10 דקות) על מנת לנתק את התאים מן המצע לפני trituration. הזמן הקצר פרוטפוליזיס זה נוהג להשתמש עבור השעיית מחדש והפסמות סוגים רבים של תאים מפרידים, כולל תאים נוירוונונאליות מובחן ושלתי4,5,6. עם זאת, עבור נוירונים הבדיל הנושאת ארוך, neurites מחוברים, זה חיוני לא רק לנתק תאים מן המצע אלא גם לשבש את הרשת הדנדריטים ו סיבי כדי לבודד תאים בודדים תוך מזעור נזק. אכן, משעבוד עבה של נוירונים בדרך כלל נוטה להתנתק מהמצע כסדין אחד, ולא כתאים בודדים. אם הטיפול לא נלקח כדי לשחרר את הרשת עבה של neurites, נוירונים לא רק להיות ניזוק הפוך במהלך trituration, אבל רבים מהם לא לעבור דרך המסנן המשמש להסרת הגושים, וכתוצאה מכך התשואה התא המסכן. בהמשך אנו מתארים שינוי פשוט הליך הדגירה הנפוצה השימוש הפרוטאז לנגד הקשיים האלה.

בפרוטוקול המתואר להלן, הנוירונים מודבטים עבור 40-45 דקות עם פרוטאז קלה, כגון אנזים פרוטנוגד חרדה (למשל, Accutase). במהלך 5-10 הראשון מינימום לאחר הוספת האנזים, הרשת העצבית מרימה את המצע כגיליון. דגירה המשיכה הפרוטאז עבור 30-40 דקות נוספות לפני שתמשיך באמצעות נשחקו עדין וסינון. זמן דגירה נוסף זה מסייע להבטיח כי העיכול של החומר מרגיע את הרשת הבין-תאית, ובכך להבטיח כי הטריטורציה הבאה מייצרת השעיה של תאים בודדים. הליך זה מגדיל את אחידות התפלגות התאים בעת ציפוי מחדש תוך מזעור מוות התאים. החלתי בהצלחה את השיטה לציפוי מחדש לתרבויות הנוירואליות שנוצרו על ידי פרוטוקולי בידול שונים7,8 ומקווים שונים של hiPSCs. ההליך מתאים בעיקר לשימוש עם רוב או כל הקווים של תאי גזע נגזר הנגזרים. ראינו כי זמן דגירה מורחבת פרוטאז לא חיוני לחלוטין לציפוי תרבויות מלוחות בפורמט קטן (למשל, 35 מ"מ קוטר); עם זאת, כפי שאנו מראים כאן, הוא מספק יתרון משמעותי בעת ציפוי מחדש של צלחות בקוטר גדול (למשל, 10 ס"מ קוטר או גדול יותר), כנראה בגלל neurites בצלחות כאלה יכול להאריך תהליכים ארוכים מאוד וליצור מערך מחובר בצפיפות.

כאן אנו מדגימים שיטה זו ולהמחיש בקצרה את היישום שלה ב-asuritogenesis מוקדם ועבור התבגרות סינפסה, אשר כרוכה באשכולות של חלבונים טרום וסינפטית לאורך הדנדריטים ואקסונים, ואחריו מאוחר יותר לוקליזציה באתרי סינפטית. הדוגמאות מדגישות את היתרונות שפרוטוקול זה מציע בשימור הכדאיות של התאים והתוכסות. ראשית, היא מאפשרת לחוקרים ללמוד צעדים מוקדמים של האדם neuritogenesis. ההגדרה הניסיונית דומה התרבויות הראשיות בשימוש נפוץ של קליפת המוח מכרסם או נוירונים היפוקמאל, איפה התאים מופקים מאוחר או מוקדם לאחר לידה מוחית הלידה, התיר על ידי נשחקו לאחר טיפול פרוטאז עדין, ומותר ל ליזום neurites או להתחדש neurites שנותקו בהליך9,10. בדומה לנוירונים כאלה הראשי מכרסם, הנוירונים הנגזרים הנגזרות להתחיל טופס או לחדש neurites שלהם בתוך שעות לאחר הציפוי, המאפשר הדמיה של גביעי צמיחה ומורפולוגיה neurite בסביבה אופטימלית עבור הדמיה גבוהה זמן רקתית עם פחות תאים מובחן המקיפים. הבחנו כי neurite מוצלח מסונכרן יותר לעומת עיכובים משתנים שונים שיעורי מוצלח לראות כאשר הנוירונים הראשונים מתחילים להבדיל מאוכלוסיית הקדמון. בנוסף, ציפוי מחדש מאפשר בחני של נוירונים המבטא סמנים בעלי משנה עצביים בדרך כלל מופיעים בשלב מאוחר יותר בהתפתחות העצבית, כגון שכבת קליפת הביצה 5/6 שעתוק מקדם CTIP2 (עוף אובלבומין הזרם המקדם של שעתוק מיזם חלבון מקדם אינטראקציה 2), או הסמן הפאן-עצבי NeuN11. תכונה שימושית במיוחד של הגישה החוזרת היא כי synaptogenesis ההכנסות בתוך מסגרת זמן תואם HCS.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תקופת הבידול לפני ציפוי מחדש

