מאמר שיטה

זיהוי של גורמי הנוקלאוולאר במהלך שכפול HIV-1 באמצעות Rev Immunoprecipitation וספקטרומטר מסה

DOI:

10.3791/59329

⸱

26 ביוני 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Molecular and Cellular Biology Department, Beckman Research Institute at the City of Hope, 2Irell & Manella Graduate School of Biological Sciences, 3Department of Molecular Immunology, Beckman Research Institute and the City of Hope

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מתארים Rev immunoprecipitation בנוכחות של שכפול HIV-1 עבור ספקטרומטריה המסה. ניתן להשתמש בשיטות המתוארות לזיהוי גורמי נוקלאוולאר המעורבים במחזור הזיהומיות של HIV-1, וחלים על מודלים אחרים של מחלות לאפיון מסלולים בעלי מחקר.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחזור הזיהומיות HIV-1 דורש אינטראקציות חלבון ויראליות עם גורמים מארחים כדי להקל על שכפול נגיפי, אריזה ושחרור. המחזור הזיהומיות מצריך היווצרות של מכלולי חלבון מארח ויראלי עם ה-HIV-1 RNA כדי לווסת את החבור ולאפשר הובלה באמצעות נוקלאוציטוטופלסמטי. ה-HIV-1 הפוך חלבון משיגה את היצוא הגרעיני של HIV-1 mRNAs באמצעות multimerization עם מטרות משחק של האחים הנוטרוניים-אלמנט התגובה Rev (בלבד). אות הלוקליזציה של נוקלאוולאר (NoLS) קיים בתוך COOH-הטרמינוס של הrev arginine עשיר מוטיב (זרוע), המאפשר הצטברות של מתחמי Rev/בעלי-מערכות בנוקלאוולוס. גורמי הנוקלאוולאר הם העריכו לתמוך מחזור זיהומיות HIV-1 באמצעות פונקציות אחרות שונות בנוסף ל-mRNA-עצמאי היצוא הגרעיני שחבור. אנו מתארים שיטה immunoprecipitation של פראי-סוג (WT) Rev בהשוואה מוטציות הפוך נוקלאוולאר (מחיקה ונקודה אחת Rev-NoLS מוטציות) בנוכחות של HIV-1 שכפול עבור ספקטרומטריה המסה. הגורמים הנוקלאופילים מעורבים בתחבורה הנוקלאוציטוטופלסמטי (נוקלאואופלסין B23 ונוקלאוולין C23), כמו גם גורמי שחבור סלולריים, לאבד אינטראקציה עם Rev בנוכחות של מוטציות Rev-NoLS. גורמים שונים של נוקלאוולאר, כגון מ58, מזוהים לאבד אינטראקציה עם מוטציות Rev, אך תפקידם במחזור השכפול של HIV-1 נותרו לא ידועים. התוצאות המוצגות כאן להפגין את השימוש בגישה זו לזיהוי של נגיפי/מארח הגורמים הנוקלאוולמאר השומרים על מחזור זיהומיות HIV-1. המושגים המשמשים בגישה זו חלים על מודלים ויראליות ומחלות אחרים המחייבים אפיון של מסלולים בעלי מחקר חסר.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנוקלאוולוס שוכן כשטח האינטראקציה של מגוון מארח הסלולר והגורמים הנגיפים הדרושים לשכפול נגיפי. הנוקלאוולוס הוא מבנה מורכב החולק לשלושה תאים שונים: תא fibrillar, תא fibrillar צפוף, והתא הגרגירים. החלבון HIV-1 הפוך מכיל במיוחד בתוך תאים גרגירים; עם זאת, הסיבה לתבנית הלוקליזציה אינה ידועה. בנוכחות של מוטציות חד הנקודה בתוך רצף NoLS (מוטציות Rev 4, 5, ו 6), Rev שומר על דפוס נוקלאוולאר והוכח בעבר להציל HIV-1HXB2 שכפול, עם זאת, עם יעילות מופחתת לעומת WT Rev1 . כל המוטציות של נקודה אחת אינן מאפשרות לקיים את המחזור הזיהומיות של HIV-1NL4-3 . בנוכחות מוטציות מרובות נקודה אחת בתוך הרצף NoLS (מוטציות Rev-NoLS 2 ו -9), Rev כבר נצפתה להתפזר לאורך הגרעין הציטופלסמה ולא הצליח להציל HIV-1HXB2 שכפול1. המטרה של מחקר זה פרוטאומניקס היא לפענח נוקלאוולאר, כמו גם גורמים סלולריים nonnucleolar מעורב במסלול Rev-מתווך HIV-1 מדבקת. התנאים Rev immunoprecipitation ממוטבים באמצעות אינטראקציה עם נוקלאוולאר B23 פוספופפרוטאין, אשר בעבר הוכח לאבד אינטראקציה עם Rev בנוכחות של מוטציות נוקלאוקולאר.

Rev הגורמים הסלולריים נחקרו בהרחבה בעבר; עם זאת, זה נעשה בהעדר פתוגנזה נגיפית. חלבון אחד, במיוחד, כי הוא מאופיין במחקר זה באמצעות הפוך אינטראקציה במהלך שכפול HIV-1 הוא נוקלאוולאר פוספהוופפרוטאין B23-נקרא גם נואופהוסמרין (npm), numatrin, או NO38 דו חיים2,3, 4. B23 מתבטא כשלוש איזוforms (NPM1, NPM2 וNPM3)-כל חברי המשפחה הגרעינית/נואופלמיסמין משפחת מלווה בנשק גרעיני5,6. המלווה המולקולרי NPM1 פונקציות בהרכבה נאותה של נוקלאוטיזומים, בהקמת מתחמי חומצות חלבון/גרעין המעורבים במבנים מסדר גבוה כרומטין7,8, ובמניעת צבירה ו קיפול חלבונים של יעד דרך מתחם ליבה N-terminal (שאריות 1-120)9. NPM1 פונקציונליות מרחיב הריבוכמה בראשית דרך התחבורה של חלקיקים preriboזומתיים בין הגרעין לציטופלסמה10,11, עיבוד של preriboזומא ברצף החלל הפנימי של מועתק 12,13, ומעצר את צבירת הנוקלאוולאר של חלבונים במהלך מכלול הריבוזומיום14,15. NPM1 הוא מעורב עיכוב של אפופטוזיס16 ו בייצוב של הגידול דכאי arf17,18 ו p5319, חשיפת תפקידה הכפול כגורם אונגניים ומדכא הגידול. NPM1 משתתפת בפעילות התאית של יציבות הגנום, שכפול הסנטרוכמה ותמלול. NPM1 נמצא נוקלאופולי במהלך המחזור הפנימי של מחזור התא, לאורך הפריפריה הרומוזומלית במהלך mitosis, ו ב prenucleolar גופים (PNB) בתום מיטוזיס. NPM2 ו NPM3 אינם למדו כמו NPM1, אשר עובר רמות ביטוי משתנה במהלך ממאירות20.

