מאמר שיטה

טיהור והשתלות של תאים ובתאים Myogenic נגזר Exosomes כדי לשפר את תפקוד הלב בעכברים Dystrophic שרירים דושן

5.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59320

⸱

10 באפריל 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Vascular Biology Center, Medical College of Georgia, Augusta University, 2Renji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשיפור תפקוד הלב בעכברים ניוון שרירים דושן transiently על ידי משתילים exosomes נגזר נורמליים ובתאים myogenic.

תקציר

אצ'יל דושה ניוון שרירים (DMD) היא X-linked רצסיבי גנטי מחלה נגרמת על ידי חוסר חלבון הדיסטרופין פונקציונלי. לא ניתן לרפא את המחלה, כאשר המחלה מתקדמת, החולה מפתחת תסמינים של קרדיומיופתיה מורחבת, הפרעה בקצב הלב, אי ספיקת לב מוגדש. עכברים מוטנטים DMDMDX שאינם מבטאים הדיסטרופין, משמשות כמודל העכבר של DMD. במחקר האחרון שלנו, הבחנו כי הזרקת intramyocardial מסוג רחב (WT)-קדמון myogenic נגזר תאים exosomes (MPC-Exo) transiently לשחזר את הביטוי של הדיסטרופין בשריר של עכברים מוטנטים DMDMDX , אשר היה קשור עם שיפור ארעי בתפקוד הלב רומז WT-MPC-Exo עשוי לספק אפשרות להקל על התופעות לב DMD. מאמר זה מתאר את הטכניקה של MPC-Exo טיהור והשתלות לתוך הלב של עכברים מוטנטים DMDMDX .

מבוא

ניוון שרירים דושן (DMD) היא X-linked רצסיבי, מתקדמת neuromuscular מחלה הנגרמת על ידי מוטציה בגן DMD ג'ין ואובדן של הדיסטרופין פונקציונלי1. הדיסטרופין מתבטא בעיקר ביכולת שרירי השלד שריר הלב, מתבטאת פחות2,של השריר החלק, בלוטות אנדוקריניות, נוירונים-3. DMD הוא הסוג הנפוץ ביותר של ניוון עם שכיחות של אחד לכל 3,500 ל 5,000 בחורים היילוד ברחבי העולם4,5. אנשים בדרך כלל לפתח שרירים מתקדמת נמק, אובדן של הליכה עצמאית על ידי בגיל ההתבגרות המוקדם, ומוות בעשורים השני כדי השלישי של חייהם עקב אי ספיקת לב, כשל נשימתי6.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

בעלי חיים אלה מטופלות הפרוטוקולים המאושרים ותקנות רווחת בעלי חיים ראש הוועדה אכפת לי חיה מוסדיים שימוש של המכללה הרפואית של גאורגיה באוניברסיטת אוגוסטה.

1. בידוד ולטיהור MPC, נגזר Exosomes

  1. זרע 5 x 10 תאים6 C2C12 בצלחת התרבות התא 15 ס מ עם Dulbecco מלאה של 20 מ"ל ששינה בינוני הנשר (DMEM) המכיל 10% סרום שור עוברית (FBS), U/mL 100 פניצילין G ו- 100 סטרפטומיצין μg/mL. דגירה-CO 37 ° C ו-5%2.
  2. להכין בינוני מדולדל exosome על ידי ultracentrifugation של FBS ב 100,000 x g 18 h ב 4 ° C באמצעות רוטור דלי מתנדנדים. להתעלם בגדר.
  3. להחליף את DMEM השלם בינוני exosome מדולדל כאשר תאים חד שכבתי להגיע ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תרשים זרימה בידוד ולטיהור exosomes מתאי C2C12 מוצג איור 1א'. כדי לאשר את הנוכחות של exosomes, ביצענו ניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים. תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (איור 1B) מציג את המורפולוגיה של השלפוחיות המוגלתיות צורה עגולה, בהיר של C2C12 נגזר exosomes. ניתוח תספיג אישרו הנוכחות של סמנים exosome, כולל CD63 ו- TSG101 (איור 1C).

הבחנו אזור שקוף בצ.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השיטה של בידוד exosomes טהור חיוני ללמוד את הפונקציה של exosomes. אחת הטכניקות הנפוצות לבידוד exosome היא glycols פוליאתילן (יתדות) מתווכת משקעים17,18,25. Exosomes יכול להיות זירז, יתדות, מגורען על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה. טיהור בתיווך פג הוא נוח מאוד, בעלות נמוכה, זה לא צריך שום ציוד מתקדם, אבל קיים חשש לגבי ניקיון exosomes מאז lipoproteins אחרים עשויים להיות זירז יחד, קשים להסרה. אולטראפילטרציה היא שיטה שגרתית להפרדה exoso.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

כל המחברים מצהיר שיש להם שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

טאנג נתמכו באופן חלקי על ידי איגוד הלב האמריקני: GRNT31430008, NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.22 μ m פילטרפישרברנד09-720-004
15 ס"מ צלחת תרבית תאיםתרמו פישר סיינטיפיק157150
24 גרם קטטרTERUMOSR-OX2419CA
31 גרם מחט אינסוליןBD328291
4% פרפורמלדהיד AffymetrixAAJ19943K2
50 מ"ל צינורות צנטריפוגהתרמו פישר סיינטיפיק339652
6-0 תפרPro Advantage מאת NDCP420697
Alexa Fluor 488 עז אנטי ארנב IgGThermo Fisher ScientificA-11008
תמיסת אנטי-מיקוטיקהקורנינג 30-004-CI
נוגדן נגד דיסטרופיןAbcamab15277
אנטיגן רטריבר Aptum BiologicsR2100-USמרווה
אוטופלואורסצנטית לשחזור אנטיגן מעבדות וקטורSP-8400
C2C12 קו תאיםATCCCRL-1772
צנטריפוגהUnicoC8606
Change-A-Tip צריבה בטמפרטורה גבוההBovie Medical Corporation HIT
מיקרוסקופיה קונפוקליתZeiss Zeissקונפוקליים
מעבדת ג'קסון013141
DMEMקורנינג 10-013-CM
סרום בקר עוברי (FBS)קורנינג 35-011-CV
סרום עיזים MP Biomedicals, LLC191356
IsofluranePatterson Veterinary07-893-1389
קטמיןהנרי שיין056344
מדיום הרכבה עם DAPI Vector LaboratoriesH-1500
סט מפסק עכבריםקנט סיינטיפיקSURGI-5001
פוליאתילן גליקול טרט-אוקטילפניל אתרפישר סיינטיפיקBP151-100
מאוורר מכרסמיםמכשיר הרווארד55-7066
SW-28 רוטור Tiבקמן342207
פלטפורמת ההדמיה Vevo 2100מערכת אולטרסאונד FUJIFILM VisualSonicsVevo 2100 
אולטרה-צנטריפוגהבקמן365672
צינורות אולטרה-שקופיםבקמן344058
קסילזין (XylaMed)Bimeda-MTC Animal Health Inc.1XYL003 8XYL006
ערכת 780 עכברי DBA/2J-mdx זקופים

מקורות

  1. Yiu, E. M., Kornberg, A. J. Duchenne muscular dystrophy. Journal of Paediatrics and Child Health. 51 (8), 759-764 (2015).
  2. Nudel, U., et al. Duchenne muscular dystrophy gene product is not identical in muscle and brain. Nature. 337 (6202), 76-78 (1989).<....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Western Blot

מאמרים קשורים