  1. להבדיל נוירונים על 10 ס מ מנות, באמצעות פרוטוקול של בחירה7,8 עד נוירונים יצרו רשת עבה עם התהליכים שלהם ומבטאים לא רק סמנים עצביים מוקדם כגון MAP2 או TuJ1, אלא גם סמנים מאוחר כגון neun.
  2. שינוי חצי בינוני של הבחירה כל 4 ימים במהלך תהליך הבידול העצבי.
    הערה:     שינויים נרחבים או תכופים יותר בינוני לדלל גורמים הזנה חיוניים, ויכול להיות התבגרות טובה.
    1. עבור ה-iPSC-נגזר WT126 נוירונים, השתמש במדיה הבאה שלאחר בידול לפוסט: 5 מ"ל 100x N2, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF, 1 μg/mL, 200 μM חומצה אסקורבית, 1 μM diבוטירג-מחנה ו-10 מ"ל SM1 עבור 500 mL של הנשר המתוקן בינונית של שונה/ תערובת מזינים F-12 (Dמאמ/F12). בהדרגה, באמצעות שינויים בחצי מדיה, להחליף עם המדיום הבסיס העצבי (טבלת חומרים) ואת תוספי אותם.
    2. עבור הנוירונים הנגזרים iPSC הנגזר CVB, להשתמש הבאים לאחר בידול culturing בינוני: 500 mL בסיס עצבי בינונית (טבלת חומרים) ו 500 mL dmem דיום/F12 בינונית עם 2 Μg/mL למינציה, 10 מ ל גלוטמין תוסף (לוח חומרים), 0.75 mg/mL נתרן ביקרבונט, 5 מ"ל בינוני חיוני מינימלי (זיכרון) חומצות אמינו לא חיוניות, 0.2 חומצה אסקורבית מילימטר, 10 ng/mL BDNF, 20 מ"ל 50x B27, ו 10 מ"ל 100x N2 תוספת.

2. ציפויים בריבוי בארות

  1. יום לפני הציפוי החוזר, המעיל עם פולי אל אורלך (אש ף). התמוססות אש ף במים סטריליים כדי ליצור פתרון מניות (10 מ"ג/mL). אחסן את המניה הזאת ב-20 ° c. דלל את אש ף 1:100 במים כדי להניב ריכוז של 50 μg/mL כאשר זכוכית ציפוי 1:1000 יחס (10 μg/mL) כאשר ציפוי פלסטיק.
  2. החל את הציפוי ישירות על לוחיות היעד. השתמש בנפח הציפוי המתאים לגודל הלוחית (כלומר, לצלחת של 24 שעות להחיל את 500 μL של פתרון אש ף לכל טוב).
  3. אפשר לצלחות לשבת בחושך בלילה בטמפרטורת החדר.
  4. לאחזר צלחות מצופות ביום של ציפוי מחדש והעברה לארון ביולוגי סטרילי.
  5. . ולשטוף פעמיים במים סטריליים
  6. לדלל (1.15 mg/mL) בתמיסת מלח מאגור פוספט (PBS) ב 1:400 דילול.
    הערה: הפשרת הלמינציה ב-4 ° צ' ובמהירות להוסיף ל-PBS כדי למנוע צבירה של ציפוי למינציה ואחיד.
  7. מתיף מים סטריליים ולהחיל 500 μL של למינציה בציפוי לבארות מצופה בעבר עם אש ף.
  8. לוחות מניחים בחממה 37 ° c עבור מינימום של 4-6 h. השתמש incubations ארוך יותר, עד 16 h, עבור משטחי זכוכית. השתמש בזמני דגירה עקביים.