NPM1 מתועדת המעבר נוקלאוציטופטומיק של חלבונים גרעיניים/נוקלאוולאר שונים דרך נס פנימי ו-NLS9,21 בעבר דווחה לכונן את היבוא הגרעיני של HIV-1 תאת והפוך חלבונים. בנוכחות של B23-הדומיין-β-גלטוסידאז היתוך חלבונים, תאת מאחרבתוך הציטופלסמה ומאבדת פעילות הפעלה; זה מדגים אהדה חזקה של תאת עבור B232. מחקר נוסף הקים מתחם יציב Rev/B23 בהעדר של mRNAs המכיל את הקובץ. בנוכחות של בעל mRNA, Rev הנתק מ B23 ונקשר בעדיפות ל-HIV עם, המוביל לעקירה של B2322. זה לא ידוע איפה, ברמה הגרעינית תת, תאת ההפעלה ואת תהליך המרת Rev של B23 עבור HIV mRNA להתרחש. שני החלבונים מוצדדים להיכנס לנוקלאוולוס בו זמנית באמצעות B23 אינטראקציה. מעורבות של חלבונים סלולריים אחרים מארחים בנתיב הנוקלאוולאר של HIV צפוי. השיטות המתוארות בחקירה הפרוטסטנטית הזאת תסייע להבהיר את הגומלין של הנוקלאוולוס עם גורמים סלולאריים מארחים המעורבים במהלך הפתוגנזה HIV-1.

החקירה פרוטאומיקס הופעל באמצעות הביטוי של Rev nols מוטציות חד הנקודה (M4, M5, ו M6) והחלפות ארגינין מרובים (M2 ו-M9) עבור HIV-1HXB2 הייצור. במודל זה, קו של תא של הלה ביטוי באופן מופתי Rev-1HXB2 (hlfb) הוא מנוכר עם WT rev ומוטציות הפוך הכולל תג דגל בסוף 3 '. הנוכחות של WT Rev יאפשר שכפול ויראלי להתרחש בתרבות HLfB, בהשוואה מוטציות Rev-NoLS כי לא להציל מחסור Rev (M2 ו M9), או לאפשר שכפול נגיפי להתרחש אבל לא ביעילות כמו WT Rev (M4, M5, ו M6)1. ליפוסט התא נאסף 48 h מאוחר יותר לאחר התפשטות ויראלי בנוכחות Rev הבעה ונתון immunoprecipitation עם מאגר לפירוק ממוטב עבור האינטראקציה Rev/B23. מיטוב מאגר לליזה באמצעות ריכוזי מלח משתנה מתואר, ושיטות החלבון של HIV-1 Rev מושווים ונותחו בכסף מוכתם או Coomassie מוכתם SDS-דף ג ' לים. הגישה הראשונה פרוטקוממיקס כרוכה בניתוח ישיר של דגימת שלווה מבוטא WT הפוך, M2, M6, ו M9 על-ידי טנדם ספקטרומטר מסה. הגישה השנייה שבה האלוטים של WT Rev, M4, M5, ו M6 עברו תהליך החילוץ ג'ל הוא לעומת הגישה הראשונה. פפטיד זיקה כדי Rev-NoLS מוטציות בהשוואה WT Rev מנותח ואת ההסתברות זיהוי חלבון מוצג. גישות אלה חושפים גורמים פוטנציאליים (נוקלאוקולאר ו-nonnucleolar) המשתתפים בתחבורה HIV-1 mRNA ושחבור עם Rev במהלך שכפול HIV-1. באופן כללי, פירוק התא, IP, ותנאי הימנעות מתוארים חלים על חלבונים ויראלי של עניין להבנת גורמים סלולריים מארחים המפעילים ומווסת מסלולים זיהומיות. הדבר חל גם על חקר גורמי מארח סלולריים הנדרשים להתמדה של דגמי מחלות שונות. במודל זה פרוטאומניקס, HIV-1 Rev IP ממוטב עבור B23 אינטראקציה כדי להבהיר גורמים נוקלאואוליאר מעורב בפעילות שיוט נוקלאוצילסמטי ו-HIV-1 mRNA מחייב. בנוסף, קווי התא המבטא באופן בלתי נשכח דגמי מחלות זיהומיות כי הם חסרים חלבונים מפתח של עניין ניתן לפתח, בדומה לקו התאים HLfB, כדי ללמוד מסלולים זיהומיות של עניין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תרבית תאים

  1. לשמור HLfB ב בינונית שונה של מדיום הנשר (DMEM) שיושלם עם 10% סרום העובר העוברי (FBS), 2 מ"מ L-גלוטמין, ו 1 mM נתרן פירובט בתוך רקמות-תרבות מטופלים 100 מ"מ לוחות. לשמור על תרביות תאים ב 37 ° c בתוך מחולל לחות שסופקו עם 5% CO2. המעבר מקשר תאים לצפיפות תאים של 1 x 106 תאים/mL.
  2. מחק את מדיית תרבות התא. לשטוף בעדינות את התאים עם 10 מ ל של תמיסת מלח 1 x פוספט באגירה (PBS). הסר והשמט את ה-PBS 1x מבלי לשבש את שכבת התא.
  3. הוסף 2 מ ל של פתרון 1x טריפסין-EDTA לתאים. מטלטל את הצלחת כדי לחלוק את המונאולייר והדגירה ב 37 ° c בתוך חדר מחולל לחות במשך 5 דקות.
  4. הקש בחוזקה על צד המנה בכף היד כדי לנתק את התאים. השהה מחדש את התאים המנותקים ב-8 מ ל של מדיית תרבות טרייה. לסובב את התאים ב 400 x g עבור 5 דקות.
  5. התעלם ממדיית התרבות מבלי לשבש את הגלולה הסלולרית. השהה מחדש את הגלולה ב -10 מ ל של מדיית תרבות טרייה. תת-תרבות 1 מ ל של תאים מרוכזים עם 9 מ ל של מדיה תרבותית טרייה בתוך רקמה-תרבות מטופלים 100 מ"מ לוחות.
    הערה: עבור כל מוטציה של Rev-NoLS, 3x 100 מ"מ או לוחיות התרבות של הלה תניב מספיק חלבונים לניתוח כתמי אבן מערבית וספקטרומטר מסה. הוסף צלחות נוספות עבור שליטה ובקרה חיובית של הפוך WT ופקד שלילי. נפח תא תת-תרבות ידרוש אופטימיזציה עם שימוש בסוגי תאים שונים.

