הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מודל הסרטן רירית הרחם אורתוטופית עם לימפדנופתיה הצפק מתוצרת ב Vivo מופץ ומתורבת VX2 תאים

8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59340

⸱

12 בספטמבר 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Medical Science, University of Toronto, 2Department of Obstetrics and Gynecology, University of Toronto, 3Guided Therapeutics Laboratory, TECHNA Institute, University Health Network, 4Department of Pathology, Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 5Department of Medical Biophysics, University of Toronto, 6Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 7Techna Institute, University Health Network, 8Department of Surgery, University of Toronto, 9Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, University of Toronto, 10Division of Gynecologic Oncology, University of Toronto /Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 11Princess Margaret Cancer Center, University Health Network

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מציג שיטה סטנדרטית לגדל תאים VX2 בתרבות וכלה ליצור מודל אורתוטופית VX2 של סרטן רירית הרחם עם הלימפה הצפק הצומת גרורות בארנבים. אורתובנושא מודלים סרטן רירית הרחם חשובים למחקר טרום קליני של הדמיה הרומן שיטות לאבחון של הלימפה הצומת גרורות.

תקציר

סרטן רירית הרחם הוא ממאירות גניקולוגיות הנפוצים ביותר בצפון אמריקה ושכיחות עולה ברחבי העולם. הטיפול מורכב מניתוח עם או בלי טיפול שפיטה תלוי במעורבות הלימפה כפי שנקבע על ידי lymphadenectomy. Lymphadenectomy הוא הליך חולני, אשר לא הוכחו יש תועלת טיפולית בחולים רבים, ולכן שיטה חדשה כדי לאבחן את הלימפה גרורות הכרחי. כדי לבדוק את סוכני הדמיה הרומן, מודל אמין של סרטן רירית הרחם עם הלימפה הצפק הצומת גרורות נדרש. מודל סרטן רירית הרחם VX2 תוארה לעתים קרובות בספרות; עם זאת, וריאציה משמעותית קיימת ביחס לשיטת המודל. יתר על כן, מחקרים לא דיווחו על השימוש בתאים VX2 תרבותי כדי ליצור מודל זה כמו רק תאים המופצות ב vivo כבר שימשו בעבר. בזאת, אנו מציגים שיטה כירורגית סטנדרטית לאחר הניתוח שיטת ניטור להקמת מודל סרטן רירית הרחם VX2 ולדווח על השימוש הראשון של תאים VX2 תרבותי כדי ליצור מודל זה.

מבוא

סרטן רירית הרחם, או סרטן הציפוי הרירית של הרחם, הוא ממאירות גניקולוגיות השני הנפוצים ביותר ברחבי העולם ואת הגידול השכיח ביותר במדינות מפותחות1. השכיחות של סרטן רירית הרחם גדל בהתמדה, עולה על ידי 2.3% בשנה בין 2005-2013 עם המקבילה 2.2% העלייה בתמותה1,2,3. האבחנה של הלימפה בצומת גרורות הוא העליונה כמו נוכחות של בלוטות לימפה חיוביות הוא מנבא שלילי חזק של הישרדות4,5,6,7 והוא יכול להנחות את הניהול של , טיפול בהאדג '8,9,10.11,12,13 הלימפה בצומת גרורות מאובחנים כיום על ידי בניתוח הסרת רקמת הלימפה על גבי כלי הדם העיקריים באגן ובבטן. הליך זה, המכונה lymphadenectomy, הוא שנוי במחלוקת עקב נתונים הישרדות סותרות משני ניסויים גדולים14,15,16,17,18 ואת הידוע סכנת התחלואה של15,19,20 ולאחר שלאחר הניתוח21,22,23. כמו הנוכחי שאינם פולשנית הדמיה שיטות אין להם את הרגישות הנדרשת ספציפיות כדי להחליף את הצומת לימפה לנתיחה24, יש כבר דחיפה לפתח טכניקות אבחון הדמיה חדשה. כדי לבדוק את הטכניקות האלה הרומן בהגדרה טרום קלינית, מודל אמין של סרטן רירית הרחם עם הלימפה הצפק הצומת גרורות נדרש.

VX2 ארנב מודל הגידול הוא מודל מבוסס היטב אשר נעשה שימוש נרחב כדי ללמוד מספר רב של האדם גידולים איברים מוצק25 כולל ריאה26, ראש וצוואר27,28, כבד29, כליה30, עצם31,32, מוח33, לבלב34 ורחם35,36,37. המודל VX2 פותחה במקור ב 1940 על ידי קיד וראוו38 על ידי שתילת בהצלחה ארנב הזנב כותנה וירוס הפפילומה שהתגלו על ידי shope ב 193339. מאז אותו זמן, המודל VX2 נשמר בvivo, המחייב מעבר טורי השריר הארבע ראשי של הארנבונים ניו זילנד לבן40. לאחרונה עם זאת, קבוצות מרובות גדלו בהצלחה VX2 תאים ב מבחנה40,41,42 והפגינו השמור השמור השמור של קו התא התרבותי31, 42,43. VX2 גידולים הם מוגדרים היסטולוגית כמו אנפלסטית תא קשקש קרצינומות44 ומכילים תכונות הבלוטות הדומות אדנוקרצינומה26. גידולים מאופיינים בקלות של השרשה, צמיחה מהירה ו-hyper-vascularity44,45 ו גרורות מהימן, הנפוץ ביותר לבלוטות לימפה אזוריות ורחוקות45. קווי דמיון של כלי דם הרחם ואנטומיה הלימפה46 , כמו גם באתר הצמיחה אורתוקרפית להבטיח כי דפוס גרורתי של ארנב VX2 קרצינומה מחקה את זה של סרטן רירית הרחם האנושי, מה שהופך את מודל VX2 מודל אמין לחקר האדם . מחלה גרורתית יתר על כן, תכונות היסטולוגית כגון התפשטות מיקרוכלי לא נורמלי47 , כמו גם אימונולוגיים48 ודמיון גנטי49,50 בין בני אדם וארנבים להציע כי הגידול מיקרוסביבה עשוי לשקף את זה של סרטן רירית הרחם האנושי.