3. ציפוי מחדש של נוירונים

  1. לשטוף את הצלחת של נוירונים הבדיל עם PBS פעם בעדינות. פזר את הPBS בעדינות במורד הקיר של הצלחת, ולא ישירות על התאים, כדי להימנע מהפרעה להם.
  2. בעדינות לנגוע PBS, להיות זהיר כדי להימנע מלגעת בתאים ישירות אבל כדי לבשל מקצה המנה תוך המפנה אותו לעבר החוקר.
  3. החל מינימום 1 מ ל של האנזים פרוטחרדה (טבלת חומרים) לכל 10 ס מ לוחית ולהחזיר תאים לחממה. להוסיף כרכים קצת יותר גבוה אם החדר תרבות הרקמה מציג שיעור אידוי גבוה עקב לחות נמוכה.
  4. התאים דגירה עם אנזים פרוטנוגד חרדה עבור 40-45 דקות כדי לנתק אותם מן הצלחת ולנתק אותם מפני נוירונים אחרים בתוך הרשת העצבית.
    הערה: התזמון בשלב זה הוא קריטי. קוצ'ינג הפרוטאז מוקדם מדי יכול להוביל מוות תאים מוגבר לאחר ציפוי מחדש. יצרנית האנזים פרוטחרדה ממליצה כי הטמפרטורות נמוך הרבה יותר מ 37 ° c לשמש עם תקופות דגירה ארוכה יותר עבור מעבר קווי התאים (למשל, לילה ב 4 ° c). עם זאת, לטיפול בנוירונים ב 4 ° צ' יש להימנע, כפי שהם מראים לעתים קרובות הישרדות עניים לאחר חשיפה קרה. היצרן מצהיר גם כי הדגירה 60 דקות עם האנזים ב 37 ° c מוביל הפעלה אנזימטית שלה. עם זאת, בניסיון של מחברים, הדגירה של 40-45 דקות של תרבויות כפתונאליות הנגזרות ב-37 ° c מספיקה לניצול יעיל ולהישרדות עצבית מצויינת בעת ציפוי מחדש.
  5. בדוק נוירונים על מיקרוסקופ שלב-ניגודיות בזמן הדגירה ולאפשר טיפול פרוטאז להמשיך עד הרשת העצבית לחלוטין לנתק מן הצלחת ומתחיל להתפרק בסדינים קטנים בזמן לטלטל את הצלחת תחת מיקרוסקופ.
  6. כיבוי פעילות הפרוטאז באמצעות 5 מ ל של מדיה DMEM טרי עבור 1 מ ל של פרוטאז בצלחת 10 ס מ להפסיק את העיכול. בעדינות קצוצות תאים נגד צלחת 5-8 פעמים כדי לשבש את הרשת, באמצעות פיפטות סרולוגית. להיזהר לא להחיל יותר מדי לחץ כאשר triturating, כמו נוירונים הבדיל הם שבירים. אין להשתמש בטיפ P1000, מכיוון שהסוף הוא חד מדי וצר, ולכן ניתן לממש או לפגוע בנוירונים.
  7. החלת פתרון עם תאים באמצעות מסננת תא עם שינוי בקוטר 100 יקרומטר לתוך רענן 50 mL שפופרת חרוט על ידי ירידה.
  8. לשטוף מסננת עם תוספת של 5 מ ל של מדיה חדשה DMEM, לאחר תאים יש לסנן דרך.
  9. ספין תאים בצנטריפוגה שחקן העליון ב 1,000 x g עבור 5 דקות.
  10. החזר שפופרת חרוט אל הקבינט אבטחה טיחות ומייבשים את רוב המדיה, עוזב סביב 250 μl כדי להבטיח שתאים ישמרו על לחות.
  11. השהה תאים מחדש בעדינות ב-2 מ ל של מדיית DMEM טרייה. לא לנקז את הגלולה על הצד של הצינור. במקום זאת, בעדינות להפוך את חרוט 2-3 פעמים ולעבור תאים בסופו של 5 mL סרולוגית להיפטר מהם.
  12. החל 10 μL של נוירונים מחדש על הקצה של המוציטומטר.
  13. הוסף 8-10 μL של טרימין כחול ל-droplet של תאים כדי להעריך את הכדאיות בתאים במהלך שלב השעיה מחדש. החל 10 μL של תערובת זו ל-הומוציטוטומטר או למוני תאים אוטומטיים אחרים. להעריך כמו קיימא תאים אלה הם בהירים הפאזה ולא לכלול את הצבע הכחול טריפי.
  14. לקבוע כמות של תאים קיימא/mL, ולהכין לדלל את התוכן של צינור החרוט על פי צפיפות התא הרצוי.
  15. צלחת ~ 10,000 תאים לכל טוב עבור צלחת 384-באר; צלחת ~ 150000-200000 תאים לכל טוב עבור צלחת 24.
  16. הוסף DMEM טרי לצינור החרוט של תאים מושעה כדי להשיג דילול המתאים ולהוסיף תוספי מתאים נוספים כגון B27 ו/או BDNF, בהתאם לדרישות קו התא המסוים.
  17. הטיה בעדינות צינורית חרוט לערבב 2-3 פעמים.
  18. מלטף למינציה בציפוי מן הצלחת 24-באר, או מ 384-היטב צלחת multiwell יטב באמצעות 16-ערוץ pipet ולשטוף פעם אחת עם PBS.
  19. מP1000 את ה-PBS בעזרת הצלחת של 24 שעות ביממה, או את הפיפטה של 16 הערוצים ב384-לוחיות הרישוי.
  20. החלת פתרון התא על כל באר בתנועה בספרה שמונה כדי להימנע מהפייפת. אחידות הציפוי עשויה להיות ממוטבת גם באמצעות התקנים אוטומטיים לטיפול בנוזלים.
    הערה: תוספת של למינציה לתקשורת החל 2-4 ימים לאחר הציפוי גם עוזר לשמור על התפלגות הומוגנית של התאים.
  21. חזור על שלבים 3.19 ו-3.20 עבור כל באר.
  22. להחזיר את הצלחת לחממה להגדיר ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
  23. לאחר יומיים, להתחיל לשנות חצי בינוני כל 4 ימים באמצעות מדיה לאחר בידול culturing המתואר בסעיף 1.2. לאחר זמן ההבשלה הרצוי, לתקן תרבויות באמצעות 3.7% פורמלדהיד ב 37 ° צ' ותאי כתם לפי הדרישות הנסיוניות.