2. ביטוי של מוטציות של Rev-NoLS-3 דגל במהלך שכפול HIV-1

  1. הגדל את תרבות התא HLfB לצפיפות תא של 2 x 106 תאים/mL. הכינו 4 מ ל של סידן פוספט-DNA השעיית עבור כל צלחת 100 מ"מ כדלקמן.
    1. תווית 2 15 mL צינורות 1 ו 2. הוסף 2 מ ל של 2x HBS (0.05 M HEPES, 0.28 M הנאל, ו 1.5 mM Na2hbs4 [pH 7.12]) כדי צינור 1. הוסף TE 79/10 (1 mM טריס-HCl ו 0.1 mM EDTA [pH 7.9]) לצינור 2. הנפח של TE 79/10 הוא 1.760 mL-נפח של דנ א.
    2. להוסיף 20 μg של פלאמיד המכיל את מוטציה הדגל של הRev-NoLs-3 של עניין לצינור 2 ולערבב את תוכנו באמצעות resuspension. הוסף 240 μL של 2 M CaCl2 כדי צינור 2 ולערבב שוב דרך השעיה.
    3. להעביר את התערובת של צינור 2 כדי צינור 1 dropwise, בעדינות ערבוב. אפשר להשעיה לשבת בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.. מערבולת המשקעים
  2. הוסף 1 מ ל של ההשעיה השעיה לכל אחד התרבות 3-תאים, 100 מ"מ לוחות תוך התערבל בעדינות את המדיה. החזר את הצלחות לחממה והשאר את תערובת האוויר למשך 6 שעות. החלף את תערובת הגידול באמצעות 10 מ ל של מדיית תרבות טרייה, והתאים החדשים ל42 h.

3. אוסף של חלבון ויראלי ליפוסט

  1. התעלם מהמדיה הסלולרית 48 h מחיקת הדואר. מניחים כל צלחת 100 מ"מ על מצע של קרח. תווית 15 מ ל צינורות עבור כל דגם Rev-NoLS מוטציה ומניחים את הצינורות על הקרח.
  2. לשטוף בעדינות את התאים עם 10 מ ל של מקורר 1x PBS מבלי לשבש את שכבת התא. התעלם מ-1x PBS. הוסף 3 מ ל של מאגר הליזה (50 mM Tris-HCl [pH 8.0], 137 mM הנאקל, ו 1% X-100 אבקת כביסה [לראות את הטבלה של חומרים]), מטופלים עם קוקטייל פרוטאז מעכבי, על כל אחד לוחות 100 mM.
  3. השתמש במגרד תא כדי לשבש את שכבת התא. להטות את הצלחת ולגרד בעדינות ולאסוף את התאים לתוך הבריכה. לאסוף את התא ליפוסט באמצעות מיקרופיפטה 1,000 μL ולערבב את התאים lysates מכל אחד 3 100 מ"מ לוחות בצינור המסומן 15 מ"ל.
  4. דגירה של התא ליפוסט על הקרח עבור 15 דקות, vortexing כל 5 דקות. צנטריפוגה את התא למטה ב 15,000 x g עבור 5 דקות.
  5. לאסוף את החלבון supernatant מבלי לשבש את הגלולה פסולת התא ולהעביר אותו לצינור אחר 15 מ ל סטרילי. השיגו את ריכוז החלבון הנגיפי בשיטת ברדפורד (ראו סעיף 4).
  6. שמור מדגם הקלט (20 μg) עבור ניתוח של כתמי חיסוני מערבית. הוסף מאגר לדוגמה של 2x (20% גליצרול, 0.02% ברומאופנול כחול, 125 mM טריס-Cl [pH 6.8], 5% SDS, ו-10% 2-mercaptoethanol) לנפח הסופי. מרתיחים את זה ב 95 ° c עבור 10 דקות, ולאחסן את דגימת הקלט ב-20 ° c.

4. שיטת ברדפורד

הערה: הכינו אלבומין באורך 10 x סרום (BSA) ממלאי 100x BSA לפני יצירת עקומות סטנדרטיות של חלבון.

  1. מחלקים מים לצינורות מיקרוצנטריפוגה עבור ריק ותקנים הבאים: ריק = 800 μL; סטנדרטי 1 = 2 מ"ג/mL, 798 μL; תקן 2 = mg/mL, 796 μL; סטנדרטי 3 = 6 מ"ג/mL, 794 μL; Standard 4 = 8 מ"ג/mL, 792 μL; סטנדרטי 5 = 10 מ"ג/mL, 790 μL. Aliquot 10x BSA לתוך התקנים המיועדים הבאים: תקן 1 = 2 μL; תקן 2 = 4 μL; רגיל 3 = 6 μL; סטנדרטי 4 = 8 μL; סטנדרטי 5 = 10 μL.
  2. הכינו תערובת של דגימות חלבון על ידי ערבוב 795 μL של מים עם 5 μL של דגימות חלבון. הוסף 200 μL של שיטת החלבון מגיב צבע (לראות את הטבלה של חומרים) לכל ריק, תקן, וחלבון דגימת. וורטקס הדגימות לזמן קצר לתערובת ולדגירה בטמפרטורת החדר (18-20 ° c) עבור 5 דקות.
  3. העבר את דגימות הריקות, התקנים והחלבונים לכיוון כימיקלים. למדוד את ריכוזי החלבון ב OD של 595 ננומטר.

5. Coimmunoprecipitation של Rev-NoLS-דגל 3

  1. לשטוף 25 μL של M2 מחרוזות ג'ל האהדה (לראות את הטבלה של חומרים) עם 500 μl של מאגר לפירוק, מטופלים עם קוקטייל פרוטאז מעכבי. לשטוף יותר חרוזים ג'ל אהדה עבור כל דגימת מוטציה ופקדים.
    הערה: הכינו מספיק מחרוזות ג'ל האהדה של M2 לשני ג'לים (50 μL)-אחד עבור ניתוח חיסוני מערבי והשני לצביעת חלבונים וספקטרומטר מסה.
  2. ספין ב 820 x g עבור 2 דקות ב 4 ° c. . הסר את הסופרנטאנט . שטפו עוד 2x
  3. הוסף חלבון נגיפי ליפוסט (1 מ"ג/mL ב 5 מ ל של נפח כולל) לחרוזי האהדה M2 מראש מראש. כוונן את אמצעי האחסון הכולל באמצעות מאגר הליזה.
  4. מודב את התגובה 3 שעות, מסתובבת 4 ° c. צנטריפוגה את חרוזי האהדה M2/חלבון נגיפי ליפוסט ב 820 x g עבור 1 דקות.
  5. לאסוף את supernatant ולשמור את התמונה של מדגם post-IP (20 μg) עבור ניתוח חיסוני מערבי. למדוד את ריכוז החלבון של ליפוסט IP לאחר. לאסוף 20 μg עבור החיסונית המערבית.
  6. הוסף מאגר לדוגמה של 2x לאמצעי האחסון הסופי. מרתיחים את זה ב 95 ° c עבור 10 דקות, ולאחסן את המדגם post-IP ב-20 ° c.
  7. לשטוף את חרוזי M2 עם 750 μL של מאגר הליזה ולשטוף את החרוזים על מסובבי ב 4 ° צ' עבור 5 דקות. צנטריפוגה את חרוזי M2 ב 820 x g ולהיפטר supernatant.
  8. חזור על שלבים 5.7 לשתי שטיפות נוספות על מסובבי ב -4 ° c עבור 5 דקות. לאחר השטיפה השלישית, להסיר את כל העקבות של מאגר לליזה מתוך חרוזי M2 חרוזים/co-IP באמצעות טיפ ארוך טעינת ג'ל.
    הערה: צבוט את הקצה של קצה הטעינה של ג'ל עם פינצטה שטוחה לפני הסרת כמויות המעקב של מאגר הליזה. זה ימנע את ההפרעה ואת ספיגת החרוזים M2.
  9. השהה מחדש את חרוזי M2 ב-55 μL של מאגר טעינת 2x. מרתיחים את המדגם ב 95 ° c עבור 10 דקות.
  10. טען 25 μL של משחרלי לשני SDS נפרדים-דף ג'לים (ג'ל אחד עבור מערכות חיסונית מערביות והשני עבור כתמים Coomassie אחרים).

