הערכת תקין התפשטות על שניים - שלושה ממדי מסוג קולגן מצעים

רקמות החיבור בין המרכיבים תלת ממדי חלבון meshwork של הרכב הטרוגנית, מורכב בעיקר סוג אני קולגן הסיבים¹. קולגן הסיבים לשחק תפקיד מפתח בדומה לפיגום עבור תאים^1,2,3 , אינטראקציה עם חלבונים אחרים מטריצה חוץ-תאית (ECM)³. במבחנה, שונה צורות מסוג קולגן יכול לשמש בשם דיאלקטריים תרבית תאים בהתאם הטיפול בשיטה^1,2,3,4. בתנאים חומציים, מסוג קולגן שומרת על טופס סיבית⁵. ציפוי המשטח של תרבות מנות עם הטופס שאינם סיבי מקדמת תא אדהזיה והתפשטות^6,7. -פיזיולוגיים pH, טמפרטורה, סוג הקולגן מולקולות להרכיב מחדש לתוך הסיבים בצורת ג'ל אחזקת המבנה התלת-ממדי^{1,2,3,4, 5,}-^6,-^7,-⁸. ישנם כמה חשוב הבדלים בין fibril לבין צורות סיבית מסוג אני קולגן, כולל מטריקס נוקשות ועל היעילות של שחזור של רכיבי ה-ECM על ידי התאים במהלך תרבות¹. מטריצת קשיחות הוא אחד הגורמים רגולטוריות הכי נחקרות תא תרבות^{1, 9}. עם זאת, הגומלין המורכבים בין סובסטרטים התאים נשארים הבהרה. כדי לבחון את מורכבות האינטראקציות בין תאים לבין גורמים סביבתיים, מערכת פשוטה היא שימושית. השוואה של ההתנהגות הסלולר על שתי צורות שונות של קולגן עשוי לעזור כדי לפשט את השפעת גורמים סביבתיים. בהתאם, מטרת השימוש בהם, צורות שונות מסוג קולגן באופן סלקטיבי ניתן. בדרך כלל, keratinocytes נמצאים בקשר עם קרום המרתף אבל לא עם מסוג קולגן. עם זאת, במהלך ריפוי הפצע, keratinocytes לעבור רקמת חיבור עורי, להתרבות, לרפא את הפצע.¹⁰.

לאחרונה, אנחנו הראו כי ריכוז סידן חוץ-תאית חשוב עבור הפצת תקין שורת תאים באמצעות מערכת התרבות של הטופס fibril מסוג קולגן מחקה את רקמת חיבור עורי¹¹. כאשר הקו תא תקין FEPE1L-8 היה תרבותי של הטופס fibril מסוג קולגן, צורת התאים היה עגול, proliferations שלהם היו עצר של ריכוז סידן חוץ-תאית μM 30¹¹. כאשר ריכוז הסידן הוגדל ל 1.8 מ"מ, גדילת התאים היה התאושש¹¹. התאים גדל תחת שני ריכוזי סידן (30 μM ו 1.8 מ"מ) כאשר תרבותי טופס שאינם סיבי¹¹, ואילו הם היו רגישים יותר ריכוז הסידן אקסוגני כאשר תרבותי בטופס fibril. FEPE1L-8 נוצר באמצעות תרביות תאים עם וירוס הפפילומה סוג 16 הפיכת הגנים E6, E7 מן האנושי קרצינומה בצוואר הרחם, שאינם tumorigenic, לעכב את התפשטות ללא הגבלה עם פוטנציאל כמו נורמלי keratinocytes ^{מוגבלת בידול 12,13}. FEPE1L-8 תאים יכול להישמר באמצעות סוגים מסוימים של מדיום מסוים תקין, כולל סוג K110-II עם תוספת מוספים K-1 (K110)⁶. כאן, אנו מתארים פרוטוקול תרבות של הקו תא אנושי תקין-שאינו-סיבית, צורות fibril מסוג קולגן.

1. הכנת תקין תרבות בינוני

הערה: ביצוע כל ההליכים בתנאים אספטי.

1. הוסף 5 מ של פניצילין-סטרפטומיצין ואת של תוספת מוספים K-1 עד 500 מ"ל של סוג K110-II בינונית (K110) באמצעות פיפטה של 10 מ"ל.

2. הכנת fibril בצורת מסוג קולגן

הערה: לבצע הליכים עד שלב 2.6 בתנאים אספטי.