קבוצות מרובות דיווחו על השימוש VX2 כדי ליצור מודל של סרטן רירית הרחם עם גרורות בטן עם שיעור גבוה מדווח של הצלחה36,51,52; עם זאת, וריאציה משמעותית קיימת בתוך הספרות הנוכחית עם כיבוד השיטה של יצירת מודל. תא ההשעיה מינונים נמוכה כמו 4 x 105 תאים/קרן הרחם51 ו גבוה כמו 5 x 109 תאים/הרחם קרן37,53 דווחו ללא קונצנזוס רגיל על המינון הנייד הנדרש VX2. כמו גם, מגוון של שיטות חיסונים דווחו כולל השתלת מיקרו כירורגי של הגידול לתוך myometrium הרחם36, הזרקה של VX2 cell ההשעיה37,44,52 , 53 ובמקרים מסוימים, תוספת של צופר הרחם לפני innoculation52. לבסוף, אף קבוצה לא דיווחה על השימוש בתאים VX2 מתורבתים כדי ליצור מודל זה. כך, מטרת מחקר זה היא להפגין שיטה סטנדרטית מוצלחת של יצירת מודל VX2 ולדווח על השימוש הראשון של תאים VX2 תרבותי כדי ליצור מודל של סרטן רירית הרחם עם גרורות הצפק בתוך ארנב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הסגר קיר עמוק בבטן: לזהות את קודקוד החתך הצפק ולתפוס את צפק, השריר rectus ו fascia עם מלקחיים רקמות. כל מחקרים בעלי חיים נערכו בבית משאבים בעלי חיים מרכז (ARC) אישר מתקנים של רשת הבריאות של האוניברסיטה, בהתאם לשימוש בעלי חיים ופרוטוקולים טיפול מאושר (AUP #3994/#4299). VX2 קו התא הושג מהמעבדה של ד ר Aken ברשת הבריאות של האוניברסיטה.