6. הכנת כלים לעמודים

  1. Cast 2 15% SDS-אקרילאמיד לפתור ג'לים על ידי ערבוב של ריאגנטים הבאים בצינור 50 mL (בנפח הסופי של 40 mL, מספיק עבור ארבעה ג'לים): 4.16 mL של מים אולטרה-ממדי, 15 מ"ל של 40% אקרילאמיד: ביאקרילאמיד (29:1), 10 מ ל של 1.5 M טריס-HCl (pH 8.8) , 400 μL של 10% SDS, 400 μL של 10% אמוניום פרסולפט, ו 40 μL של TEMED.
  2. מערבבים את ג'ל הפענוח על ידי היפוך הצינור 50 mL מספר פעמים. פיפטה את התערובת ג'ל לתוך מנגנון ג'ל מערבי לניקוי מראש (ארבעה ג'לים-שלושה עבור המערכת החיסונית המערבית ואחד עבור Coomassie כסף כתמים).
  3. בעדינות מספיק מים כדי לכסות את השכבה העליונה של תערובת ג'ל. . הניחו לג'ל הפענוח לפולימו
  4. יוצקים את שכבת המים מן ג'ל הפתרון, באמצעות מגב משימה עדין (ראה את הטבלה של חומרים) כדי לספוג את כל המים העודפים.
  5. שחקנים 5% sds-אקרילאמיד הערמה ג ' לים על ידי ערבוב של ריאגנטים הבאים בצינור 50 mL (בנפח הסופי של 20 מ"ל, מספיק עבור ארבעה ג'לים): 11.88 מ ל של מים אלקטרופורזה, 2.5 ml של 40% אקרילאמיד: bisacrylamide (29:1), 5.2 ml של 1.5 M טריס-HCl (pH 8.8) , 200 μL של 10% SDS, 200 μL של 10% אמוניום פרסולפט, ו 20 μL של TEMED.
  6. מערבבים את ג'ל הערימה על ידי היפוך צינור 50 mL מספר פעמים. פיפטה את התערובת ג'ל מעל ג'ל הפתרון לחלק העליון של המנגנון.
  7. מניחים מסרק לקלטת ג'ל המכיל את מספר הנתיבים המתאים לתוך ג'ל הערימה. לספוג כל גלישה של התערובת ג'ל באמצעות מגב משימה עדינה (לראות את הטבלה של חומרים). הניחו לג לעבור באופן מוחלט.
  8. המבול מכשיר ג'ל המערבי עם מאגר הפעלה 1x המערבי (ריכוז 5x: 250 mM טריס-Cl [pH 8.3], 1.92 M גליצין, 0.5% SDS, ו 10 מ"מ EDTA).
  9. משוך בעדינות את מסרק הקלטת ג'ל מהג'ל לערימה. אפשר למאגר ההפעלה המערבי של 1x למלא את בארות הטעינה. ריקון כל הטוב עם מאגר מערבי 1 x פועל באמצעות מזרק לפני טעינת דגימות.
  10. העמיסו את הדגימות של כתמי הנוגדנים המערבית לכל ג'ל תואם (דגימות קלט, דגימות coimmunoprecipitated ודגימות פוסט-IP). לטעון את סמני חלבון מערבי ג'ל.
  11. העמיסו את דגימות coimmunoprecipitated עבור Coomassie כסף מכתים לתוך ג'ל אחר. לטעון את סמני חלבון מערבי ג'ל.
  12. לחבר את המכשיר ג'ל פועל למקור כוח ולהפעיל את ג'לים ב 100 V עד צבע הטעינה מגיע ג'ל הפתרון. הגדילו את המתח ל-140 V עד שצבע הטעינה יגיע לתחתית הג הפתור.

7. העברת כתמי מערבית

  1. פרק את מכשיר הג המערבי. חותכים וזורקים את ג'ל הערימה, ומשאירים את ג'ל הפענוח ללא פגע.
  2. בעדינות להעביר את ג'ל הפתרון למגש נקי מלא מאגר העברה מערבית (25 מ"מ Tris, 194 mM גליצין, 0.005% SDS, 20% מתנול) ולהשרות אותם במשך 15 דקות.
  3. להרכיב את מנגנון העברת ג'ל כדלקמן.
    1. חותכים שלושה ממברנות PVDF העברה ושש פיסות נייר מסנן (לראות את הטבלה של חומרים) על גודל ג'ל הפתרון.
    2. משרים את קרום PVDF במתנול במשך 5 דקות. מימה אותו במים עבור 5 דקות. מניחים את קרום PVDF במאגר ההעברה המערבי עד שהוא מוכן לשימוש.
    3. מניחים את מחזיק הג במגש אפייה מזכוכית ממולא באופן חלקי עם מאגר העברה מערבי, עם הצד השחור בתחתית.
    4. מניחים משטח קצף ספוג עם מאגר העברה מערבית כנגד הצד השחור של הקלטת בעל הג.
    5. להרטיב פיסת נייר סינון במאגר העברה מערבית ולמקם אותו על גבי משטח קצף. הצב את הג'ל הפתור על גבי נייר הסינון.
      הערה: מניחים את ג'ל הפענוח בכיוון הטעינה הנכון שיש להעביר לקרום PVDF.
    6. מניחים קרום העברה PVDF אחד על גבי ג'ל הפתרון. להרטיב פיסת נייר סינון עם מאגר העברה מערבית ולמקם אותו מעל קרום PVDF העברה.
    7. הצב משטח קצף נוסף שנספג עם מאגר העברה מערבי על גבי נייר הסינון. קפל בזהירות את הצד הלבן של הקלטת מחזיק ג'ל על גבי משטח קצף ספוג. נעל את הקלטת בחוזקה.
    8. מניחים את מחזיק הג לתוך ההרכבה אלקטרודה מנגנון העברה. חזור על שלבים 7.3.4-7.3.8 עבור כל ג'ל שנותר לפתרון.
    9. מלא את מיכל ההעברה באמצעות מאגר העברות מערבי. מניחים מוט מעורר. לתוך מיכל המנגנון
    10. מניחים את מיכל המנגנון על גבי צלחת מהומה. כוונן את הגדרת המהומה ל-5-6, וודא שמוט המהומה אינו תקוע או פוגע בקלטות מחזיק הג'ל.
    11. לחבר את מנגנון העברת ג'ל למקור כוח ולהעביר את הג ב 100 V עבור 1 h ב 4 ° c.