1. לשמור 10 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS (-)), יונים, קולגן, צלחת 96-ובכן תרבות ומים של צינור 2-mL ריק על קרח.
   הערה: אין להשתמש באותה הצלחת כדי להכין את fibril ואת טפסים שאינם סיבי.
2. להוסיף 1.12 מיליליטר מים יונים שפופרת ריק mL 2 באמצעות פיפטה. להוסיף 200 µL של x 10 PBS (-) המים בצינור 2 מ"ל באמצעות פיפטה של יונים. בעדינות לנער את הצינור מספר פעמים.
3. מוסיפים 0.66 מ"ל של קולגן הצינור 2 מ"ל באמצעות פיפטה. בעדינות ובמהירות ללחוץ את הצינור מספר פעמים.
   הערה: יש להימנע בועות-צורה הפתרון ככל האפשר. להכין פתרון קולגן מיד לפני השימוש.
4. יוצקים µL 100 של הפתרון קולגן מהשלב 2.3 לבאר כל צלחת 96-ובכן תרבות. בעדינות לרעוד לצלחת תרבות שמאלית תנועה ימינה.
   הערה: לכסות את המשטח כולו מן הבארות עם הפתרון קולגן. אם הפתרון אינו מכסה את כל פני השטח, להתפשט הפתרון באמצעות טיפ פיפטה. למנוע היווצרות בועה בפתרון ככל האפשר.
5. למקם את הצלחת תרבות חממה₂ CO, דגירה ב 37 ° C עבור 1 ח' הסימון gelation של קולגן ולהעביר לצלחת תרבות אל ספסל נקי.
   הערה: אשר gelation על-ידי הטיית לצלחת תרבות.
6. שופכים בעדינות µL 150 של K110 על ג'לים באמצעות פיפטה לאורך הקיר של הבאר, מקום התרבות צלחת בתוך חממה₂ CO דגירה ב 37 ° C עבור ה 1 ההעברה לצלחת תרבות ספסל נקי. לפני תרבית תאים, בעדינות למחוק את K110 באמצעות פיפטה של.
   הערה: כדי להגן על ג'לים, קצה פיפטה צריך לגעת בקיר הבאר.

3. הכנת בצורת סיבית מסוג קולגן

הערה: ביצוע כל ההליכים בתנאים אספטי.

1. להוסיף 4 µL של קולגן 1.2 מ של 1 מ מ חומצת מימן כלורי (HCl) צינור 1.5 מ"ל ומערבבים בעדינות בעזרת פיפטה.
   הערה: להכין קולגן מיד לפני השימוש. לשמור קולגן HCl מקורר עד למועד השימוש.
2. שופכים µL 100 של קולגן לתוך כל טוב של צלחת 96-ובכן תרבות באמצעות פיפטה. בעדינות לרעוד לצלחת תרבות שמאלית נכון תנועה, דגירה בטמפרטורת החדר מאובטח.
   הערה: ודא כי השטח כולו מן הבארות מכוסה פתרון.
3. לאחר הדגירה, לבטל את הפתרון קולגן, לשטוף את הבארות עם PBS (-) פעמיים באמצעות פיפטה.
4. יוצקים µL 150 של 1% שור אלבומין/PBS (-) (1% BSA) לבאר, צלחת תרבות 96-ובכן, דגירה בטמפרטורת החדר במשך ה 1 לפני תרבית תאים, למחוק את 1% BSA.
   הערה: ודא כי השטח כולו מן הבארות מכוסה פתרון.

4. התרבות של תאים FEPE1L-8

הערה: ביצוע כל ההליכים בתנאים אספטי.

1. לשמור על תאים FEPE1L-8, K110 100 מ מ תרבות מנה בחממה₂ CO ועל מודגרות-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂, כדי confluency למחצה.
2. להכין K110 טריפסין, מעכבי טריפסין באמבט מים בטמפרטורה 37 º c
3. בזהירות להסיר את המדיום של המנה תרבות, להוסיף 3 מ"ל של טריפסין 0.05% באמצעות פיפטה של, למקם את המנה חממה₂ CO, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. לאחר דגירה, לבדוק ניתוק התא מפני השטח של המנה תרבות באמצעות מיקרוסקופ שלב-ניגודיות בהגדלה x 10.
   הערה: המורפולוגיה של תאי מנותקת הופך עגול. אם תפיץ התאים, דגירה, לתקופה נוספת של 5 דקות.
4. להוסיף 3 מ"ל של מעכבי טריפסין ולאסוף בתאים שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל באמצעות פיפטה מנותקת. Centrifuge התאים שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל ב g x 200 במשך 5 דקות.
5. למחוק את תגובת שיקוע, מחדש להשעות את צניפה של K110 באמצעות פיפטה של 10 מ"ל. לספור את התאים באמצעות מיקרוסקופ שלב-ניגודיות בהגדלה x 10 והכן תא ריכוז-5.0 x 10⁴ תאים למ"ל על ידי דילול המתאים עם K110.
6. בעדינות זרע 0.1 מ"ל של K110 עם תאים בבאר בכל צלחת תרבות באמצעות פיפטה לאורך הקיר של הבאר. הכנס את הצלחת תרבות חממה₂ CO, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך הזמן המצוין (h 2, 1 יום, 3 ימים).
   הערה: כדי להגן על ג'לים, קצה פיפטה צריך לגעת בקיר הבאר.

