מחקה משימת החלל למאדים באמצעות Hindlimb פריקה חלקית משקל הנושאת בחולדות

מטרות מחוץ לכדור הארץ, כולל הירח ועל מאדים, מייצג את עתידה של חקר החלל האנושי, אבל בשניהם יש כוח משיכה חלש יותר במידה ניכרת מאשר בארץ. בעוד ההשלכות של חוסר משקל על מערכת השלד והשרירים נחקרו בהרחבה האסטרונאוטים^1,2,3,4,5 , מכרסמים^{6, 7 , 8 , 9}, שהאחרון הודות hindlimb ומבוססת פריקה (HLU) מודל¹⁰, מעט מאוד ידוע על השפעת הכבידה חלקית. כוח-הכבידה מאדים ב-38% מקולות של כדור הארץ, הכוכב הזה הפך להיות המוקד של חקר לטווח ארוך¹¹; לפיכך, חשוב להבין את השינוי שרירים שעלולות להתרחש בתוך הגדרה זו. לשם כך, פיתחנו מערכת הנושאת (PWB) משקל חלקי חולדות¹², בהתבסס על העבודה הקודמת עכברים^6,13, אשר אומתה באמצעות תוצאות שרירים ועצמות. עם זאת, חקר מאדים להיות קדמו תקופה ממושכת של microgravity, אשר לא טופלה שלנו המודל שתואר לעיל¹². לכן, במחקר זה, אנו שינו את המודל שלנו לחקות טיול למאדים, המורכב השלב הראשון של hindlimb הכולל פריקה, ומיד אחריו בשלב השני של נשיאת משקל חלקית ל-40 אחוז הטעינה נורמלי.

שלא כמו רוב הדגמים HLU, בחרנו להשתמש רתמה האגן (מבוסס על המתואר על-ידי צ'אדורי et al.⁹) במקום השעיה זנב כדי לשפר את הנוחות של בעלי החיים, ולהיות מסוגל לנוע בצורה חלקה וללא מאמץ מ HLU כדי PWB ב עניין של דקות. בשילוב, השתמשנו הכלובים והתקנים ההשעיה כי בעבר פיתח ו תיאר בהרחבה¹². בנוסף לספק נתונים אמין/עקבי, אנחנו גם בעבר הוכיח כי הנקודה החזקה קבועה של מערכת המתלים במרכז של המוט לא מנעו את החיות של העברה, טיפוח, מאכילה או שתייה. במאמר זה נתאר איך לפרוק את הגפיים האחוריות החיה (גם לגמרי וגם חלקית), ודא שלהם רמות כוח המשיכה מושגת, גם איך להעריך באופן פונקציונלי התיקונים שרירים הנוצרת באמצעות ידית כוח, רטוב מסת שריר. מודל זה יהיה מאוד שימושי עבור חוקרים המבקשים לחקור את ההשלכות של הכבידה חלקית (מלאכותי או extra-terrestrial) על מערכת השלד והשרירים שכבר נפגעה, ובכך לאפשר להם לחקור איך אורגניזמים להסתגל חלקי שטוען, ועל הפיתוח של הנגד כי ניתן לפתח כדי לשמור על בריאות במהלך ואחרי אדם בחלל.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של המרכז הרפואי בית ישראל מסדר הדיאקוניסות תחת פרוטוקול מספר 067-2016.

הערה: משמשים Wistar זכר עכברים בגיל 14 שבועות בנקודת ההתחלה (יום 0). חולדות מלון בנפרד בסיסית מוקדמת 24 שעות הכלובים מותאם אישית כדי לאפשר והפיזיולוגי.

1. Hindlimb פריקה

הערה: ניתן לשים את הרתמה האגן על בעלי חיים או מורדם או ער. . כאן, התיאור של הפרוטוקול ניתנת על חיות מורדם. ללבוש ציוד מגן אישי המתאים (עיקרון השוויון הפוליטי) להתמודד עם בעלי חיים.

1. מקם את החולדה קופסת הרדמה ועם 3.5% איזופלוריין של זרימת חמצן 2 ל'/min.
   הערה: ההרדמה המתאים הוא אישר כאשר קמצוץ המשרד הכפה האחורי לא זכה לתגובה.
2. ברגע החיה הוא מורדם לחלוטין, מקום העכברוש על הספסל עם הגז המרדים מגיע nosecone עם 2% איזופלוריין והזרימה חמצן של 1.5 ליטר/דקה.
3. למקם את החולדה במצב שכיבה, לשים את הרתמה האגן בתנועה rostro-סימטרית.
4. בעדינות לכופף הרתמה האגן כדי לספק ולהצמיד מתאים תוך נזהר לא לסחוט את hindlimbs כדי למנוע שריטות ואי נוחות.
5. לצרף את שרשרת נירוסטה עם האבזם המסתובב העליון של האגן הרתמה, איפה קרס מצורפת בבסיס הזנב.
6. להסיר את החולדה מן ההרדמה והמקום החיה בכלוב מותאם אישית עם השרשרת מורחב מקסימום שלה.
7. ברגע העכברוש הוא ער לחלוטין, ניידים, לקצר את השרשרת באמצעות האבזם המסתובב העליון עד הגפיים האחוריות כבר לא יכולים להגיע אל הרצפה.
8. להתבונן החיה לכמה דקות להעריך את הנוחות שלו זה בכלל פעמים, שני הגפיים האחוריות נשארות לפרוק לחלוטין.