8. בלוק חיסוני

  1. הסר את הקלטת מחזיק ג'ל ומניחים את הצד השחור למטה נגד מגש האפייה זכוכית נקייה. פתח את הקלטת ובזהירות מחק את משטח הקצף ונייר הסינון. סמן פינה של קרום PVDF כדי לזהות את כיוון הטעינה הנכון. . שמור על הקרום רטוב
    הערה: קרום PVDF יכול להיות מיובש באוויר ומאוחסן במיכל נקי ואטום. מימה את הקרום מחדש על ידי שלבים חוזרים 7.3.2.
  2. מניחים את הקרום ב 100 mL של פתרון חסימה (5% חלב, 1x TBS, ו 0.1% רצף 20). לחסום את הקרום על ידי הנדנדה עדין בטמפרטורת החדר (18-20 ° c) עבור 1 h.
  3. חותכים על פני הקרום מעל 25 הסמן של חלבון kDa. מניחים את החלק העליון של קרום, המכיל להקות חלבון גדול יותר 25 kDa, בפתרון חסימה המכילה B23 העכבר מונשבטים IgG1 (1:500 דילול). בלוק הלילה, מתנדנד ב -4 ° c.
  4. מניחים את החלק התחתון של קרום, המכיל להקות חלבון קטן יותר 25 kDa, בפתרון חסימת המכיל M2 העכבר מונובטיים IgG1 (1:1000 דילול, לראות את הטבלה של חומרים). בלוק הלילה, מתנדנד ב -4 ° c.
  5. לשטוף את הממברנה 3x עבור 10 דקות ב 25 מ ל של הפתרון לשטוף המערבי (1x TBS, 0.1% הרצף 20) על פלטפורמת נדנדה.
  6. מודלת את הקרומים של עז אנטי עכבר IgG1-hrp (1:5000 דילול) מדולל בפתרון חסימת עבור 1 h בטמפרטורת החדר. לשטוף את הממברנה 3x עבור 10 דקות ב 25 מ ל של פתרון שטיפת המערבי על פלטפורמת נדנדה.
  7. הכינו את המצע המערבי. השתמש p1000 מיקרופיפטה כדי להוסיף את המצע לקרום.
  8. לפתח כל ממברנה בתוך כימונסנציה המצע המערבי עבור 5 דקות. הסר את קרום מהמצע. לקלוט מצע עודף באמצעות מגב משימה עדינה ( עיין בטבלת החומרים).
  9. מניחים את הקרום לתוך מגן סדין נקי מודבק לתוך קלטת. קחו את הקלטת לחדר חשוך והציבו דף אחד של סרט בתוך הקלטת. נעל את הקלטת במקום ואת הדגירה עבור 5 – 15 דקות. הסר את הסרט מתוך הקלטת ופתח אותו.

9. כתמים coomassie

  1. פרק את מכשיר הג המערבי. חותכים וזורקים את ג'ל הערימה, ומשאירים את ג'ל הפענוח ללא פגע. העבר בעדינות את ג'ל הפתרון למגש נקי המלא ב -25 מ ל של מים באולטרטהורים.
  2. מודקון את הג על פלטפורמת נדנדה במשך 15 דקות. השתמש בנדנוד עדין כדי למנוע את ג'ל הפתרון משבירה. להשליך את המים באולטרסאונד ולחזור על שטיפת השלב 2x יותר.
    הערה: אם בועות SDS נשארות לאחר שלבי הכביסה, ניתן לשטוף את הג במים באולטרסאונד ללילה. שרידי SDS יכולים לגרום כתמים ברקע גבוה של ג'ל.
  3. מערבבים את הכתם של Coomassie גיב על ידי היפוך הבקבוק (לראות את הטבלה של חומרים). מקום 100 mL של Coomassie הכתם מגיב כדי לכסות את הג בפתרון ומודאת ג'ל על פלטפורמת נדנדה עבור 1 h. להיפטר הכתם Coomassie לשטוף את הג במים מאוהים על פלטפורמת נדנדה עבור 15 דקות.
  4. . להיפטר מהמים האלה חזור על השלב השוטף 2x יותר. המשך לשטוף את הג עד שהרזולוציה הרצויה של להקות החלבונים נצפתה.

10. מכתים כסף

  1. פרק את מכשיר הג המערבי. חותכים וזורקים את ג'ל הערימה, ומשאירים את ג'ל הפענוח ללא פגע. העבר בעדינות את ג'ל הפתרון למגש נקי המלא ב -25 מ ל של מים באולטרטהורים.
  2. מודקון את הג על פלטפורמת נדנדה במשך 15 דקות. השתמש בנדנוד עדין כדי למנוע את ג'ל הפתרון משבירה. להשליך את המים באולטרסאונד ולחזור על שטיפת השלב 2x יותר.
    הערה: אם בועות SDS נשארות לאחר שלבי הכביסה, ניתן לשטוף את הג במים באולטרסאונד ללילה. שרידי SDS יכולים לגרום כתמים ברקע גבוה של ג'ל.
  3. תקן את ג'ל ב 30% אתנול: 10% חומצה אצטית תמיסה (6:3:1 מים: אתנול: חומצה אצטית) לילה בטמפרטורת החדר. לשטוף את ג'ל בתמיסה 10% אתנול עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. להחליף את הפתרון אתנול ולשטוף עוד 5 דקות.
  4. להכין פתרון לעבודה ברגישות מערכת כסף פירס כתם על ידי ערבוב של חלק אחד בצבע כסף רגישות עם 500 חלקים באלקטרופורזה מים (50 μl של רגישות עם 25 מ ל של מים אלקטרופורזה). מודאת ג'ל הפתרון בפתרון הרגישות לעבודה במשך 1 דקות. שטוף את הג במים באולטרסאונד במשך 1 דקות, החליפו את המים ושטוף את הג שוב במשך 1 דקות.
  5. הכנת פתרון עבודה כתם על ידי ערבוב משפר אחד של הצבע כסף עם כתמים 50 חלקים כסף (500 μL של משפר עם 25 מ ל של כתם כסף). הג הג בפתרון העבודה כתם במשך 30 דקות.
  6. הכנת פתרון עבודה מפתח על ידי ערבוב 1 חלק כסף משפר עם 50 חלקים כסף מפתח כתמים (500 μL של משפר עם 25 מ ל של מפתח). הכינו 5% חומצה אצטית תמיסה כפתרון עצור. רוחצים את הג במים באולטרה-טהורים למשך 1 דקות, מחליפים את המים ורוחצים את הג בתוספת של 1 דקות.
  7. החלף את המים עם פתרון העבודה המפתחים והדגירה עד העוצמה הרצויה של פס החלבון נפתרה (5 דקות). החלף את פתרון העבודה מפתח עם פתרון להפסיק את הדגירה עבור 10 דקות.

