Method Article

עיבוד פרוטוקול עבור הניתוח של פעפוע וגודל האשכול של קולטני ממברנה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ תמונה

DOI:

10.3791/59314

⸱

April 9th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Macromolecular Structures, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 2Campus Urb. Montepríncipe s/n, Univ. San Pablo CEU, 3Department of Immunology and Oncology, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 4Department of Cell Signaling, Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CSIC), 5Meyer Cancer Center, 6Department of Anatomy and Cell Biology, McGill Univ.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים עבור חלקיק יחיד מעקב וניתוח תמונות המאפשר הערכה כמותית של דיפוזיה מקדמים, סוגי תנועה וגדלי אשכול של חלקיקים אחד שזוהה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ פרוטוקול.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חלקיק מעקב על רצף וידאו וניתוח האחורי של מסלולים שלהם היא כיום פעולה נפוצה במחקרים ביולוגיים רבים. באמצעות הניתוח של קרום התא קולטן אשכולות כמודל, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור משימה זו ניתוח התמונה באמצעות פיג'י (ImageJ) ו- Matlab שגרות: 1) מגדירים אזורים מעניינים ומעצבים את מסכות המותאמים לאזורים אלה; 2) לאתר את חלקיקי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ וידאו; 3) לנתח את מאפייני דיפוזיה והעוצמה של הרצועות. ניתוח כמותי של מקדמי דיפוזיה, סוגי תנועה וגודל האשכול מתקבל על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, עיבוד תמונה מספק כלי חשוב כדי לקבוע באופן אובייקטיבי dynamics החלקיקים ואת ההשלכות של שינוי תנאים סביבתיים. במאמר זה אנו מציגים פרוטוקולים מפורט לניתוח של תכונות אלה. השיטה המתוארת כאן לא רק מאפשר זיהוי מעקב מולקולה בודדת, אבל גם ממכן הערכת פרמטרים דיפוזיה לרוחב-קרום התא, מסווג את סוג המסלול, מאפשר ניתוח מלא ובכך להתגבר קשיים לכימות בגודל נקודה לאורך המסלול כולו שלו-קרום התא.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חלבוני ממברנה שמוטבע על שכבה ליפידית הן בתנועה מתמדת עקב פיזור תרמי. הדינמיקה שלהם חיוניים כדי לווסת את התגובות התא, כפי האינטראקציות הבין-מולקולרי לאפשר היווצרות מתחמים להשתנות בגודלו מונומרים כדי oligomers ולהשפיע על יציבותו של איתות תסביכים. שחקרתי את מנגנוני שליטה חלבון דינמיקה היא לפיכך אתגר חדש ב ביולוגיה של התא, הדרושים כדי להבין את האות התמרה חושית מסלולים וכדי לזהות פונקציות תא בלתי צפויות.

פותחו מספר שיטות אופטי ללמוד אינטראקציות אלה החיים תאים1. בין אלה, מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (TIRF) גמורה, שפותחה בשנות ה-80 המוקדמות, מאפשר חקר אינטראקציות מולקולרית ליד או מאוד את קרום התא2. ל....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת דגימות ביולוגיות

