מאמר שיטה

טיהור והשתלות של תאים ובתאים Myogenic נגזר Exosomes כדי לשפר את תפקוד הלב בעכברים Dystrophic שרירים דושן

5.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59320

⸱

10 באפריל 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Vascular Biology Center, Medical College of Georgia, Augusta University, 2Renji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשיפור תפקוד הלב בעכברים ניוון שרירים דושן transiently על ידי משתילים exosomes נגזר נורמליים ובתאים myogenic.

תקציר

אצ'יל דושה ניוון שרירים (DMD) היא X-linked רצסיבי גנטי מחלה נגרמת על ידי חוסר חלבון הדיסטרופין פונקציונלי. לא ניתן לרפא את המחלה, כאשר המחלה מתקדמת, החולה מפתחת תסמינים של קרדיומיופתיה מורחבת, הפרעה בקצב הלב, אי ספיקת לב מוגדש. עכברים מוטנטים DMDMDX שאינם מבטאים הדיסטרופין, משמשות כמודל העכבר של DMD. במחקר האחרון שלנו, הבחנו כי הזרקת intramyocardial מסוג רחב (WT)-קדמון myogenic נגזר תאים exosomes (MPC-Exo) transiently לשחזר את הביטוי של הדיסטרופין בשריר של עכברים מוטנטים DMDMDX , אשר היה קשור עם שיפור ארעי בתפקוד הלב רומז WT-MPC-Exo עשוי לספק אפשרות להקל על התופעות לב DMD. מאמר זה מתאר את הטכניקה של MPC-Exo טיהור והשתלות לתוך הלב של עכברים מוטנטים DMDMDX .

מבוא

ניוון שרירים דושן (DMD) היא X-linked רצסיבי, מתקדמת neuromuscular מחלה הנגרמת על ידי מוטציה בגן DMD ג'ין ואובדן של הדיסטרופין פונקציונלי1. הדיסטרופין מתבטא בעיקר ביכולת שרירי השלד שריר הלב, מתבטאת פחות2,של השריר החלק, בלוטות אנדוקריניות, נוירונים-3. DMD הוא הסוג הנפוץ ביותר של ניוון עם שכיחות של אחד לכל 3,500 ל 5,000 בחורים היילוד ברחבי העולם4,5. אנשים בדרך כלל לפתח שרירים מתקדמת נמק, אובדן של הליכה עצמאית על ידי בגיל ההתבגרות המוקדם, ומוות בעשורים השני כדי השלישי של חייהם עקב אי ספיקת לב, כשל נשימתי6.

קרדיומיופתיה מורחבת, הפרעות קצב, אי ספיקת לב מוגדש הם נפוצים גילויי DMD7,8לב וכלי דם. לא ניתן לרפא את המחלה, טיפול תומך עשוי לשפר את הסימפטומים או לעכב את ההתקדמות של אי ספיקת לב, אבל זה מאוד קשה לשפר את הלב תפקוד9,10.

דומה לחולים DMD, X-linked ניוון שרירים (MDX) עכברים בחוסר חלבון הדיסטרופין ותסמינים הנוכחי של קרדיומיופתיה11, ולכן נמצאים בשימוש נרחב במחקר קרדיומיופתיה DMD הקשורים. כדי לשחזר הדיסטרופין השרירים מושפע, טיפול בתאי גזע allogeneic הוכיחה להיות טיפול יעיל עבור DMD12,13,14. Exosomes, 30-150 nm קרום שלפוחית מופרש על ידי סוגי תאים שונים, לשחק תפקיד מפתח בתקשורת לתא דרך התחבורה גשמי גנטי, כגון RNA שליח (mRNA) ללא קידוד RNAs15,16,17 ,18,19,20,21.

שלנו מחקרים קודמים הראו כי exosomes נגזר ובתאים myogenic (MPC), כגון C2C12 תא קו, באפשרותך להעביר הדיסטרופין mRNA כדי cardiomyocytes המארח לאחר הזרקה ישירה לב22, המציין כי מסירת allogeneic MPC, נגזר exosomes (MPC-Exo) transiently לשחזר DMD ביטוי גנים בעכברים MDX. מאמר זה מתמקד MPC-Exo טכניקות טיהור והשתלות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

בעלי חיים אלה מטופלות הפרוטוקולים המאושרים ותקנות רווחת בעלי חיים ראש הוועדה אכפת לי חיה מוסדיים שימוש של המכללה הרפואית של גאורגיה באוניברסיטת אוגוסטה.