1. יצירה של קו VX2 מחוץ לתחום

  1. לקצור את הגידול VX2 מן השריר הארנב השרירים והגדילה באגף העכבר.
    1. ההפשרה קפואים VX2 בלוקים הגידול (1 ס מ x 1 ס מ), האוהב על צלחת התרבות באמצעות להב אזמל ולזן באמצעות פילטר יקרומטר 70 על ידי הוספת כמויות קטנות של תמיסת מלח הנקס מאוזן (hbss) ברציפות כדי להבטיח את כל התאים מתוחים עבור נפח סופי של 1 mL.
    2. ספירת תאים ולדלל עם 0.9% פוספט באגירה מלוחים פתרון לריכוז של 1 x 107/mL ומקום על הקרח בצינור סטרילי.
      הערה: בלוקים הגידול הושגו מתוך מעבדה משתף פעולה התפשטות קודמת של VX2 גידולים בשרירים הארנב הראשי.
    3. להוריד את הארנב הלבן הנשי ניו זילנד (משקל 2.5-3.5 ק ג) עם 2-5% השאיפה, להסיר את הפרווה על גבי האתר ההזרקה לטהר את האתר הזרקה עם הפתרון povidone-יוד. הכנס 500 μL של השעיית התא VX2 מוכן (5 x 106 תאים/mL) לתוך השריר הארבע-ראשי של הארנב. ניטור הארנב קלינית לגידול הגידול החל ביום 10.
    4. המתת חסד לאחר גידולים להגיע 1-1.5 ס מ בקוטר (נמדד חיצוני עם מחוגות) באמצעות שיטת וטרינר אושרה. מאשרים המתת חסד על ידי בדיקת סימנים חיוניים כולל קצב הלב וקצב הנשימה. בלו את הגידול באמצעות מכשירים סטריליים לאחר ניקוי האזור עם פתרון betadine.
    5. בארון בטיחות ביולוגי באמצעות מכשירים סטריליים, הגוף הגידול לחתיכות קטנות (0.2 ס מ) על מאכל 10 ס מ התרבות רקמה באמצעות להב אזמל. להעביר את שברי הגידול באמצעות מסננת תא 70 יקרומטר באמצעות 1 mL של hbss כפי שמתואר בשלב 1.1.1. ספירת תאים ולדלל באמצעות 0.9% תמיסת מלח להשיג 7.5 x 105 תאים ב 200 μl.
    6. באמצעות 4% isofלילה ב-1 L/min ושמירה על הרדמה באמצעות 2%. פעם עכברים מורדם, להזריק 200 μL של הפתרון משלב 1.1.5 לתוך הרקמה התת עורית של האגף העכבר באמצעות מחט למדוד 27.
  2. קצירת תאים VX2 בתוך מבחנה
    1. הצג הצמיחה של מבע קלינית פעמיים בשבוע עד גידולים להגיע 1 ס מ קוטר באמצעות מחוגות.
    2. להרוג את העכברים על ידי הצבת בחדר CO2 או ביצוע נקע בצוואר הרחם לאחר להרדים עם 4% isofלוריאן גז. גידולים בבלו בתנאים סטריליים בארון בטיחות ביולוגי.
    3. הגון גידולים עם אזמל לתוך 1-2 mm חתיכות במנה 6 ס מ התרבות רקמות המכיל 3 מ ל של מדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM)/Ham ' s F12 + 10% סרום של שור עוברי (FBS) מדיה.
    4. להשאיר שברי הגידול מופרעת בחממה 37 ° c עם 5% CO2 עבור יומיים עד התאים מתחילים לצמוח מתוך חתיכות הגידול. לאחר מכן, בדוק צלחות מתורבתות מדי יום על ידי מיקרוסקופ אור לשטף תאים. עם הגעה 70% שליטה, טריזיסיזציה של תאים על ידי הוספת 1 מ ל 0.05% טריפסין לבקבוקון והנחת בחממה 37 ° c עבור 5 דקות.
    5. לנטרל טריפסין עם 6 מ ל של DMEM/Ham ' s F12 + 10% FBS בינונית, לאסוף תאים צנטריפוגה ב 4 ° צ' עבור 5 דקות ב 300 x g. הסר supernatant ו להשעות מחדש את הגלולה ב 3.5 mL של החדש DMEM/Ham ' s F12 + 10% FBS מדיה. זרעים טריים 6 ס מ קולגן אני מצופה צלחות עם 1.6 x 106 תאים לצלחת כדי להשיג כ 50% צפיפות תא זריעת.
      הערה: 50% צפיפות התא מתייחסת לתאים הנוטלים 50% משטח המשטח של הלוח כאשר הם מחוברים.
    6. שלב מוקדם של הזדקנות: חזור על התהליך הנ ל (טריזילזציה, זריעה) עד התאים כבר מעבר 5 פעמים ולאחר מכן להעריך את קו הטוהר התאים עם ה-PCR באמצעות שיטת PCR כמותי כדי להבחין ארנבת גנומית של הארנב מ-DNA העכבר גנומית (ראה שלב 1.3.1-1.3.4).
      הערה: לאחר 8 מעברים, התאים יכולים להיות מופץ על שאינם קולגן מצופה לוחיות התרבות רקמה רגילה.
    7. מעבר, טריזיסיזציה והקפאה של תאים ב-Dמאמ/האם F12 + 30% FBS + 10% DMSO בריכוז של 2 x 106 לכל בקבוקון. אחסן תאים בחנקן נוזלי עד לצורך ניסויים.
  3. אישור מקור VX2 של תאים ששרדו:
    1. ליצור תרופה סטנדרטית מתוך העכבר גנומית מטוהרים ו-DNA ארנב (Step 1.3.2 ו Step 1.3.3). השתמש בתחל שתשמש את המינים הספציפיים למין בתוך מסגרת הקריאה הפתוחה השנייה של אלמנט הרטרוטרנספסון של קו 1.
      הערה: פריימר רצפים עבור CRPV E6 הם: 5 '-GATCCTGGACCCAACCAGTGand ו 5 '-CCTGCCGGTTCA. שימשו את האלמנטים הרטרוכימיים של קו 1 רצפים פריימר עבור הארנב-1 הם: 5 '-TCAGGAAACCCCAGAAAGTATGC ו-5 '-ברצף כגון רצפים של העכבר קו-1 הם: 5 '-AATGGAAACCTG ו-5 '-הגנה מפני שורת המידע של מדיה והכל
    2. כדי ליצור עקומה סטנדרטית עבור CRPV E6, לטהר VX2 תא הגידול ליפוסט (שלב 1.1.1) באמצעות ערכה מסחרית לאחר פרוטוקול היצרן. לכמת את הדנ א הזה באמצעות שיטת מסחרית. בצע 6 מדלל סדרתי מ 225 pg/μL עד 0.925 pg/μL במאגר מאגר האטה נמוך. כדי ליצור עיקול רגיל עבור העכבר DNA גנומית, לדלל 100 μg של מסחרי העכבר DNA גנומית במאגר נמוך EDTA-TE ב 5 לדלל מ 125 pg/μL למטה כדי 0.0125 pg/μL.
    3. מקום 4 μL מכל פתרון מדולל מדגימות משלב 1.3.2 בבארות ולהפעיל דגימות ב-PCR התרמוטרטרנר. השתמש בערכי Cq מכל הפעלה ביחד עם כמויות ה-DNA לצורך חישוב עקומה סטנדרטית באמצעות הגדרות הסף האוטומטי של התוכנה התרמוציקלורית.
    4. השתמש בנהלי qPCR סטנדרטיים כדי לבצע PCR עם 40 מחזורים של 2-step רכיבה על אופניים (98 ° c ו-60 ° c) על הציקל1. לבסס ערכי הסף, ולהגדיר ערכי דלתא Ct ב > 35 כדי להבטיח שיש זיהום עכבר מינימלי בקו VX2 הארנב. הנפח הכולל של כל תגובה היה 10 μL, המורכב 5 μL של 2x Mastermix, 1 μL של קדימה + הפוך התחל עם ריכוז פריימר הסופי בתגובה ב 250 nM, ו 4 μL של דגימת DNA.
      הערה: נא לראות הפניות54,55 לפרטים על ביצוע PCR. ערכי הסף מבוססים, וערכי דלתא Ct מוגדרים ב-> 35 כדי להבטיח שיש זיהום עכבר מינימלי בקו VX2 הארנב. הרמה המומלצת של VX2 DNA לאיתור אמין על ידי qPCR הוא 1-10 pg.