4. הכדאיות התאית לפוסט-ציפוי מחדש

  1. הוסף את כתב המוות המוקדם של התאים (VivaFix: 0.5 μL של הפתרון מלאי μL 50 לכל 500 μL מדיה התרבות בכל טוב) לאחר בקצרה וורטקספתרון המניה.
  2. התמונה החיים והתאים המתים מתורבתים על multiwells זכוכית, לאחר 20 דקות, ללא כל צעד כביסה, מאז זוהר לצבוע רק פעם אחת בתוך התאים, או לתקן ושיתוף כתם עם 4 ', 6-diamidino-2-פנילילינדול (dapi) ו/או נוגדנים אחרים לפני הדמיה במיקרוסקופ.

5. מכתים חיסוני

  1. תקן תרבויות עם 3.7% פורמלדהיד ב-PBS פלוס 120 ממ סוכות עבור 20 דקות ב 37 ° c.
  2. לשטוף ולחלחל עם 0.2% טריטון X-100 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לחסום עבור 30 דקות עם החלבון 2% סרום אלבומין (BSA).
  3. מתיף את BSA ללא שטיפה ומודרת עבור 1 h בטמפרטורת החדר עם הארנב anti-MAP2 נוגדן 1:1000, העכבר anti-β3 טובולין (TuJ1) נוגדן 1:2000, התרנגול נגד NeuN נוגדן (1:100) ונוגדן אנטי CTIP2 חולדה (1:500), או עם העכבר נגד PSD95 ( 1:200), ארנב נגד סינפסין 1 (1:200) והעוף אנטי MAP2 נוגדן עבור כתמים סינפטית.
  4. לשטוף עם PBS, ו דגירה עם אלקסה Fluor-מצועם נוגדנים משניים בתוספת DAPI עבור 45 דקות ב 37 ° c.
  5. לבסוף, לרחוץ פעמיים עם PBS לפני הדמיה.