5. אומדן של מספר התאים קיימא

1. דגירה K110 באמבט מים בטמפרטורה 37 º c מיקס 130 µL של tetrazolium מלח, 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H tetrazolium, מונוסודיום מלח (wst, מרץ-8) ו- 1.3 מ של K110 צינור 2-mL באמצעות פיפטה.
2. להעביר לצלחת תרבות ספסל נקי ולמחוק בעדינות את K110 באמצעות פיפטה של. בעדינות לשטוף תאים שאינם מחסידי K110 באמצעות פיפטה
3. הוסף µL 110 של K110 מעורבב עם wst, מרץ-8 בכל טוב באמצעות פיפטה של, למקם את הצלחת תרבות חממה₂ CO, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.
4. להעביר לצלחת תרבות ספסל נקי, לאסוף 100 µL של המדיום ממוזגים מכל קידוח, והעברתו לבאר צלחת 96-ובכן תרבות אחרת. למדוד את ספיגת באורך-גל של 450 nm (OD₄₅₀) באמצעות microplate לקורא להעריך מספר התאים קיימא.

ייצוג סכמטי של הטיפול של המשטחים של מנות תרבות באמצעות שימוש מסוג קולגן מתואר באיור1. תא מורפולוגיות נצפתה בטפסים שאינם-סיביים וקשים fibril מוצגים הפאנלים מצד שמאל ימין של איור 2, בהתאמה. FEPE1L-8 תאים היו תרבותי עבור 2 h (לוחות העליון) ו- 3 ימים (לוחות נמוכה יותר). ב- h 2 הראשונית של culturing, התאים דבקה ולהתפשט על שתי צורות של קולגן (איור 2, לוחות העליון). שלושה ימים לאחר זריעה, תאים בטופס שאינם סיבי המשיך להתפשט וסלולרי מספרם גדל (איור 2, החלונית השמאלית התחתונה). לעומת זאת, התאים בטופס fibril הראו מוגבלת מפיצים (איור 2, החלונית התחתונה נכון). FEPE1L-8 התאים המשיך להתרבות בטופס סיבית מסוג אני קולגן (איור 3, קו שחור מלא, סגור עיגולים שחורים), על המנה לא מטופלת משטחים (איור 3, מנוקד קו אפור, עיגולים אפורים סגור). לעומת זאת, תאי לא להתרבות בטופס fibril (איור 3, קו מנוקד, עיגולים פתוח). איור 2 ו- 3 איור שונו מ Fujisaki ואח '11.

איור 1 : ייצוגים סכמטי של תרבות מאכל משטחים שטופלו סוג אני קולגן. בתנאים חומציים, מסוג קולגן הספוחה הם מולקולות על פני השטח של תבשיל בצורה הלא-סיבית (החלונית הימנית). בתנאים ניטרליים ב 37 מעלות צלזיוס, מסוג קולגן מולקולות הן לתוך הסיבים ואת הספוחה על פני השטח של מנות בצורת ג'ל (לוח נכון). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2 : המורפולוגיה של תאי FEPE1L-8- תאים FEPE1L-8 K110 היו תרבותי באמצעות הטופס סיבית (10 µg/mL; לוחות שמאלה) או צורה fibril (1 מ"ג/מ"ל; לוחות הנכון) של סוג הקולגן כבר שעתיים (לוחות העליונה) או 3 ימים (לוחות נמוכה יותר). לבן מציינות 100 מיקרומטר. איור 2 שונה מ- Fujisaki et al. איור 1E – H11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3 : התפשטות תא FEPE1L. מספר התאים קיימא הוערך על גבי טופס שאינו סיביים (קו שחור מלא, מלא עיגולים שחור) או על fibril הטופס (קו מנוקד, עיגול פתוח) של מסוג קולגן, או תבשיל שאינו מטופל משטחים (קו מנוקד אפור, אפור מלא עיגולים) עבור 2 h, יום 1, ו- 3 ימים. הניסויים בוצעו ב triplicates ואת הערכים מוצגים אמצעי + SD. איור זה השתנה מ Fujisaki et al. איור 1J11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.