2. נשיאת משקל חלקית

הערה: שלב זה ניתן למימוש בבעלי חיים ערה וגם מרדימים.

1. להמיר את המכשיר הבולם HLU השעיה PWB על-ידי הוספת החלק בצורת משולש, מורכב של רשתות נירוסטה מוט בגב.
2. עזים ומתנגד החיה בעקבות אותם הליכים כמפורט עבור HLU (שלבים 1.1 ו- 1.2).
3. למקם ז'קט הקשר של הגודל המתאים forelimbs של העכברוש (ז על חולדות של 400 גרם או פחות, L חולדות במשקל של מעל 400 גרם) ולסגור אותו באמצעות התקן ההרחבה בגב החזייה.
4. לצרף הקרס ממוקם בגב החזייה ב- extender האבזם השני על הקרס ממוקם על הרתמה האגן בבסיס הזנב אבזם אחד של החלק בצורת משולש.
5. לאפשר את החיה להתאושש מן ההרדמה בכלוב. ברגע ער, ודא ההשעיה היא שווה גם את forelimbs וגם את hindlimbs באמצעות קיצור השרשרת ועריכת המיקום של האבזם המסתובב התחתון במידת הצורך.
   הערה: שלב זה גם ניתן למימוש באמצעות צלחת כוח כדי לאשר טעינת שווה על כל האיברים.
6. מקם את העכברוש בראש הסולם כדי להקליט את משקל הגוף "טעון", קרי, המשקל של בעלי חיים לבין המנגנון כולו, ללא קיצור השרשרת.
7. לקצר את השרשרת עד הסולם מציג 40% משקל הגוף "טעון" ולהקליט מושגת רמת הכבידה (המבוטא כיחס בין משקל לפרוק ומשקל טעון).
8. להתבונן החיה כדי לוודא כי המשקל לפרוק היא יציבה, העכברוש נטענה באופן שווה על כל האיברים.
9. להסיר את כל המתקן קנה המידה באמצעות המוט ולמקם את החולדה לכלוב.

3. הערכה של hindlimb לאחוז בכוח

1. החזק את החולדה באיפוק המסורתית על-ידי הצבת יד אחת מתחת forelimbs. החזק בעדינות את הזנב עם היד השנייה.
2. לגשת הבר אחיזה עם הכפות האחורי וודאו כי בשתי כפות הרגליים מונחות באופן מלא על הבר.
   הערה: אם החולדה לא לאחוז באופן מלא הבר או לא מציג ראיות מרתק מרצון, מעט לשחרר הריסון. אם זה לא מוצלח, לחזור העכברוש בכלוב ונסה שנית לאחר מספר דקות.
3. משוך בעדינות את החולדה ישר בחזרה עד שהוא משחרר מאחיזתו. להקליט את כוח מקסימלי המוצג על המתמר.
4. רגע כ-30 s בין מדידות לחזור על הבדיקה 3 פעמים.
5. לחשב את הממוצע של שלוש מדידות עבור ניקוד, לחשבון על עייפות.

4. הקלטה של שריר רטוב מסה

1. מקם את החולדה בחדר המתת חסד₂ CO. לאחר המתנה הזמן המתאים על פי הנחיות IACUC AVMA, לאשר המתת חסד על ידי אבחנה חזותית של חוסר נשימה.
2. למקם את החולדה על השולחן לנתיחה במצב של שכיבה ולהסיר את הפרווה והעור מאת אם ליד הקרסול בעזרת מספריים קטנות לנתיחה. השתמש ידיים כדי לשלוף את שכבת העור.
3. בעזרת מספריים קטנות לנתיחה, בעדינות לשבור fascia שריר ולבודד הגיד calcaneus.
   הערה: הגיד calcaneus היא הנקודה החזקה של הסוליה והן את שרירי הסובך.
4. בעוד אתה מחזיק את גיד calcaneus עם זוג מספריים קטנות, להשתמש את המספריים לנתיחה כדי לבודד את שרירי הסובך, הסוליה מ הדו-ראשי, הממוקם מעל.
5. מבודדת בעבר, חותכים את נקודת הצמדה של שרירי הסובך, הסוליה באיזור popliteal.
6. בעדינות משוך את הסוליה הרחק הסובך, לנתק אותם על ידי חיתוך של גיד calcaneus.
7. מקם את החולדה במצב פרקדן. בזהירות הסר fascia, לקלף את השוקתי הקדמי של הקרסול תנועה כלפי מעלה.
8. חותכים את השוקתי הקדמי בנקודה מצורף מעולה.
9. לתעד את המסה רטובה המדויקת של כל שריר נכרת באמצעות סולם tared precision וסירה במשקל.