1. בידוד ולטיהור MPC, נגזר Exosomes

  1. זרע 5 x 10 תאים6 C2C12 בצלחת התרבות התא 15 ס מ עם Dulbecco מלאה של 20 מ"ל ששינה בינוני הנשר (DMEM) המכיל 10% סרום שור עוברית (FBS), U/mL 100 פניצילין G ו- 100 סטרפטומיצין μg/mL. דגירה-CO 37 ° C ו-5%2.
  2. להכין בינוני מדולדל exosome על ידי ultracentrifugation של FBS ב 100,000 x g 18 h ב 4 ° C באמצעות רוטור דלי מתנדנדים. להתעלם בגדר.
  3. להחליף את DMEM השלם בינוני exosome מדולדל כאשר תאים חד שכבתי להגיע למפגש 80% בצלחת תרבות.
  4. להשתמש על פיפטה העברה כדי לאסוף את תגובת שיקוע מתוך קערה תרבות תא כל 48 שעות עבור סכום כולל של שלוש פעמים. לאסוף את תגובת שיקוע צינורות צנטריפוגה 50 מ ב, צנטריפוגה ב x 150 גר' 10 דקות להסיר את התאים הנותרים.
  5. לסנן את תגובת שיקוע דרך מסנן 0.22 μm כדי לסלק שאריות תאים. Ultracentrifuge המדיום מסוננים צינורות אולטרה ברור באמצעות הרוטור דלי מתנדנדים ב 100,000 x g עבור 120 דקות ב 4 ° C, כדי לזרז את exosomes.
  6. Resuspend בגדר המכילות exosome בתוך תמיסת מלח פוספט buffered (PBS) ולמלא כל צינור סופר ברורים עם PBS. לבצע ultracentrifugation של ההשעייה ב 100,000 x g עבור 120 דקות ב 4 ° C כדי לסלק מזהמים חלבונים.
  7. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר exosome ב 100 µL PBS. לאחסן ב- 80 ° C לשימוש עתידי.
  8. לניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים, במקום µL 3 exosomal השעיה על רשת מצופה formvar מיקרוסקופ אלקטרונים נחושת רשת 200 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. המשך אצטט uranyl רגיל מכתים23. לבחון את הרשת חצי יבש על ידי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.

2. Intramyocardial Exosome משלוח

הערה: השתמשנו עכברים שש בכל קבוצה.

  1. עזים ומתנגד DBA/2J-DMDMDX עכברים (זכר; גיל > 10 חודשים משקל הגוף (BW) > 18 גרם) עם הזרקה בקרום הבטן (i.p.) של 100 mg/kg BW של קטמין בשילוב עם 10 mg/kg BW של חריגות השירותים הווטרינריים, לאשר את העומק של הרדמה על ידי צביטה הבוהן.
  2. לתקן כל העכבר במצב פרקדן על פלטפורמה כירורגי באמצעות הקלטת כדי לאבטח את האיבר בכל מקום suture 3-0 אופקית מתחת השיניים העליונות להחזיק את הלסת העליונה במקום.
  3. הקרם depilatory חלות על הצד השמאלי של החזה העכבר כדי להסיר את הפרווה מן העור.
  4. לבצע צנרור אנדוטרכאליות דרך חלל הפה באמצעות צנתר 24 G, לאוורר את העכבר עם חדר אוויר בקצב של 195 נשימות לדקה באמצעות מכונת הנשמה מכרסמים (ראה את הטבלה של חומרים).
  5. לחטא את העור עם 75% אלכוהול, 10% povidone יוד.
  6. עושים 10\u201215 מ"מ המלוכסן חתך בחזה ובצלעות מהקצה השמאלי לבית שחי שמאל, לחתוך את pectoralis הגדולות ואת pectoralis קטין על ידי מספריים ולאחר מכן לבצע ניקור השמאלי בחלל הבין-צלעי הרביעי. הכנס בעדינות את הלהקות המדחק להתפשט בחלל בית-החזה לרוחב של 10 מ מ. לטפל כדי למנוע נזק לריאה שמאלית.
  7. השתמש פינצטה ישר שני כדי להסיר את קרום הלב, ולהפריד בינהם ולמקם אותן מאחורי העצות המדחק לחשוף את הלב. להזריק MPC-Exo (50 μg ב- 30 µL PBS) או 30 intramyocardially PBS (כמו פקד) μL לתוך הקיר הקדמי של החדר השמאלי באמצעות מחט האינסולין 31 G באתר אחד.
  8. להשתמש התפרים ניילון 6-0 כדי לסגור את חלל בית החזה, pectoralis שרירי ועור ברצף.
  9. לשחזר עכברים. לאחר נשימה קצבית, ספונטני קיים, להסיר את העכברים מן הנשמה, והוא מוציא את הטובוס. לצפות ולהקליט את התנאי עכברים לאחר הניתוח.