11. הפחתת בג, האלקילציה והעיכול של קומוקאסי-להקות ג'ל מוכתמות

  1. חותכים את להקות ג'ל מהג באמצעות להב גילוח נקי. חותכים כל להקה ג'ל לתוך כ 5 מ"מ קוביות ומניחים אותם בצינור המיקרו-מיקרוצנטריפוגה נקי 0.5 mL.
  2. להכתים את חתיכות ג'ל על ידי כיסוי אותם עם 100 mM אמוניום ביקרבונט ב 1:1 acetonitrile: מים בטמפרטורת החדר עבור 15 דקות.. להיפטר מהסופרנטאנט חזור על שלב זה.
  3. יבש את חתיכות ג'ל עבור 5 דקות בצנטריפוגה ואקום. להפחית את החלבונים על ידי כיסוי חתיכות ג'ל מיובש עם 10 מ"מ dithio, 100 מילימטר אמוניום ביקרבונט ו הדגירה אותם 1 h ב 56 ° c.
  4. . בסדר. אלאלקין החלבונים על ידי כיסוי חתיכות ג'ל עם 100 mM iodoacetamide במים, מבסת אותם עבור 1 h בטמפרטורת החדר בחושך.
  5. ולכווץ את חתיכות הג על-ידי כיסוי אותם עם מכסה ומטלטל אותם בעדינות בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. הפיפטה מחוץ לסופרנטנט ומחברת את חתיכות ג'ל על-ידי כיסוי אותם עם 100 מילימטר אמוניום ביקרבונט ולטלטל אותם בעדינות בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.
  6. חזור על שלב 11.5. יבש את חתיכות ג'ל עבור 5 דקות בצנטריפוגה ואקום.
  7. לכסות את חתיכות ג'ל עם 50 ng/μL שונה רצפי כיתה טריפסין (לראות את הטבלה של חומרים) ב 100 mM אמוניום ביקרבונט. אפשר לג להתנפח למשך 5 דקות; לאחר מכן, הפימתי את כל הפתרונות שנותרו. לכסות את חתיכות ג'ל עם 100 mM אמוניום ביקרבונט ולאפשר להם reswell לחלוטין, הוספת נוספים 100 mM אמוניום ביקרבונט כך את חתיכות ג'ל מכוסים לחלוטין.
  8. מודחה את חתיכות הג לילה ב 37 ° c. להפסיק את התגובה על ידי הוספת 1/10 של נפח של 10% חומצה פורמית במים. לאסוף את הסופרנטנט מכל צינור.
  9. לחלץ את חתיכות ג'ל על ידי כיסוי אותם עם 1% החומצה פורמית ב 60% acetonitrile ו דגירה אותם עבור 15 דקות עם טלטול עדין.
  10. הפחת את הנפח של הסופרנטטים המשולבים לפחות מ -20 μL בצנטריפוגה ואקום, תוך כדי טיפול במניעת ייבוש הסופרנטנים לחלוטין. להוסיף 1% החומצה פורמית כדי להביא את הנפח הכולל בחזרה 20 μl.

12. כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטר מסה

הערה: הדגימות נותחו באמצעות ספקטרומטר מסה המצויד במיוחד באמצעות הדיקות מסוימות, מקור ננו-ספריי וטור (ראה את טבלת החומרים). ממיסים A ו-B הם 0.1% חומצה פורמית במים ו acetonitrile, בהתאמה.

  1. לטעון את החלבונים מתעכל לתוך התאוששות גבוהה פוליפרופילן אוטומטית בבקבוקונים. העמיסו את הבקבוקונים לתוך מנהל המדגם של מערכת ה-, המערכת.
  2. הכנס 6 μL של כל דוגמה. טען כל מדגם אל עמודת ההשמנה של הננו-אריח עבור 1.5 דקות ב-8 μL/min, באמצעות 99% מממס A/1% מממס B.
  3. Elute הפפטידים לתוך ספקטרומטר מסה עם מעבר ליניארי מ 3% כדי 35% מממס B מעל 30 דקות, ואחריו הדרגתי מ 35% כדי 50% מממס B מעל 4 דקות ו 50% כדי 90% של מומס B מעל 1 דקות. לשמור על 90% acetonitrile עבור 3 דקות; לאחר מכן הפחת את ה-% B בחזרה ל-3% יותר מ-5 דקות.
  4. לרכוש חיובי פרופיל יון המסה נתונים מפרט ברזולוציה (20,000 רזולוציה) מצב. לרכוש נתונים מ 100 כדי 2,000 Da בקצב של סריקה אחת כל 0.6 s. לרכוש נתונים במצב MSE על ידי סריקות מתחלפים ללא אנרגיה התנגשות סריקות עם אנרגיה התנגשות מוגבר.
  5. עבור אנרגיה התנגשות מוגבה, כבש את האנרגיה התנגשות בתא מלכודת מ 15 V כדי 40 V. לרכוש מנעול המסה לסרוק כל 30 s, באמצעות + 2 יון של [לגלו1]-fibrinopeptide B כמסת המנעול. לרכוש קובץ נתונים באמצעות הזרקה ריקה של ממיס A, תוך שימוש באותה שיטת רכישה בין כל זוג דגימות כדי לשלוט על הנושא.