2. VX2 תרבות התאים ויצירת ההשעיה של התא

  1. הפשרת מבחנות המכילה תאים VX2 (קפוא בשלב 1.2.7) באמבט מים ב 37 ° c עבור דקה אחת ותאי העברה לצינור צנטריפוגה חרוטי עם 10 מ ל של התרבות בינונית (1:1 Dמאמ/F-12 + 10% FBS ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין). צנטריפוגה עבור 8 דקות ב 107 x g, למחוק את supernatant ולהשעות מחדש את הגלולה בתא 9 מ ל של מדיה.
  2. העבר תאים שהושעו מחדש לבקבוקון תרבות גדול. מודטה תאים מבלי לרעוד ב 37 ° c. בידקו תאים מדי יום למפגש בעזרת מיקרוסקופ קל ומחליפים מדיה תרבותית כל שלושה ימים.
  3. יצירה של הבולם הVX2 של תאים מתורבתים להזרקה
    1. טריזילזציה של תאים על-ידי הוספת 3 מ ל של 0.25% טריפסין לבקבוקון פעם בתאים הגיעו 80% המפגש. מניחים בקבוקון בחממה (37 ° c) עבור 5 דקות. העברה פתרון לצינור צנטריפוגה חרוטי ו צנטריפוגה עבור 8 דקות ב 107 x g ולאחר מכן להסיר supernatant.
    2. לשטוף את כדורי תא 3 פעמים עם 9 מ ל של פוספט מאגור מלוחים, צנטריפוגה ולהסיר supernatant כמו לעיל. לספור את התאים ולדלל עם 0.9% פוספט באגירה מלוחים פתרון לריכוז של 4 x 107 תאים/mL ומקום בצינור צנטריפוגה חרוטי סטרילי על הקרח.
  4. יצירה של בvivo מופץ VX2 תא הבולם להזרקה
    1. ההפשרה קפואים VX2 בלוקים הגידול (1 ס מ x 1 ס מ), האוהב על צלחת התרבות באמצעות להב אזמל ולהתאמץ באמצעות מסנן 70 יקרומטר כמו בשלב 1.1.1. הוסף כמויות קטנות של HBSS ברצף כדי לוודא שכל התאים מתוחים לנפח סופי של 1 mL. לספור תאים ולדלל עם 0.9% פוספט באגירה מלוחים לריכוז של 1 x107/ml ומקום על הקרח בצינור סטרילי.
      הערה: בלוקים הגידול הושגו מתוך מעבדה משתף פעולה התפשטות קודמת של VX2 גידולים בשרירים הארנב הראשי.