6. הדמיה סידן

  1. להדביק תאים מתורבתים עם AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE (מכון Salk למחקרים ביולוגיים, GT3 Core מתקן) ב 10 ימים לאחר הציפוי ואת התמונה כדי להעריך את מעבר סידן ספונטנית ב 3-4 שבועות לאחר הציפוי.

7. רכישת תמונה וניתוח

הערה: לפרטים על מערכת הרכישה אנא פנה ל-קלבריזי et al.12.

  1. השתמש במודול דימות לקבלת תמונה ידנית או אוטומטית, ומודול תוכנה לניתוח תמונה, כגון CellProfiler13, עבור מדידות מורמטריות.
  2. חישוב אורך ממוצע של TuJ1 חיוביים neurites ו MAP2 הדנדריטים חיובי על ידי מדידת אורך כולל לכל שדה של השקפה מחולקת על ידי מספר הנוירונים (DAPI + MAP2 או תאים חיוביים TuJ1) בתוך אותו שדה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הציפוי החוזר של הנוירונים הנגזרים מhiPSCs שהיו מובחנים במשך שבועות מרובים מציע מספר יתרונות. עם זאת, ניתוק וציפוי מחדש של הנוירונים הבדיל, כי יש ארוך, דנדטים מחוברים הדדית ו אקסונים (איור 1א) יכול לגרום לחלקיק גבוה של נוירונים פגומים הפיך פגום.

כפי שמתואר בסעיף הפרוטוקול, השתמשנו דגירה עם אנזים פרוטנוגד חרדה כדי לנתק את הנוירונים מן המצע. בדרך כלל, בשל העבודה העבה שלהם של neurites (איור 1א), התאים נוט...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדגמנו הליך ישר קדימה עבור השעיה מחדש של התרבויות הנוירואליות האנושית הממוטב הכדאיות, בידול הצלחה, והדמיה subcellular באופן תואם פלטפורמות ההקרנה תוכן גבוה, ושאר הגורמים הרלוונטיים לגילוי הסמים. איור 6 ממחיש את זרימת העבודה הכוללת ודוגמאות ליישומים כאלה.