3. אקוקרדיוגרפיה

הערה: משקיף אחד עיוור לקבוצות ניסיוני מבצעת אקוקרדיוגרפיה וניתוח נתונים.

  1. יומיים לאחר ההשתלה PBS/exosome, עזים ומתנגד העכברים עם 1\u20122% איזופלוריין.
  2. לתקן את העכבר במצב פרקדן באמצעות הקלטת ולהחיל את הג'ל אקוסטית preheated על אזור החזה השמאלי.
  3. להעריך תפקוד שמאל על ידי אקוקרדיוגרפיה כפי שתואר לעיל16,24.
    1. להשיג את תצוגת ציר זמן מתחת של החדר השמאלי (LV) בשני מימדים (מצב ב'), ולאחר מכן לסובב את החללית אולטרסאונד 90° כדי לקבל מבט קצר-ציר LV ברמת השריר papillary.
    2. הרשומה תמונות echocardiographic M-mode מידה שמאל חדרית דיאסטולי קוטר (LVEDD), נפח סוף סיסטולי חדרית השמאלי (LVESD), נפח סוף דיאסטולי חדרית השמאלי (LVEDV) ו השמאלי נפח סוף סיסטולי חדרית (LVESV).
      הערה: השבר לינוק (FS %) = [(LVEDD − LVESD) / LVEDD] x 100, שבר שמאלה הוצאה ventricular (LVEF %) = [(LVEDV − LVESV) / LVEDV] x 100.

4. אימונוהיסטוכימיה

  1. יומיים לאחר ההשתלה PBS/exosome, עזים ומתנגד עכברים (ראה שלב 2.1) וחותכים את עצם החזה פתוח כדי לחשוף את חלל בית החזה. לנתח הכלילי התחתון, perfuse את הלב דרך השיא החדר השמאלי עם 3 מ"ל PBS, ואחריו 3 מ"ל של 4% paraformaldehyde בטמפרטורת החדר, באמצעות צנתר פרפר עם מחט 25 גרם המצורפת מזרק 5 מ.
  2. להטביע לבבות קבוע לתוך פרפין, חותכים למקטעים עבה μm 5.
  3. Deparaffinize השקופיות קסילן, נתרענן בפתרונות אתנול בסדר הבא: 100% קסילן (3 דקות), 100% קסילן (3 דקות), 100% אתנול (1דקות.), 100% אתנול (1דקות.), 95% אתנול (1דקות.), 80% אתנול (1דקות.), H2O (1דקות.).
  4. לתקן סעיפים רקמות עם 4% paraformaldehyde במשך 8 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. לטבול את השקופיות סודיום ציטרט (0.01 M, pH 6.0) ולבצע אנטיגן לאחזור באמצעות רטריבר של אנטיגן.
  6. Permeabilize מקטעים עבור h 1 בטמפרטורת החדר עם 1% פוליאתילן טרט-octylphenyl גליקול ב- PBS.
  7. לחסום מקטעים עם סרום עיזים 5% ב- PBS לשעה בטמפרטורת החדר.
  8. דגירה מקטעים עם מדולל העיקרי נוגדנים (נוגדן anti-הדיסטרופין) ב- PBS (1: 100) בן לילה ב 4 ° C, ולאחר מכן לשטוף שלוש פעמים עם PBS במשך 5 דקות.
  9. דגירה מקטעים עם מדולל משני נוגדנים (488 עבור חיל הים אלקסה מצומדת עז ארנב אנטי איג) ב- PBS (1:400) למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.
  10. שליטה autofluorescence באמצעות autofluorescence שכבתה קיט (ראה את הטבלה של חומרים).
  11. שימוש גובר בינוני המכיל דאפי (ראה הטבלה של חומרים) כדי לטעון את השקופיות.
  12. להתבונן שקופיות תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תרשים זרימה בידוד ולטיהור exosomes מתאי C2C12 מוצג איור 1א'. כדי לאשר את הנוכחות של exosomes, ביצענו ניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים. תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (איור 1B) מציג את המורפולוגיה של השלפוחיות המוגלתיות צורה עגולה, בהיר של C2C12 נגזר exosomes. ניתוח תספיג אישרו הנוכחות של סמנים exosome, כולל CD63 ו- TSG101 (איור 1C).