13. ניתוח נתונים לספקטרומטר מסה

  1. העתק את הקבצים המפרומטריה של תוצאות הספקטרומטר למחשב שבו פועלת פלטפורמת מחקר כמותית ואיכותית (g., פרוטטינוקס Global Server). ניתוח נתונים הוא מאוד עתיר מעבדים ויש לבצעו על מחשב נפרד בעל ביצועים גבוהים לניתוח נתונים.
  2. צור פרוייקט חדש עבור הנתונים. צור צלחת מיקרוטיטר חדשה המייצגת את הלוח האוטומטי. הקצה את הדגימות לאותו מיקום בצלחת המיקרוטיפטר כמיקום שלהם בדוגם האוטומטי.
  3. הקצה לכל אחד מפרמטרי העיבוד לדוגמה. פרמטרים לשימוש הם בעלי רוחב כרומטוגרפי אוטומטי ו-מע של רזולוציה; סף אנרגיה נמוכה, 100 ספירות; סף אנרגיה מוגבה, 5 ספירות; מסף האינטנסיביות, 500 ספירות.
  4. הקצה כל אחד מהפרמטרים של זרימת העבודה לדוגמה. פרמטרים לשימוש הם מסד נתונים, המשורשרים סוויספלרוט ו-HIV, עם רצפים הפוכים; פפטיד אוטומטי ומקטע סובלנות; יון קטעים מיני מתאים לכל פפטיד, 3; יון קטעים מיני מתאים לכל חלבון, 7; התאמות פפטיד מינימום לכל חלבון, 1; מגיב לתקציר הראשוני, טריפסין; החמיץ בקליבנים, 1; קבוע משנה ריאגנטים, carbamidomethyl C; המשתנה משתנה ריאגנטים, חמצון M; . שיעור גילוי שווא, 100
  5. בחרו בדוגמאות ובחרו ' תהליך נתונים גולמיים אחרונים'. לאחר השלמת החיפוש, בחרו בדוגמאות ובחרו ' ייצוא נתונים לגרדום ' (גרסה 3). לפתוח את הגרדום, ליצור קובץ חדש, ולייבא כל קובץ המיוצא מפלטפורמת פרוטאומניקס כמו biosample ספיק חדש באמצעות כימות יון מקודמן.
  6. כאשר כל הקבצים יובאו, המשך למסך הטעינה ולניתוח נתונים . בחר באותו מסד נתונים המשמש לחיפוש ולייבוא של נתונים באמצעות הניקוד LFDR וקיבוץ החלבונים הסטנדרטיים של הניסוי. הגדר אפשרויות תצוגה להסתברות לזיהוי חלבון, סף החלבון ל-20%, המספר המינימלי של פפטידים ל-1, ואת סף הפפטיד ל -0% במהלך הניתוח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rev-nols יחיד ומספר נקודות מוטציות ארגינין, המתאים למגוון דפוסי לוקליזציה subcellular, נבדקו ביכולתם לתקשר עם גורמים מארחים סלולריים לעומת wt rev. wt rev-3דגל pcdna-דגל וקטור הביעו ביטוי בתרבות HLfB. מכלולי חלבון עובדו מפני התאים האולטימטיביים ומוכתמים בצבע כסף מגיב. Rev-NoLS-3דגל הוא לזיהוי (כ 18 kDa) בשלושה תנאים שונים לפירוק מאגר המכיל ריכוזים שונים של היום (137 מ"מ, 200 mM, ו 300 מ"מ) באיור 1. B23 היה ניתן לגילוי (37 kDa) במאגר לפירוק המכיל ריכוז מלח נמוך (137 מ"מ, נתיבים 2 – 4)...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מנתח ספקטרומטר המסה השוואת מוטציות Rev-NoLS ו-WT Rev בנוכחות HIV-1 העריכו להבין גורמים נוקלאוולאר מעורב מחזור שכפול נגיפי. זה יזהה את רכיבי הנוקלאוולאר הדרושים לנגועים בנגיף. הנוקלאוולאר B23 יש זיקה גבוהה Rev-NoLS ופונקציות בלוקליזציה נוקלאואוליאר של Rev3 והובלה נוקלאוציטוטופלסמטי של מאוגד-HIV mrnas22. האהדה של B23 עם מוטציות Rev-nols, אשר הכיל יחיד או מספר החלפות ארגינין, הוערך דרך immunoprecipitation של Rev-3' דגל במהלך ייצור נגיפי (איור 2; W...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מכירים את ד ר ברברה ק. פלבר וד ר ג'ורג ' נ. פאוולקיס עבור התרבות החסיד של ה-HLfB שמספקת המכון הלאומי לבריאות (NIH) מחקר והתייחסות תוכנית מגיב, חטיבת האיידס, המכון הלאומי לאלרגיה וזיהומיות מחלות (NIAID), NIH. המחברים מכירים גם במקורות פיננסיים המסופקים על ידי NIH, מענקים AI042552 ו-AI029329.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חומצה אצטיתפישר כימיA38S-212
אצטוניטרילפישר כימיA955-500
אקרילאמיד: ביסקרילאמידBioRad1610158
אמוניום ביקרבונטפישר כימיקלA643-500
אמוניום פרסולפטסיגמא-אולדריץ'7727-54-0
זיקה נגד דגל M2 ג'לSigma-AldrichA2220
אנטי-דגל M2 עכבר חד שבטי IgGSigma-AldrichF3165
BioMax MS סרטCarestream8294985
Bio-Rad Protein Assay תרכיז ריאגנט צבע, 450 מ"לBio-Rad5000006
B23 עכבר חד שבטי IgGSanta Cruz Biotechnologiessc-47725
ברומופנול כחולSigma-AldrichB0126
ציפורן אבקת חלב ללא שומןנסטלהN/A
מגרד תאיםThermoFisher Scientific179693PK
C18IonKey nanoTile עמודWaters186003763
Corning 100 מ"מ TC צלחות תרבית מטופלותTC פישר סיינטיפיק08-772-22
DithiothreitolThermo ScientificJ1539714
1 x DPBSCorning21-030-CVRS
ECL Estern מצע ספיגהפירס32106
אתנול, 200 הוכחהפישר כימיA409-4
FBSGibco16000044
חומצה פורמיתפישר כימיקלA117-50
GelCode מגיב כתם כחולThermoFisher24590
גליצרולפישר כימיקל56-81-5
עז אנטי עכבר IgG-HRPסנטה קרוז ביוטכנולוגיותsc-2005
יודואצטמידACROS אורגני122270050
מגב משימות עדין KimWipeקימברלי קלארק מקצועי34120
L-גלוטמיןGibco
מתנולפישר כימי67-56-1
NanoAcuity UPLCWatersN/A
ערכת כתמי כסף פירסThermo Scientific24600df
15 מ"ל צינור חרוטי פוליפרופילןFalcon352097
סולם חלבון צבוע מראש, 10 עד 180 kDaThermo Scientific26616
קוקטייל מעכב פרוטאזRoche4693132001
Purified BSAניו אינגלנד BiolabsB9001
PVDF  ממברנה מערביתרוש3010040001
נתרן פירובטGibco11360070
10 x TBSפישר ביוריאגנטיםBP2471500
TEMEDBioRad1610880edu
Triton X-100 תמיסת דטרגנטBioRad1610407
Trizaic sourceWatersN/A
trypsin-EDTACorning25-051-CIS
Tween 20BioRad1706531
Synapt G2 ספקטרומטר מסהWatersN/A
Whatman נייר סינוןTisch Scientific10427813
25030081