  1. לגדל תאים Jurkat בינוני RPMI 1640 בתוספת 10% FCS, NaPyr וגלוטמין (RPMI מלאה). Electroporate Jurkat תאים (20 x 106 תאים/400 µL של RPMI 1640 עם 10% FCS) עם וקטור קולטן כימוקין מתויג-GFP monomeric (CXCR4-AcGFP, 20 μg) כדי לאפשר זיהוי שלו באמצעות מיקרוסקופ זריחה.
    הערה: זה אפשרי להשתמש בחלבונים פלורסנט monomeric אחרים כגון mCherry, mScarlet, וכו '.
  2. 24 שעות לאחר תרביות תאים לנתח בתאים cytometer זרימה כדי לקבוע תא הכדאיות וביטוי CXCR4-AcGFP.
  3. בחר את התאים לבטא רמות נמוכות CXCR4-AcGFP על-ידי התא מיון של GFP תאים חיובינמוך (איור 1), כפי נמוך לביטוי קולט....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השימוש של פרוטוקול זה מאפשר את מעקב אוטומטי של חלקיקים זוהה סרטים מיקרוסקופ פלורסצנטיות, הניתוח של המאפיינים דינמי שלהם. בתחילה, התאים הם transfected עם החלבון מצמידים fluorescently לבצע אחריהם מעקב. הרמה המתאימה של קולטנים מציג על פני התא, המאפשר ש-SPT מתקבל על ידי התא מיון (איור 1). התאים שנבחרו הם נותחו על ידי מיקרוסקופ TIRF שיוצר סרטי וידאו בתבנית שניתן ללמוד את הכלים המתוארים פרוטוקול זה (משלימה Video 1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה המתוארת קל לבצע אפילו מבלי ניסיון עבודה עם Matlab. עם זאת, Matlab רוטינות לדרוש מאוד דיוק עם המינוח של פקודות שונות, הלוקליזציה של התיקיות שונות המועסקים על-ידי התוכנית. ב המעקב אחר ניתוח שגרתי (שלב 3), ניתן לשנות פרמטרים מרובים. חלון "הגדרה Gaussian-תערובת דגם נאוה" (שלב 3.8) קובעת איך U-track יזהה חלקיקים בודדים על הוידאו. פעולה זו מתבצעת על-ידי התאמת מודל תערובת גאוסיאנית כמתואר ב-3. אחד הפרמטרים מפתח למדידות הזה מגדיר מסנן כדי לסייע בזיהוי maxima מקומיים. ההצלחה של פעולה זו תלוי הניגוד ת.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנחנו מודים ועד מאנזו קרלו מריה גארסיה Parajo שלהם עזרה וקוד המקור של ניתוח מקדם דיפוזיה. עבודה זו נתמך בחלקה על ידי מענקים מן הספרדית משרד המדע, חדשנות אוניברסיטאות (SAF 2017-82940-R), את תוכנית RETICS של אינסטיטוטו דה סאלוד Carlos III (RD12/0009/009, RD16/0012/0006; RIER). LMM JV נתמכים על-ידי התוכנית COMFUTURO של CSIC Fundación הכללי.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
תאי ג'ורקט אנושייםATCCCRL-10915קו תאי T אנושיים. ניתן לנתח כל סוג תא אחר באמצעות תוכנה זו
pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFPClontech632469ניתן לעקוב אחר חלבונים פלואורסצנטיים שונים ולנתח אותם באמצעות
אלקטרופורטור שגרתי זה של Gene Pulse X Cell ביו-רד אנו משתמשים ב -280 וולט, 975 mF, עבור תאי ג'ורקט.  השתמש בשיטת הטרנספקציה העובדת בצורה הטובה ביותר בידיים שלך. 
ציטומטר זרימה FC 500 ציטומטר זרימה בקמן קולטר
MoFlo אסטריוס ממיין תאים בקמן קולטרבהתאם לרמת הטרנספקציה, ייתכן שלא יהיה צורך במיון תאים. אתה יכול גם להשתמש בתאים עם ביטוי יציב של רמות נאותות של הקולטן המעניין.
Dako QifikitDakoCytomationK0078משמש לכימות מספר הקולטנים על פני התא.
כלי מיקרובאר תחתונים מזכוכיתתאגיד MatTekP35G-1.5-10-C
פיברונקטין אנושי מפלזמהSigma-AldrichF0895
רקומביננטי אנושי CXCL12PeproTech300928A
הפוך Leica AM TIRFLeica
EM-CCD מצלמהאנדור DU 885-CSO-#10-VP
MATLABתוכנת MathWorks, Natick, MA
U-Track2 תוכנתDanuser Laboratory
ImageJNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/
FiJiFiJIhttps://imagej.net/Fiji)
u-Track2 softwareכלי Matlab.  להתקנה, הורד .zip file מ- web דף (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) ובטל את דחיסת הקובץ בספרייה לבחירתך
GraphPadPrism GraphPad
תוכנת

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yu, J. Single-molecule studies in live cells. Annual Review of Pysical Chemistry. 67 (565-585), (2016).
  2. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Ce....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Image ProcessingFluorescence MicroscopySingle Molecule TrackingParticle TrackingDiffusion AnalysisCluster Size AnalysisRegion Of InterestMask DesignFiji ImageJMATLAB Routines

Related Articles