למרות שכאן אנו מתמקדים הנוירונים הנגזר הנגזרים כי הם מכוונים לעבר הגורל בקליפת העצב, אנו מצפים כי שיטה זו צריכה להיות ישימה באופן שווה לתאי גזע מעובריים האדם הנגזר, וכלה בתאי גזע הנגזרים מכוונים לכיוון אחר , פנוטי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו היא מרכיב של קבוצות המחקר הלאומי הקואופרטיב תא שיתופיות (NCRCRG) ללמוד מחלות נפש נתמך על ידי NIH מענק U19MH1 2015-0644. העבודה הראשונית נתמכת גם על ידי NIH מענק NS070297. אנו מודים לד"ר קרול בלטו ופרד Gage, מכון סאלק, שסיפק את שורת ה-WT 126 של תאי הקדמון העצביים, ואת ד"ר יוג'ין יו ו לורנס גולדשטיין, UC בסן דייגו על מתן קו CVB WT24 של תאים מחולל קדמון עצבי. אנו מודים לדבורה Pre במעבדה של ד ר אן באנג, המכון לגילוי רפואי של סנפורד ברנהם, לדיונים שימושיים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<חזק>לאחר ציפוי מחדש
L-חומצה אסקורביתSigmaA4403הוסף 1 מ"ל של מלאי 200 מ"מ ל-1 ליטר של מדיה N2B27
Dibutyryl-cAMPSigmaD0627הוסף 1 ומיקרו; M
Human BDNFPeprotech450-0210 ננוגרם/מ"ל ריכוז סופי
B27 (50x)Thermofisher Scientific17504044הוסף 20 מ"ל ל-1 ליטר N2B27 מדיה
DMEM/F12 עם GlutamaxThermofisher Scientific31331093הוסף N2 וחלק ב-50 מ"ל חרוטים; מכסי עטיפת פרפילם
Human GDNFPeprotech450-1010 ננוגרם/מ"ל ריכוז סופי
GlutamaxThermofisher Scientific35050038להוסיף 10 מ"ל ל-1 ליטר N2B27 מדיה; תוסף גלוטמין
למינין עכברסיגמאP3655-10 מ"גהוסף 100 ומיקרו; L עד 50 מ"ל N2B27
MEM חומצות אמינו לא חיוניותThermofisher Scientific11140035הוסף 5 מ"ל ל-1 ליטר N2B27 מדיה
N2 (100x) תוסףטכנולוגיות חיים17502048הוסף 5 מ"ל עד 500 מ"ל מדיה
Neurobasal A MediaThermofisher Scientific10888022שלב עם DMEM/F12 כדי ליצור מדיה N2B27 עבור תאי CVB wt; עצבי בסיסי A מדיה
מדיה נוירו-בזאליתThermofisher Scientific21103049לתאי WT126; מדיה בסיסית עצבית
SM1 תוסףStemCell Technologies5711הוסף 1:50 למדיה
נתרן ביקרבונטThermofisher Scientific25080-094הוסף 10 מ"ל ל -1 ליטר N2B27 מדיה
<חזק>הכנת צלחת
10 ס"מ כלי תרבית רקמותפישר סיינטיפיק08772-Eכלים מפלסטיק שטופלו TC
6 בארות כלי תרבית רקמותתומאס סיינטיפיק1194Y80צלחות NEST
עכבר LamininLife Technologies23017-015הוסף 1:400 על פלסטיק
Poly-OrnithineSigmaP3655-10mgהוסף 1:1,000 על פלסטיק
UltraPure Distilled WaterLife Technologies10977-015לדילול פולי-L-אורניתין
<ריאגנטים חזקים>ציפוי מחדש
100 מ"מ מסננת תאיםקורנינג431752צלחת סטרילית, עטופה בנפרד
עם 384 בארות, ציפוי6007550 פרקין אלמרעם PLO ו-Laminin
DPBSLife Technologies14190144תמיסת
מלח חוצצת פוספט של Dulbeccoפולי-D-ליזין-מצופה מראש צלחות 384 בארותPerkinElmer6057500יש לשטוף לפני הציפוי בלמינין
StemPro AccutaseLife TechnologiesA1110501למרוח צלחת של 1 מ"ל/10 ס"מ למשך 30-45 דקות; אנזים פרוטאוליטי
<חזק>חומרי קיבוע
37% פורמלדהידפישר סיינטיפיקF79-1מומס ב-PBS
סוכרוזפישר סיינטיפיקS5-120.8 גרם ל-10 מ"ל של חומרים מקבעים
<חזקים>צביעה חיסונית
Alexa Fluor 488 עיזים נגד עכברInvitrogenA-11001נוגדן משני
Alexa Fluor 568 עיזים נגד עוףInvitrogenA-11041נוגדן משני
Alexa Fluor 647 עיזים נגד עוףInvitrogenA-21449נוגדן משני
Alexa Fluor 561 נוגדן עז נגד חולדותInvitrogenA-11077נוגדן משני
DAPIBiotium40043מדמיין נוגדן DNA
עכבר כנגד b3-tubulin (TuJ-1)NeuromicsMO15013סמן עצבי בשלב מוקדם
נוגדן חולדה נגד CTIP2Abcamab18465שכבה 5/6 קליפת המוח נוירונים
נוגדן עוף נגד MAP2LifeSpan BiosciencesLS-B290סמן עצבי בשלב מוקדם
נוגדן עוף נגד NeuNMilliporeABN91סמן עצבי בשלב מאוחר
נוגדן ארנב נגד MAP2שלי הלפיןN/Aסמן עצבי בשלב מוקדם
נוגדן עכבר נגד PSD-95SigmaP-246סמן פוסט-סינפטי
נוגדן ארנב נגד סינפסין 1MilliporeAB1543סמן קדם סינפטי
אלבומין בסרום בקר (BSA)GE Healthcare Life SciencesSH30574.0210% ב-PBS לחסימת
Titon X-100Sigma9002931מדולל ל-0.2% ב-PBS עבור סמני חדירות
Viability Markers
Vivafix 649/660Biorad135-1118סמן מוות תאי
<חזק>הדמיית סידן
שם המגיב / ציודמספר קטלוגישל החברההערות/תיאור
AAV8-syn-jGCAMP7f-WPREמכון סאלק, GT3 מתקן ליבהמדווח סידן במערכת אספקה ויראלית
<חזק>hiPSC NPCs שמקורם ב-hiPSC
WT 126 (Y2610)מעבדת GageN/AMarchetto et al., 2010
CVB WT24מעבדות יאו וגולדשטייןלאפורסם
לא מצופה