3. הקמת מודל כירורגי

  1. הקמת הרדמה כירורגית והכנה לפני הניתוח
    1. טרום התרופות נקבה לבן הארנבונים ניו זילנד (2.5-3.5 ק ג) 1 h לפני ההליך הכירורגי המתוכנן באמצעות זריקות של איזופרומאזין (1 מ"ג/ק"ג IM) ו מלוקסיאם (0.2 מ"ג/ק"ג). להוריד את הארנב הלבן הנשי ניו זילנד (משקל 2.5-3.5 ק ג) עם 2-5% השאיפה, להסיר את הפרווה על גבי האתר ההזרקה לטהר את האתר הזרקה עם הפתרון povidone-יוד.
    2. באמצעות מסכה מתחת למים (lma) ומאובטחת במקום עם קלטת, שמירה על הרדמה מעמיקה באמצעות הדלקת המינון של מינון איזופלוריין בין 2-5%. ניטור הרדמה כירורגית באופן סדיר במהלך ההליך על ידי בדיקת סימנים חיוניים (שיעור הנשימה, מילוי קפילר, רווית חמצן אם זמין) וניטור עבור שלטים רמז של כאב (תנועה, נסיגה מגירויים, רעשים) או אור הרדמה (תנועה, לעיסת צינור LMA).
      הערה: יש לעשות זאת על ידי אדם בעל ניסיון ניטור הרדמה כירורגית.
    3. הניחו צנתר שולי אוזן בקוטר 22 בתוך הווריד השולי. מנהל (20 מ"ג/ק"ג) באופן פנימי 10 דקות לפני חתך העור כירורגי.
    4. מחסנית שיער על האגן והבטן לפני הצבת הארנב על שולחן הניתוחים, ואז למקם ארנבים בעמדה על גבי שולחן הניתוחים. לנקות את השדה כירורגי באמצעות 3-צעד העור כירורגי ההכנה (סבון בטאדין, כלורהקאיטין פתרון, בבטאדין פתרון). לעטוף את השדה כירורגי עם וילונות לפרוטומיה לאחר הקרקע-סימון החלק העליון של עצם החיק, השארת שטח 5 ס"מ x 5 ס מ של הבטן התחתונה נחשף.
  2. יצירת החתך וזיהוי קרני הרחם
    1. . תלבש כובע ומסכת פנים לקרצף את הידיים באמצעות כלורקסדין או בטאדין הפתרון ניתוח ניתוח. שימוש בטכניקה סטרילית, לשים על שמלה סטרילית וכפפות ניתוח סטרילי.
    2. באמצעות הסכין 11-להב, לעשות 2.5 ס"מ חתך ארוך 1 ס מ הגולגולת לתוך העצם הערווה באמצעות העור הרקמה התת עורית של הבטן ארנב. מfascia את השרירים ומנתחים את שרירי הרייקי לחשיפת הצפק המשמשות כבסיס. הזן את צפק בחדות לאחר הקפדה על פני השטח הוא ברור של המעיים או איברי הבטן אחרים.
    3. לאתר את קרני הרחם המזהה את שלפוחית השתן ולטאטא אצבע כדורית האגודל, מעבר לקודקוד ולאורך הפיסגה של שלפוחית השתן.
      הערה: במידת הצורך, ניתן לרוקן את שלפוחית השתן המלאה באמצעות לחץ דיגיטלי. ממוקם פעם, להביא את קרני הרחם דרך חתך הבטן כדי לנוח על קיר הבטן.
    4. שימוש בתפר בתוספת קלועה 3-0, ביצוע תפר בודד של כל קרן רחם בקירוב 1.5-2.0 ס מ לקרוקס. הניחו את התפר האמצעי בדיוק לעורקי הרחם, הרצים לאורך ההיבט הרוחבי של כל צופר. קשור את התפרים בקלות לסגר את קרני הרחם המרוחק (איור 1).
  3. המשפט המיקומאני VX2 חיסון
    1. באמצעות מחט 27, להזריק 0.5 mL של הבולם הקודם VX2 cell הוכנו משני 2.3.2 שלב (עבור מודל VX2 תרבותי) או 2.4 (עבור במודל vivo מופץ VX2) לתוך myometrium של כל קרן רחם האבובית לאתר תפר (בין האתר תפר וצוואר הרחם). הכנס מעל 1 דקה וודא כי התאים אינם מוזרקים לתוך חלל הרחם המשמש כבסיס. בעלי חיים מורדם (2-5%) ומכונת הרדמה. עם מעגל ביין
    2. החל לחץ על אתר myometrial שפט הזרקת עבור 30 s לאחר ההזרקה כדי למזער את הדליפה של תאים. בדוק את ההזרקה ואת אתרי תפר עבור הומוקיפאון ומניחים את קרני הרחם בחזרה לתוך הבטן.
  4. סגירת החתך הכירורגי
    1. הסגר קיר עמוק בבטן: לזהות את קודקוד החתך הצפק ולתפוס את צפק, השריר rectus ו fascia עם מלקחיים רקמות.
      1. כדי לעשות זאת, עוגן את התפר בקודקוד אחד של החתך על ידי תפירה שטחי עמוק בצד אחד של החתך ועמוק לשטוליות מצד שני. . תקשור קשר באמצעות תפר המצורפת, להפוך את התפרים לרוץ בניצב לחתך דרך שכבות של קיר הבטן עובד בשלב חכם לאורך החתך מצד לצד. . תקשור את התפר ותחתוך
    2. סגירת קיר בבטן שטחית: לזהות את הקודקוד של חתך העור ותפר את עור הבטן באמצעות קבור מופעל בפועל שנספג 3-0 התפר פולי. החלת דבק כירורגי על החתך סגור כדי להתנגד לקצוות העור.
      1. כדי לעשות זאת, עוגן את התפר בקודקוד אחד של החתך, על ידי שקוע עמוק עד שטחי בצד אחד של החתך ושטחי עמוק על השני. . תקשור קשר באמצעות התפרים המצורפת, לעשות התפרים הפעלה בשכבה העורי במקביל החתך העבודה צעד חכם לאורך החתך מצד לצד. . תקשור את התפר ותחתוך
  5. טיפול שלאחר הניתוח
    1. התעוררות מן ההרדמה: לכבות את isof, לאחר החתך סגור ולתת הארנב נשימה חמצן על ידי מסכה תוך כדי ניטור סימנים של התעוררות (למשל, תנועות ספונטניות, פתיחת עיניים וללעוס תנועות על נתיב הנשימה מסכה הלוע). לאחר ששלטים אלה מצביעים ומספקים חמצן על ידי מסכה ושמיכה חמה עד שהארנבים ערניים ומסוגלים לשבת באופן עצמאי.
    2. ניטור לאחר הניתוח: ארנבים מוניטור פעמיים ביום במשך 4 ימים ויום עבור 10 ימים נוספים לאחר הפעילות. כדי לפקח, להעריך את המצב הכללי שלהם, צריכת המזון והמים, השתן והצואה פלט, הערכת הכאב, משקל, סימנים חיוניים (קצב הלב, קצב הנשימה) ואת האתר הכירורגי שלהם מחפש נפיחות, אודם, פריקה או dehiscence.
    3. שליטה בכאב לאחר הניתוח: מנהל מלוקסיאם (0.2 מ"ג/ק"ג) עבור 48 h לאחר מכן, ולאחר מכן לפי הצורך על הערכת כאב. ניהול בופרנורפין מיד אחרי הניתוח וכל 12 h (0.01-0.05 מ"ג/ק"ג) עבור 24 שעות ולאחר מכן לפי הצורך על בסיס הערכת כאב
    4. אנטיביוטיקה (enrofloxacin 5mg/ק"ג IM) עשוי להינתן מדי יום למשך שבעה ימים אחרי הניתוח כדי למנוע זיהום הפצע כפי שמומלץ על ידי הוטרינר שלך. ניהול נוזלים תת עורית (15 מ"ל של SQ) פעמיים ביום לפי הצורך עבור התייבשות ומזון רך או תוספי תזונה אחרים מסופקים מדי יום לפי הצורך לירידה במשקל.

4. הגידול ניטור הגידול

  1. ניטור קליני: ארנבים לפקח כל 2 ימים עבור סימנים קליניים של גידול הגידול החל ביום אחרי הניתוח 14. סימנים קליניים של גידול הגידול יכול לכלול צריכת אוראלי ירידה, עייפות, רכות בטן, מסה בטן ממשית ואובדן של גביע cecotrophy
  2. הדמיה וניטור פולשנית
    1. CT הדמיה: ביום שלאחר הניתוח 21-28, טרום התרופה, מורדם, ואת הארנבונים הצנרור כפי שתוארו בעבר 3.1.1-3.1.2. מיקום ארנבים בתנוחה מראש בסורק CT טרום-קליני ולקבל תמונות של האגן והבטן לאחר מתן 10 מ ל של סוכן הניגודיות של היוקסנול.
    2. ניטור כירורגי: ארנבים להעביר לחדר הניתוח לאחר הדמיה תוך עדיין תחת הרדמה כללית. מיקום, להכין ולעטוף ארנבים כפי שתוארו בעבר שלב 3.1.4 ולבצע חתך לחזור לפני הניתוח בקירוב כ 1.5 ס מ אורך דרך החתך הקודם. לזהות את הקרניים ואת הרחם לבדוק בזהירות לגידול. סגור את החתך ולספק טיפול שלאחר הניתוח כפי שמתואר קודם לכן בשלב 3.5.2-3.5.4.
    3. מודל הארנב להשתמש: אם הארנבים נמצאים יש גידולים בזמן של ניטור כירורגי, השתמש במודלים של סרטן רירית הרחם הארנב עבור ניסויים מתוכננים. שימוש בארנבים שנוצרו בתאים vivo שעברו הופץ לניסויים נוספים ב -4 שבועות פוסט-החיסון והשתמש במודלים של ארנבת שנוצרו מתאי VX2 מתורבתים ב-5-6 שבועות לאחר שלאחר החיסון כדי לזכות בגידול איטי יותר. המתת חסד לאחר גידולים להגיע 1-1.5 ס מ בקוטר (נמדד חיצוני עם מחוגות) באמצעות שיטת וטרינר אושרה. מאשרים המתת חסד על ידי בדיקת סימנים חיוניים כולל קצב הלב וקצב הנשימה. בלו את הגידול באמצעות מכשירים סטריליים לאחר ניקוי האזור עם פתרון betadine.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