הבחנו אזור שקוף בצ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השיטה של בידוד exosomes טהור חיוני ללמוד את הפונקציה של exosomes. אחת הטכניקות הנפוצות לבידוד exosome היא glycols פוליאתילן (יתדות) מתווכת משקעים17,18,25. Exosomes יכול להיות זירז, יתדות, מגורען על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה. טיהור בתיווך פג הוא נוח מאוד, בעלות נמוכה, זה לא צריך שום ציוד מתקדם, אבל קיים חשש לגבי ניקיון exosomes מאז lipoproteins אחרים עשויים להיות זירז יחד, קשים להסרה. אולטראפילטרציה היא שיטה שגרתית להפרדה exoso...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

כל המחברים מצהיר שיש להם שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

טאנג נתמכו באופן חלקי על ידי איגוד הלב האמריקני: GRNT31430008, NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.22 μ m פילטרפישרברנד09-720-004
15 ס"מ צלחת תרבית תאיםתרמו פישר סיינטיפיק157150
24 גרם קטטרTERUMOSR-OX2419CA
31 גרם מחט אינסוליןBD328291
4% פרפורמלדהיד AffymetrixAAJ19943K2
50 מ"ל צינורות צנטריפוגהתרמו פישר סיינטיפיק339652
6-0 תפרPro Advantage מאת NDCP420697
Alexa Fluor 488 עז אנטי ארנב IgGThermo Fisher ScientificA-11008
תמיסת אנטי-מיקוטיקהקורנינג 30-004-CI
נוגדן נגד דיסטרופיןAbcamab15277
אנטיגן רטריבר Aptum BiologicsR2100-USמרווה
אוטופלואורסצנטית לשחזור אנטיגן מעבדות וקטורSP-8400
C2C12 קו תאיםATCCCRL-1772
צנטריפוגהUnicoC8606
Change-A-Tip צריבה בטמפרטורה גבוההBovie Medical Corporation HIT
מיקרוסקופיה קונפוקליתZeiss Zeissקונפוקליים
מעבדת ג'קסון013141
DMEMקורנינג 10-013-CM
סרום בקר עוברי (FBS)קורנינג 35-011-CV
סרום עיזים MP Biomedicals, LLC191356
IsofluranePatterson Veterinary07-893-1389
קטמיןהנרי שיין056344
מדיום הרכבה עם DAPI Vector LaboratoriesH-1500
סט מפסק עכבריםקנט סיינטיפיקSURGI-5001
פוליאתילן גליקול טרט-אוקטילפניל אתרפישר סיינטיפיקBP151-100
מאוורר מכרסמיםמכשיר הרווארד55-7066
SW-28 רוטור Tiבקמן342207
פלטפורמת ההדמיה Vevo 2100מערכת אולטרסאונד FUJIFILM VisualSonicsVevo 2100 
אולטרה-צנטריפוגהבקמן365672
צינורות אולטרה-שקופיםבקמן344058
קסילזין (XylaMed)Bimeda-MTC Animal Health Inc.1XYL003 8XYL006
ערכת 780 עכברי DBA/2J-mdx זקופים