מנצל הכלובים החדשים כי קודם לכן עיצבנו, תיאר בפירוט12, היינו מכשיר ההשעיה מבוססת-רשת נירוסטה מתאים גם hindlimb פריקה (HLU, איור 1) וגם חלקית-נשיאת משקל (PWB, איור 2). היתרון קריטי של העיצוב שלנו היא היכולת ללכת מסוג אחד של פריקה השני ב עניין של דקות תוך שמירה על סביבה זהים לבעלי החיים. השתמשנו רתמה האגן בהזמנה אישית (איור 2 א) שאליו מחובר שרשרת בודד נירוסטה בהזמנה אישית עם אבזם המסתובב בכל צד עבור HLU. על מנת לשנות את התקן השעיה זה ולהשיג PWB, יש התוספת של חתיכה אחת בצורת משולש של רשת נירוסטה משולב רוד גב נוקשה, שנועדה לשבת מעל עמוד השדרה (איור 3) הדרישה היחידה. ניתן לבצע שלבים אלה חיות ער או מורדם.

עם הסביבה רב-תכליתי הניתנים בניסוי זה, שנוכל בהצלחה לפרוק את hindlimb של כל החיות שלנו במשך 7 ימים ללא סיבוכים ולא במהירות לחשוף אותן הכבידה חלקית ל-40 אחוז הטעינה הרגיל שלהם (PWB40, ממוצע מושגת כוח המשיכה רמת 0.4076 g ± 0.0036 g). במהלך השבוע הראשון של HLU הכולל, בעלי חיים מוצגים הגוף משמעותית במשקל (איור 4A:-7.19% ± 0.87%, n = 9, p < 0.001), אשר חוותה בשני מודלים14, אינו שונה באופן משמעותי מכל מה שראינו ב- חולדות חשוף PWB40 לשעתיים (-5.53% ± 1.44%, n = 10, p = 0.37). עם זאת, בעלי חיים המשיך לרדת במשקל לאורך זמן תוך לאחר מכן נחשפים PWB40 (-9.06% ± 1.35% מקו, p < 0.0001).

Hindlimb ידית כוח היא מדידה סטנדרטית של תפקוד השרירים יכול לשמש longitudinally (איור 4B). שמנו לב לשבוע של סה כ פריקה הובילה ירידה הממוצע כוח אחיזה של 50.16% ± 4.10% לעומת בסיסית (p < 0.0001). אחרי שבוע לאחר מכן אחד נושאת ב 40% טעינה נורמלי משקל חלקית, אנחנו לא הבחין כל עוד שינוי לגבי כוח אחיזה (-44.29% ± 4.67% בהשוואה בסיסית, p < 0.0001). כל הזמן-נקודות, השינוי באחוזים בכוח את האחיזה כף הרגל האחורית היה שונה באופן מהותי מן הפקדים מתאימים-גיל (p < 0.0001 ביום 7 וגם יום 14, n = 11). בנוסף, ראינו כי לאחר סיום המחקר, בעלי חיים שעברו הכוללת פריקה ואחריו נושאת (HLU-PWB40) משקל חלקי להציג לאובדן כוח אחיזה גדול יותר באופן משמעותי בהשוואה לקבוצה PWB40 (p = 0.03).