עשרים ושמונה ארנבים שימשו להקמת המודל לסרטן רירית הרחם. לארנבים היה משקל ממוצע של 2.83 ק ג (2.71-3.58 ק"ג) בזמן הניסוי. גידולי הרחם גדלו בהצלחה 21 ארנבים לשיעור הצלחה כולל מודל של 75%. לפני כלילת הרחם בפרוטוקול, שיעור ההצלחה היה 57% לעומת 81% לאחר הוספה של הרחם. תפירה הרחם נוספה לפרוטוקול לאחרהארנב 7 בתגובה לשיעור הראשוני מודל נמוך הצלחה. חמישה מודלים נוצרו VX2 תאים מתורבתים (ניסיון 8 ארנבים, 63% שיעור הצלחה) ו -16 מודלים ארנב נוצרו מתוך vivo תאים שעברו בירושה (ניסיון בשנת 22, ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

להלן, אנו דיווחו על שיטה כירורגית סטנדרטית להקמת מודל סרטן רירית הרחם VX2 ודיווח על השימוש הראשון של תאים VX2 תרבותי כדי ליצור מודל זה. הגידול לקחת שיעור של 75% הוא נמוך יותר שיעור 100% אחוז שדווחו בעבר בספרות35,37,53,56; עם זאת, thw 90% שיעור של צומת לימפה מאומת פתולוגית הוא עקבי עם מחקרים קודמים של מודל זה35,53.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

מחקר זה מומן על ידי מכון טרי פוקס מחקר (PPG 1075), המכון הקנדי של מחקר הבריאות (קרן גרנט #154326), המכון הקנדי לחקר החברה לסרטן (704718), מדעי הטבע והמועצה לחקר ההנדסה של קנדה, קרן сanada לחדשנות והנסיכה מרגרט סרטן קרן.

אני רוצה להודות ד ר מרגרט Akens על מתן תאים VX2 הראשונית להקמת הדגם הראשוני VX2 ובלוקים הגידול הקפואים VX2. אני רוצה להודות מרקו דיגראפה על סיוע לבצע ניסויים הראשונית VX2 התרבות התא לילי דינג לעזור עם תרבות VX2 תאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אזמל 11 להבים, סטרילי, חד פעמיאספן כירורגי (VWR)80094-086
קטטר וריד אוזן 22-gagueCDMV14332
3-0 תפר פולי-נימה נספג (Polysorb)Covidien356718
3-0 תפר נספג קלוע (Polysorb)Covidien356718
מסננת תאים 70uM, עטוף בנפרד, ניילוןFalcon352350
אצפרומזין (Atravet)CDMV1047
סבון בטדין (פוביודון יוד 7.5%)CDMV4363
תמיסת בטדין (יוד פוביודון 10%)חנויות UHN457955
בופרנורפיןאוניברסיטת מקגיל
CefazolinUHN בית מרקחת באשפוזאין צורך בחתול #
תמיסת כלורהקסידיןCDMV119872
Corning BioCoatCellware, קולגן סוג I, כלים 100 מ"מקורנינג354450מותג לא חשוב
Corning BioCoatCellware, קולגן סוג I, צלחות 24 בארותקורנינג354408מותג לא חשוב
Corning BioCoatCellware, קולגן סוג I, צלחות 6 בארותקורנינג354400מותג לא חשוב
קורנינג מטריג'ל מטריצת ממברנת מרתף, *ללא LDEV, 10 מ"לקורנינג354234
DMEM/HAM F12 1:1Life Technologies11320מותג לא חשוב
DMSOCaledon Lab Chem1/10/4100
Enrofloxacin (הזרקת Baytril)CDMV11242
Falcon TubeCorning Centri-Star430828
סרום בקר עוברי, מוסמך, ממקור קנדי, 500 מ"לLife Technologies12483020מותג/מקור לא חשוב
IsofluraneUHN בית מרקחת באשפוזNo Cat # Needed
Isohexol contrastGE Healthcare407141210
Meloxicam (Metacam 0.5%)CDMV104674
מלח רגיל(UofT Medstore)1011
PBSMulticell או Sigma331-010-CL או D8537-500mL
פניצילין/סטרפטומיצין (100 מ"ל; 10000U פניצילין, 10000ug סטרפטומיצין)Corning-CellgroCA45000-652
תמיסת מלח מאוזנת סטרילית של הנקס (-Ca++, -Mg++, -Phenol Red)T.C.M.F (ד"ר בריסטו)28-Jan-11
דבק כירורגי (דבק רקמות)3M Vetbond14695B
טריפסין (0.25%), פרוטאומיקה כיתהסיגמאT-6567-5X20UG
טריפסין-EDTA, 0.05%, 100 מ"לWisent Inc325-542-ELהמותג לא חשוב
מותג בית