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Arizala, J. A. C., et al. Nucleolar Localization of HIV-1 Rev Is Required, Yet Insufficient for Production of Infectious Viral Particles. AIDS Research and Human Retroviruses. , (2018).
  2. Li, Y. P. Protein B23 is an important human factor for the nucleolar localization of the human immunodeficiency virus protein Tat. Journal of Virology. 71, 4098-4102 (1997).
  3. Szebeni, A., et al. Nucleolar protein B23 stimulates nuclear import of the HIV-1 Rev protein and NLS-conjugated albumin. Biochemistry. 36, 3941-3949 (1997).
  4. Truant, R., Cullen, B. R. The arginine-rich domains present in human immunodeficiency virus type 1 Tat and Rev function as direct importin beta-dependent nuclear localization signals. Molecular and Cellular Biology. 19, 1210-1217 (1999).
  5. Eirin-Lopez, J. M., Frehlick, L. J., Ausio, J. Long-term evolution and functional diversification in the members of the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. Genetics. 173, 1835-1850 (2006).
  6. Frehlick, L. J., Eirin-Lopez, J. M., Ausio, J. New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. BioEssays. 29, 49-59 (2007).
  7. Okuwaki, M., Matsumoto, K., Tsujimoto, M., Nagata, K. Function of nucleophosmin/B23, a nucleolar acidic protein, as a histone chaperone. FEBS Letters. 506, 272-276 (2001).
  8. Szebeni, A., Olson, M. O. Nucleolar protein B23 has molecular chaperone activities. Protein Science. 8, 905-912 (1999).
  9. Hingorani, K., Szebeni, A., Olson, M. O. Mapping the functional domains of nucleolar protein B23. Journal of Biological Chemistry. 275, 24451-24457 (2000).
  10. Borer, R. A., Lehner, C. F., Eppenberger, H. M., Nigg, E. A. Major nucleolar proteins shuttle between nucleus and cytoplasm. Cell. 56, 379-390 (1989).
  11. Yun, J. P., et al. Nucleophosmin/B23 is a proliferate shuttle protein associated with nuclear matrix. Journal of Cellular Biochemistry. 90, 1140-1148 (2003).
  12. Savkur, R. S., Olson, M. O. Preferential cleavage in pre-ribosomal RNA byprotein B23 endoribonuclease. Nucleic Acids Research. 26, 4508-4515 (1998).
  13. Herrera, J. E., Savkur, R., Olson, M. O. The ribonuclease activity of nucleolar protein B23. Nucleic Acids Research. 23, 3974-3979 (1995).
  14. Grisendi, S., et al. Role of nucleophosmin in embryonic development and tumorigenesis. Nature. 437, 147-153 (2005).
  15. Itahana, K., et al. Tumor suppressor ARF degrades B23, a nucleolar protein involved in ribosome biogenesis and cell proliferation. Molecular Cell. 12, 1151-1164 (2003).
  16. Ye, K. Nucleophosmin/B23, a multifunctional protein that can regulate apoptosis. Cancer Biology & Therapy. 4, 918-923 (2005).
  17. Kuo, M. L., den Besten, W., Bertwistle, D., Roussel, M. F., Sherr, C. J. N-terminal polyubiquitination and degradation of the Arf tumor suppressor. Genes & Development. 18, 1862-1874 (2004).
  18. Kuo, M. L., den Besten, W., Thomas, M. C., Sherr, C. J. Arf-induced turnover of the nucleolar nucleophosmin-associated SUMO-2/3 protease Senp3. Cell Cycle. 7, 3378-3387 (2008).
  19. Horn, H. F., Vousden, K. H. Cancer: guarding the guardian. Nature. 427, 110-111 (2004).
  20. Grisendi, S., Mecucci, C., Falini, B., Pandolfi, P. P. Nucleophosmin and cancer. Nature Reviews Cancer. 6, 493-505 (2006).
  21. Dingwall, C., et al. Nucleoplasmin cDNA sequence reveals polyglutamic acid tracts and a cluster of sequences homologous to putative nuclear localization signals. The EMBO Journal. 6, 69-74 (1987).
  22. Fankhauser, C., Izaurralde, E., Adachi, Y., Wingfield, P., Laemmli, U. K. Specific complex of human immunodeficiency virus type 1 rev and nucleolar B23 proteins: dissociation by the Rev response element. Molecular and Cellular Biology. 11, 2567-2575 (1991).
  23. Valdez, B. C., et al. Identification of the nuclear and nucleolar localization signals of the protein p120. Interaction with translocation protein B23. Journal of Biological Chemistry. 269, 23776-23783 (1994).
  24. Li, Y. P., Busch, R. K., Valdez, B. C., Busch, H. C23 interacts with B23, a putative nucleolar-localization-signal-binding protein. European Journal of Biochemistry/FEBS. 237, 153-158 (1996).
  25. Adachi, Y., Copeland, T. D., Hatanaka, M., Oroszlan, S. Nucleolar targeting signal of Rex protein of human T-cell leukemia virus type I specifically binds to nucleolar shuttle protein B-23. Journal of Biological Chemistry. 268, 13930-13934 (1993).
  26. Szebeni, A., Herrera, J. E., Olson, M. O. Interaction of nucleolar protein B23 with peptides related to nuclear localization signals. Biochemistry. 34, 8037-8042 (1995).
  27. Tsuda, Y., et al. Nucleolar protein B23 interacts with Japanese encephalitis virus core protein and participates in viral replication. Microbiology and Immunology. 50, 225-234 (2006).
  28. Ning, B., Shih, C. Nucleolar localization of human hepatitis B virus capsid protein. Journal of Virology. 78, 13653-13668 (2004).
  29. Lee, S. J., Shim, H. Y., Hsieh, A., Min, J. Y., Jung, G. Hepatitis B virus core interacts with the host cell nucleolar protein, nucleophosmin 1. Journal of Microbiology. 47, 746-752 (2009).
  30. Huang, W. H., Yung, B. Y., Syu, W. J., Lee, Y. H. The nucleolar phosphoprotein B23 interacts with hepatitis delta antigens and modulates the hepatitis delta virus RNA replication. Journal of Biological Chemistry. 276, 25166-25175 (2001).
  31. Li, Y. J., Macnaughton, T., Gao, L., Lai, M. M. RNA-templated replication of hepatitis delta virus: genomic and antigenomic RNAs associate with different nuclear bodies. Journal of Virology. 80, 6478-6486 (2006).
  32. Yang, T. H., et al. Purification and characterization of nucleolin and its identification as a transcription repressor. Molecular and Cellular Biology. 14, 6068-6074 (1994).
  33. Sarek, G., et al. Nucleophosmin phosphorylation by v-cyclin-CDK6 controls KSHV latency. PLoS Pathogens. 6, 1000818(2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

HIV 1 RevRev NoLSB23 NucleophosminNucleolin C23SnoRNA C D Box 58Coomassie

מאמרים קשורים