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Engel, M., Do-Ha, D., Munoz, S. S., Ooi, L. Common pitfalls of stem cell differentiation: a guide to improving protocols for neurodegenerative disease models and research. Cell and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3693-3709 (2016).
  2. Kim, D. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 109(2014).
  3. Amin, N. D., Paşca, S. P. Building Models of Brain Disorders with Three-Dimensional Organoids. Neuron. 100 (2), 389-405 (2018).
  4. Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Passaging Cells. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2019).
  5. Langdon, S. P. Cancer Cell Culture. , Humana Press. New York, NY. (2010).
  6. Picot, J. Human Cell Culture Protocols. 107, Springer Science & Business Media. Berlin, Germany. (2005).
  7. Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
  8. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
  9. Banker, G., Goslin, K. Developments in neuronal cell culture. Nature. 336 (6195), 185-186 (1988).
  10. Calabrese, B., Halpain, S. Essential role for the PKC target MARCKS in maintaining dendritic spine morphology. Neuron. 48 (1), 77-90 (2005).
  11. Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116 (1), 201-211 (1992).
  12. Calabrese, B., Saffin, J. M., Halpain, S. Activity-dependent dendritic spine shrinkage and growth involve downregulation of cofilin via distinct mechanisms. PLOS One. 9 (4), 94787(2014).
  13. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), 100(2006).
  14. Gupta, S., et al. Deriving Dorsal Spinal Sensory Interneurons from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 390-405 (2018).
  15. Ogura, T., Sakaguchi, H., Miyamoto, S., Takahashi, J. Three-dimensional induction of dorsal, intermediate and ventral spinal cord tissues from human pluripotent stem cells. Development. 145, (2018).
  16. Playne, R., Jones, K., Connor, B. Generation of dopamine neuronal-like cells from induced neural precursors derived from adult human cells by non-viral expression of lineage factors. Journal of Stem Cells and Regenerative Medicine. 14 (1), 34-44 (2018).
  17. Rao, M. S., et al. Illustrating the potency of current Good Manufacturing Practice-compliant induced pluripotent stem cell lines as a source of multiple cell lineages using standardized protocols. Cytotherapy. 20 (6), 861-872 (2018).
  18. Suga, H. Differentiation of pluripotent stem cells into hypothalamic and pituitary cells. Neuroendocrinology. 101 (1), 18-24 (2015).
  19. Endaya, B., et al. Isolating dividing neural and brain tumour cells for gene expression profiling. Journal of Neuroscience Methods. 257, 121-133 (2016).
  20. Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population. Journal of Neuroscience Methods. 129 (1), 73-79 (2003).
  21. Frega, M., et al. Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays. Journal of Visualized Experiments. (119), e54900(2017).
  22. Grainger, A. I., et al. In vitro Models for Seizure-Liability Testing Using Induced Pluripotent Stem Cells. Frontiers in Neuroscience. 12, 590(2018).
  23. Daub, A., Sharma, P., Finkbeiner, S. High-content screening of primary neurons: ready for prime time. Current Opinion in Neurobiology. 19 (5), 537-543 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Pluripotent Stem Cell derived NeuronsNeurite RegenerationSynapse MaturationHigh content ScreeningProtease IncubationCell ReplatingViability AssessmentNeuronal DifferentiationCalcium ImagingMultielectrode Array

Related Articles