מקורות

  1. Yiu, E. M., Kornberg, A. J. Duchenne muscular dystrophy. Journal of Paediatrics and Child Health. 51 (8), 759-764 (2015).
  2. Nudel, U., et al. Duchenne muscular dystrophy gene product is not identical in muscle and brain. Nature. 337 (6202), 76-78 (1989).
  3. Rae, M. G., O'Malley, D. Cognitive dysfunction in Duchenne muscular dystrophy: a possible role for neuromodulatory immune molecules. Journal of Neurophysiology. 116 (3), 1304-1315 (2016).
  4. Mah, J. K., et al. A systematic review and meta-analysis on the epidemiology of Duchenne and Becker muscular dystrophy. Neuromuscular Disorders. 24 (6), 482-491 (2014).
  5. D'Amario, D., et al. A current approach to heart failure in Duchenne muscular dystrophy. Heart. 103 (22), 1770-1779 (2017).
  6. Koeks, Z., et al. Clinical Outcomes in Duchenne Muscular Dystrophy: A Study of 5345 Patients from the TREAT-NMD DMD Global Database. Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (4), 293-306 (2017).
  7. Kamdar, F., Garry, D. J. Dystrophin-Deficient Cardiomyopathy. Journal of the American College of Cardiology. 67 (21), 2533-2546 (2016).
  8. Wang, Z., et al. Regenerative Therapy for Cardiomyopathies. Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2018).
  9. Fayssoil, A., Nardi, O., Orlikowski, D., Annane, D. Cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy: pathogenesis and therapeutics. Heart Failure Reviews. 15 (1), 103-107 (2010).
  10. Hagan, M., Ashraf, M., Kim, I. M., Weintraub, N. L., Tang, Y. Effective regeneration of dystrophic muscle using autologous iPSC-derived progenitors with CRISPR-Cas9 mediated precise correction. Medical Hypotheses. 110, 97-100 (2018).
  11. Quinlan, J. G., et al. Evolution of the mdx mouse cardiomyopathy: physiological and morphological findings. Neuromuscular Disorders. 14 (8-9), 491-496 (2004).
  12. Siemionow, M., et al. Creation of Dystrophin Expressing Chimeric Cells of Myoblast Origin as a Novel Stem Cell Based Therapy for Duchenne Muscular Dystrophy. Stem Cell Reviews and Reports. 14 (2), 189-199 (2018).
  13. Sienkiewicz, D., Kulak, W., Okurowska-Zawada, B., Paszko-Patej, G., Kawnik, K. Duchenne muscular dystrophy: current cell therapies. Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 8 (4), 166-177 (2015).
  14. Zhang, Y., et al. Long-term engraftment of myogenic progenitors from adipose-derived stem cells and muscle regeneration in dystrophic mice. Human Molecular Genetics. 24 (21), 6029-6040 (2015).
  15. Ju, C., et al. Transplantation of Cardiac Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes for Angiogenesis. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 429-437 (2018).
  16. Ju, C., et al. Transplantation of Cardiac Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Promotes Repair in Ischemic Myocardium. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 420-428 (2018).
  17. Ruan, X. F., et al. Suxiao Jiuxin pill promotes exosome secretion from mouse cardiac mesenchymal stem cells in vitro. Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 569-578 (2018).
  18. Ruan, X. F., et al. Exosomes from Suxiao Jiuxin pill-treated cardiac mesenchymal stem cells decrease H3K27 demethylase UTX expression in mouse cardiomyocytes in vitro. Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 579-586 (2018).
  19. Chen, Y., Tang, Y., Fan, G. C., Duan, D. D. Extracellular vesicles as novel biomarkers and pharmaceutic targets of diseases. Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 499-500 (2018).
  20. Chen, Y., Tang, Y., Long, W., Zhang, C. Stem Cell-Released Microvesicles and Exosomes as Novel Biomarkers and Treatments of Diseases. Stem Cells International. 2016, 2417268(2016).
  21. Murphy, C., et al. Emerging role of extracellular vesicles in musculoskeletal diseases. Molecular Aspects of Medicine. 60, 123-128 (2018).
  22. Su, X., et al. Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2018).
  23. Hu, G., et al. Exosome-mediated shuttling of microRNA-29 regulates HIV Tat and morphine-mediated neuronal dysfunction. Cell Death & Disease. 3, 381(2012).
  24. Bayoumi, A. S., et al. A carvedilol-responsive microRNA, miR-125b-5p protects the heart from acute myocardial infarction by repressing pro-apoptotic bak1 and klf13 in cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 114, 72-82 (2018).
  25. Wang, Y., et al. Exosomes/microvesicles from induced pluripotent stem cells deliver cardioprotective miRNAs and prevent cardiomyocyte apoptosis in the ischemic myocardium. International Journal of Cardiology. 192, 61-69 (2015).
  26. Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), 1657-1661 (2007).
  27. Oksvold, M. P., Neurauter, A., Pedersen, K. W. Magnetic bead-based isolation of exosomes. Methods in Molecular Biology. 1218, 465-481 (2015).
  28. Pedersen, K. W., Kierulf, B., Neurauter, A. Specific and Generic Isolation of Extracellular Vesicles with Magnetic Beads. Methods in Molecular Biology. 1660, 65-87 (2017).
  29. Teng, X., et al. Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Improve the Microenvironment of Infarcted Myocardium Contributing to Angiogenesis and Anti-Inflammation. Cellular Physiology and Biochemistry. 37 (6), 2415-2424 (2015).
  30. Aminzadeh, M. A., et al. Exosome-Mediated Benefits of Cell Therapy in Mouse and Human Models of Duchenne Muscular Dystrophy. Stem Cell Reports. 10 (3), 942-955 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Western Blot

מאמרים קשורים