שרירים המוני רטוב שנרשם בסוף הניסוי, לעומת הנתונים שהתקבלו לאחר שבועיים של טעינה רגילה או שבועיים של PWB40 (איור 4C) ונתונים שפורסמו קודם לכן על ידי שלנו קבוצה12. מצאנו כי הקבוצות PWB40 ו- HLU-PWB40 יש באופן משמעותי נמוך יותר רטוב מסה של הסוליה (S), הסובך (ז), ואת השרירים השוקתי הקדמי (TA) מאשר פקדים מתאימים-גיל (PWB100). אכן, הקלטנו את המוני של הסוליה הממוצע ± 0.1681 g g 0.007 לבעלי שלנו אשר היה נמוך באופן משמעותי משל החולדה חשופים PWB100 ב 2 שבועות בניסויים הקודמים שלנו (-24.60% ± 3.18%, p < 0.0001). עבור הסובך, הקלטנו המסה רטובה הממוצע של 2.192 g ± 0.096 g (-10.55% ± 3.93%, p = 0.038 vs PWB100), גוש רטוב של 0.759 g ± 0.029 g עבור השוקתי הקדמי (-14.40% ± 3.27%, p = 0.009 vs PWB100). בזמן שלנו ערכת נתונים מודגש כי החיות נחשפים אנלוגי למאדים (HLU-PWB100) היה לי גוש רטוב ירידה של הסוליה שרירי הסובך לעומת החיות חשופים PWB40 ב 2 שבועות רציפה (-8.75% ± 3.84% ל--5.85% ± 4.14%, בהתאמה), אנו מבחינים לא הבדל משמעותי בין שתי הקבוצות הללו.

איור 1: תיאור של המכשירים ההשעיה וכיצד להמיר מ HLU ל- PWB. (א) מבוסס על העיצוב הקודם שלנו, השתמשנו של מוט אלומיניום יושב על הכלוב להחזיק השעיה קבוע המכשיר המורכב צרור מפתחות מאובטחות במרכז המוט (חץ 1), שרשרת נירוסטה (חץ 2), ולא שניים המסתובב אבזמי (חיצים 3). (B) כדי להמיר את המכשיר הבולם להשגת PWB, מבנה בצורת משולש מחובר באמצעות התחתון המסתובב האבזם. יצירה זו מורכבת רשתות נירוסטה מוט גב פוליוויניל כלוריד (PVC) שיושב מעל עמוד השדרה של החולדה (חץ 1). בכל צד של המוט האחורי הוא ממוקם אבזם כדי לצרף את הרתמה, הז'קט, בהתאמה (חץ 2). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: הינד האיבר פריקה באמצעות רתמה אגן. (א) קדימה והצידה להציג ציורים של המבנה לרתום המשמשת לתמיכה הגפיים האחוריות של בעלי החיים. (B) הרתמה האגן הוצב כמתואר כדי להתאים מתכרבלת סביב הגפיים האחוריות של העכברוש. הקישור פלדת אל-חלד יונח מעל בסיס הזנב, המצורפת האבזם המסתובב. המיקום המדויק ואת צורת הרתמה יכול להשתנות בין חיות אבל חולדות אמור להיות נוח, זה הכרחי כי הגפיים האחוריות שלהם לעולם לא לגעת באדמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: נשיאת משקל חלקית. פריקת חלקית דורש התוספת של ג'קט לחיה על מנת לתמוך את הגפיים קבלה. הז'קט נסגר אז עם הרחבה של חזיית גב, קרס מחובר ב- extender, שוכב בין השכם. הז'קט והן את הרתמה האגן מחוברים אבזמי ממוקם בקצה אחד של המוט האחורי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4: דוגמאות מעקב האורך אצל בעלי חיים שנחשפו לרמות פריקה שונות. (א) הגוף משקל שינוי (BW). חיות נשקלו שבועי ללא המשקל רתמה או מעילים וגוף הוקלט. PWB100 = משקל חלקי הנושאת על טעינה נורמלי; PWB40 = משקל חלקי הנושאת ל-40 אחוז הטעינה נורמלי; HLU-PWB40 = שבוע אחד hindlimb פריקה ואחריו שבוע אחד של PWB40. תוצאות הבדיקה לאחר הוק של Tukey בעקבות של 2-way ANOVA מוערם המוצגים כדמויות *: p < 0.05, * *: p < 0.01, * * *: p < 0.001, ו * * *: < 0.0001 p vs PWB100. (B) שינוי כוח אחיזת כף הרגל האחורית. כפת שבועי, אחורי לאחיזה כוח נמדד, התוצאות היו לידי שינוי מקו עבור כל חיה. תוצאות הבדיקה לאחר הוק של Tukey בעקבות של 2-way ANOVA מוערם המוצגים כדמויות * * *: p < 0.001 ו * * *: vs < 0.0001 p PWB100, α: p < 0.05 vs PWB40. (ג) השריר רטוב מסה לאחר 14 יום. שרירים המוני רטוב הוקלט על סולם precision מיד לאחר ההקרבה-14 ימים. התוצאות מוצגים אחוזים של המסה רטובה שהושגו בקבוצת הביקורת מתאימים-גיל (PWB100). S = הסוליה; G = הסובך; טה = השוקתי הקדמי. תוצאות הבדיקה לאחר הוק של Tukey בעקבות חד-כיווני אנובה מוצגות כחלק *: p < 0.05, * *: p < 0.01, ו * * *: < 0.0001 p vs PWB100. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

המחברים אין לחשוף.