מקורות

  1. Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: Sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. International Journal of Cancer. 136, E359-E386 (2015).
  2. Canada, S. Canadian Cancer Statistics Special topic: Pancreatic cancer. , (2017).
  3. Siegel, R. Cáncer Statistics. Cáncer Journal. 67, 7-30 (2017).
  4. Creasman, W. T., et al. Surgical pathologic spread patterns of endometrial cancer. A Gynecologic Oncology Group Study. Cancer. 60, 2035-2041 (1987).
  5. Morrow, C. P., et al. Relationship between surgical-pathological risk factors and outcome in clinical stage I and II carcinoma of the endometrium: A gynecologic oncology group study. Gynecologic Oncology. 40, 55-65 (1991).
  6. Hicks, M., et al. The National Cancer Data Base report on Endometrial carcinoma in African-American women. Cancer. 83, 2629-2637 (1998).
  7. Barrena Medel, N. I., et al. Comparison of the prognostic significance of uterine factors and nodal status for endometrial cancer. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 204, 1-7 (2011).
  8. Randall, M. E., et al. Randomized phase III trial of whole-abdominal irradiation versus doxorubicin and cisplatin chemotherapy in advanced endometrial carcinoma: A gynecologic oncology group study. Journal of Clinical Oncology. 24, 36-44 (2006).
  9. Galaal, K., Al Moundhri, M., Bryant, A., Lopes, A. D., Lawrie, T. A. Adjuvant chemotherapy for advanced endometrial cancer. Cochrane Database of Systematic Reviews. 2014, 2-4 (2014).
  10. Orr, J. W., Holimon, J. L., Orr, P. F. Stage I corpus cancer: is teletherapy necessary? American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176, discussion 788-789 777-788 (1997).
  11. Ng, T. Y., Perrin, L. C., Nicklin, J. L., Cheuk, R., Crandon, A. J. Local recurrence in high-risk node-negative stage I endometrial carcinoma treated with postoperative vaginal vault brachytherapy. Gynecologic Oncology. 79, 490-494 (2000).
  12. Mohan, D. S., et al. Long-term outcomes of therapeutic pelvic lymphadenectomy for stage I endometrial adenocarcinoma. Gynecologic Oncology. 70, 165-171 (1998).
  13. Straughn, J. M., et al. Stage IC adenocarcinoma of the endometrium: Survival comparisons of surgically staged patients with and without adjuvant radiation therapy. Gynecologic Oncology. 89, 295-300 (2003).
  14. Panici, P. B., et al. Systematic pelvic lymphadenectomy vs no lymphadenectomy in early-stage endometrial carcinoma: Randomized clinical trial. Journal of the National Cancer Institute. 100, 1707-1716 (2008).
  15. ASTEC study group,, et al. Efficacy of systematic pelvic lymphadenectomy in endometrial cancer (MRC ASTEC trial): a randomised study. The Lancet. 373, 125-126 (2009).
  16. Kilgore, L., et al. Adenocarcinoma of the Endometrium: Survival comparisons of patients with and without pelvic node sampling. Gynecologic Oncology. 56, 29-33 (1995).
  17. Trimble, E. L., Kosary, C., Park, R. C. Lymph node sampling and survival in endometrial cancer. Gynecologic Oncology. 71, 340-343 (1998).
  18. Chan, J. K., et al. The outcomes of 27,063 women with unstaged endometrioid uterine cancer. Gynecologic Oncology. 106, 282-288 (2007).
  19. Cragun, J. M., et al. Retrospective analysis of selective lymphadenectomy in apparent early-stage endometrial cancer. Journal of Clinical Oncology. 23, 3668-3675 (2005).
  20. Piovano, E., et al. Complications after the treatment of endometrial cancer: A prospective study using the French-Italian glossary. International Journal of Gynecological Cancer. 24, 418-426 (2014).
  21. Abu-Rustum, N. R., et al. The incidence of symptomatic lower-extremity lymphedema following treatment of uterine corpus malignancies: A 12-year experience at Memorial Sloan-Kettering Cancer Center. Gynecologic Oncology. , 714-718 (2006).
  22. Todo, Y., et al. Risk factors for postoperative lower-extremity lymphedema in endometrial cancer survivors who had treatment including lymphadenectomy. Gynecologic Oncology. 119, 60-64 (2010).
  23. Beesley, V., Janda, M., Eakin, E., Obermair, A., Battistutta, D. Lymphedema after gynecological cancer treatment: Prevalence, correlates, and supportive care needs. Cancer. 109, 2607-2614 (2007).
  24. Haldorsen, I. S., Salvesen, H. B. What Is the Best Preoperative Imaging for Endometrial Cancer? Current Oncology Reports. 18, 1-11 (2016).
  25. Aravalli, R., Cressman, E. Relevance of Rabbit VX2 Tumor Model for Studies on Human Hepatocellular Carcinoma: A MicroRNA-Based Study. Journal of Clinical Medicine. 4, 1989-1997 (2015).
  26. Kreuter, K. A., et al. Development of a rabbit pleural cancer model by using VX2 tumors. Comparative Medicine. 58, 287-293 (2008).
  27. Li, S., Ren, G., Jin, W., Guo, W. Establishment and characterization of a rabbit oral squamous cell carcinoma cell line as a model for in vivo studies. Oral Oncology. 47, 39-44 (2011).
  28. Muhanna, N., et al. Multimodal Nanoparticle for Primary Tumor Delineation and Lymphatic Metastasis Mapping in a Head-and-Neck Cancer Rabbit Model. Advanced Healthcare Materials. 4, 2164-2169 (2015).
  29. Tong, H., Duan, L., Zhou, H., Feng, S. Modification of the method to establish a hepatic VX2 carcinoma model in rabbits. Oncology Letters. 15, 22-23 (2018).
  30. Bimonte, S., et al. Induction of VX2 para-renal carcinoma in rabbits: generation of animal model for loco-regional treatments of solid tumors. Infectious Agents and Cancer. 11, 1-8 (2016).
  31. Handal, J. A., et al. Creation of rabbit bone and soft tissue tumor using cultured VX2 cells. Journal of Surgical Research. 179, e127-e132 (2013).
  32. Pezeshki, P. S., et al. Bone targeted bipolar cooled radiofrequency ablation in a VX-2 rabbit femoral carcinoma model. Clinical and Experimental Metastasis. 32, 279-288 (2015).
  33. Wang, Y., et al. Magnetic resonance imaging-navigated argon-helium cryoablation therapy against a rabbit VX2 brain tumor. Experimental and Therapeutic. 9, 2229-2234 (2015).
  34. Zhang, W., et al. Laparotomy cryoablation in rabbit VX2 pancreatic carcinoma. Pancreas. 46, 288-295 (2017).
  35. Xu, L. -Q., Huang, Y. -W., Luo, R. -Z., Zhang, Y. -N. Establishment of the retroperitoneal lymph node metastasis model of endometrial VX2 carcinoma in rabbits and observation of its metastatic features. World Journal of Surgical Oncology. 13, 109(2015).
  36. Duan, P., Lü, J. Q., Tu, Q. M., Yu, Z. K. Magnetic resonance evaluation of transplanted endometrial carcinoma and its lymph node metastasis in rabbits. Chinese Journal of Cancer Research. 19, 201-205 (2007).
  37. Huang, Y. -W., et al. VEGF-c expression in an in vivo model of orthotopic endometrial cancer and retroperitoneal lymph node metastasis. Reproductive Biology and Endocrinology. 11, 49(2013).
  38. Kidd, J. G., Rous, P. A transplantable rabbit carcinoma originating in a virus-induced papilloma and containing the virus in masked or altered form. J Exp Med. 71 (6), 813-838 (1940).
  39. Shope, B. R. E., Hurst, B. E. W. Infectious papillomatosis of rabbits. , (1933).
  40. Galasko, C. S. B., Haynes, D. W. Survival of VX2 carcinoma cells in vitro. European Journal of Cancer. 12 (1965), 1025-1026 (1965).
  41. Osato, B. Y. T., Ito, Y. In vitro Cultivation And Immunofluorescent Studies Of Transplantable Carcinomas Vx2 And Vx7. , Laboratory of Viral Oncology, Research Institute, Aichi Cancer Center. Nagoya, Japan. (1967).
  42. Easty, D. M., Easty, G. C. Establishment of an in vitro cell line from the rabbit VX2 carcinoma. Virchows Archiv B Cell Pathology Including Molecular Pathology. 39, 333-337 (1982).
  43. Liu, X., et al. Establishment and characterization of a rabbit tumor cell line VX2. Zhonghua bing li xue za zhi Chinese Journal of Pathology. 34, 661-663 (2005).
  44. Parvinian, A., Casadaban, L. C., Gaba, R. C. Development, growth, propagation, and angiographic utilization of the rabbit VX2 model of liver cancer: a pictorial primer and “how to” guide. Diagnostic and Interventional Radiology. 20, 335-340 (2014).
  45. Pascale, F., et al. Modified model of VX2 tumor overexpressing vascular endothelial growth factor. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 23, 809-817 (2012).
  46. Oshiro, H. The role of the lymphatic system in rabbit models for cancer metastasis research a perspective from comparative anatomy. Okajimas Folia Anatomica Japonica. , 6-7 (2014).
  47. Guan, L., Xu, G. Destructive effect of HIFU on rabbit embedded endometrial carcinoma tissues and their vascularities. Oncotarget. 8, 19577-19591 (2017).
  48. Oshiro, H., et al. Establishment of successively transplantable rabbit VX2 cancer cells that express enhanced green fluorescent protein. Medical Molecular Morphology. 48, 13-23 (2015).
  49. Graur, D., Duret, L., Gouyt, M. Phylogenetic position of the order Lagomorpha (rabbits, hares and allies). Nature. 379, 333-335 (1996).
  50. Bõsze, Z., Houdebine, L. M. Application of rabbits in biomedical research: A review. World Rabbit Science. 14, 1-14 (2006).
  51. Kyotani, S., et al. A study of cis-diamminedichloroplatinum(II) suppositories for the treatment of rabbit uterine endometrial carcinoma. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 16, 55-58 (1993).
  52. Harima, Y., Harima, K., Hasegawa, T., Shikata, N., Tanaka, Y. Histopathological changes in rabbit uterus carcinoma alter transcatheter arterial embolization using cisplatin. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 38, 317-322 (1996).
  53. Huang, Y. W., et al. Tumor-induced VEGF-C overexpression in retroperitoneal lymph nodes in VX2 carcinoma-bearing rabbits. Drug Design, Development and Therapy. 9, 5949-5956 (2015).
  54. Bio-Rad. Real-Time PCR Applications Guide. , Bulletin 5279 (2006).
  55. Taylor, S., et al. A practical approach to RT-qPCR—publishing data that conform to the MIQE guidelines. BioRad Bulletin. , 5859(2009).
  56. Rhee, T. K., et al. Rabbit VX2 Tumors as an Animal Model of Uterine Fibroids and for Uterine Artery Embolization. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 18, 411-418 (2007).
  57. Takahashi, K., et al. Development of a mouse model for lymph node metastasis with endometrial cancer. Cancer Science. 102, 2272-2277 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

VX2In Vivo
מודל הסרטן רירית הרחם אורתוטופית עם לימפדנופתיה הצפק מתוצרת ב Vivo מופץ ומתורבת VX2 תאים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.