מודל תלת מימד וצינור חישוב מתורבת לכמת את הפוטנציאל הוושלתי של iPSC-נגזר של התגובה האנטי-מגנטית

סיכום

הושלתי האנדותל שנגזר מתאי גזע המושרה ביותר (iPSC-EPs) יש את הפוטנציאל לחולל מהפכה לטיפולי מחלות לב וכלי דם ולאפשר יצירת מודלים נאמנים יותר של מחלות לב וכלי דם. בזאת, כימוס של iPSC-EPs בתלת מימדי (3D) קולגן מיקרוסביבה וניתוח כמותי של הפוטנציאל הגלום בתאים אלה מתוארים.

תקציר

המושרה בתאי גזע פלוריטי (iPSCs) הם מקור ספציפי למטופל, תא שהתרבות שיכול להבדיל לכל סוג תא הסומטית. ביופוטנאל ושלתי (EPs), אשר יכול להבדיל בין סוגי התאים הדרושים כדי להרכיב בוגרת, פונקציונלית ולבלטורה, נגזר הן העובריים והמושרה תאים גזע pluripotent עם זאת, תאים אלה לא הוערכו בקפדנות בסביבות תלת ממדיות, ואת המדד הכמותי של הפוטנציאל הvas, שלהם נשאר חמקמק. כאן, הדור והבידוד של iPSC-EPs באמצעות מיון התא מופעל פלורסנט מתוארים תחילה, ואחריו תיאור של עטיפת ותרבות של iPSC-EPs ב קולגן הידרוג. מטריצה זו (ECM)-מחקה המיקרו-סביבה מעודדת תגובה חזקה ומרכזית; ליצור רשתות כלי דם לאחר שבוע של תרבות. יצירת צינור חישובית העושה שהוא משתמש בתוכנה מקור פתוח כדי לכמת את התגובה הזאת הוא התחום. צינור זה נועד במיוחד כדי לשמר את ארכיטקטורת 3d של מקלעת נימי כדי מכבש לזהות את מספר הענפים, נקודות הסתעפות, ואת אורך הרשת הכולל עם קלט משתמש מינימלי.

מבוא

וריד הטבור האנושי בתאי הטבורי (HUVECs) וסוגים אחרים של תאים אנדותל הראשי כבר מנוצל במשך שני עשורים לדגמן כלי דם לבלוב ופיתוח בתוך מבחנה¹. פלטפורמות כלי דם כאלה להבטיח להאיר מולקולרית ברמת רקמות מנגנונים של מחלות לב וכלי דם והוא עשוי להציג תובנה פיזיולוגית לתוך פיתוח של רשתות כלי דם פרימיטיביים^2,3. למרות שהשדה של מידול כלי הדם הגיע עד להתקדמות משמעותית, שיטת "תקן זהב" שיכולה לכמת את המודל ולהעריך את ההתפתחות הפיזיולוגית של כלי הדם, נותרה חמקנית. רוב הפרוטוקולים שפורסמו אינם מתפקדים כראוי את הנישה של כלי הדם כדי לעודד היווצרות של כלי דם בוגרים ופונקציונליים או שיטה להשוות את הפוטנציאל הגלום בסוגי התאים המוערך בשלושה מימדים ( 3D).

מודלים רבים של כלי הדם הנוכחיים מוגבלים ביכולתם לחקות את הנישה הפיזיולוגית של כלי הדם. אחד הנפוצים ביותר בפלטפורמות מבחנה הוא חלבון ז'לטין מבוססי תערובת היווצרות שפופרת. בקצרה, HUVECs הם הזרע כמו תאים בודדים על שכבה דקה של ג'ל המורכב של חלבונים שנקטפו מתוך מיטין סרקומה מורתתאי (ECM); בתוך אחד עד יומיים, HUVECs להרכיב את עצמו לתוך צינורות פרימיטיביים⁴. עם זאת, תהליך זה מתרחש בשני מימדים (2D) ובתאי האנדותל (ECs) הנמצאים בשימוש באותו שיטת הפעולה אינם יוצרים מוקפים, חלולים לומן, ובכך מגבילים את המשמעות הפיזיולוגית של מחקרים אלה. לאחרונה, ECs ותאים תומכים (g., תאי גזע mesenchymal (MSCs) ו קרום הלב) כבר שיתוף תרבותי במיקרו מיקרוסביבות 3D המדמים את הארכיטקטורה הסיבי של ECS יליד, כגון קולגן או פיברוב הידרוג'ל⁵. כדי לדגמן פיתוח כלי דם מיקרוסביבה זו, חרוזים פולימריים מצופה ECs מועסקים בדרך כלל⁶. התוספת של גורמי צמיחה אקסוגני ו/או גורמי גדילה מופרש על ידי תאים אחרים interstitially מוטבע הידרוג'ל יכול לגרום ECs, ציפוי חרוזים פולימריים, כדי נבט וטופס לומן יחיד; המספר והקוטר של נבטים והכלים יכולים להיות מחושבים. עם זאת, נבטים אלה הם באופן ייחודי ולא יוצרים רשת סגורה, מחובר כפי שהוא נראה בתנאים פיסיולוגיים ולכן הוא מזכיר יותר מודל הגידול של המודל. התקנים מיקרופלואידים מנוצלים גם כדי לחקות את נישה כלי הדם ולקדם את היווצרות ואצלב ב-EC-לאדן הידרוג'ל^7,8. בדרך כלל, גורם גידול אנגיוגנטי-מעבר הדרגתי מוחל על בינונית תרבות התא מחזורי כדי לגרום הגירה EC ולבלוב. ECs המהווים לומן של כלי מפותח רגישים למתח ההטיה הנגרמת על ידי יישום של זרימת הנוזלים דרך המכשיר microfluidic; לכן, מכשירים אלה microflu, התקנים מיקרופלואידים ללכוד פרמטרים פיזיולוגיים מפתח כי הם לא נגישים במודלים סטטיים. עם זאת, התקנים אלה דורשים יכולות מיקרו-ייצור יקרות.

והכי חשוב, כל שלושת מודלים כלי הדם (2D, 3D, microfluidic) להשתמש באופן גורף ECs הראשי, כמו גם הראשי התומך בסוגי תאים. לא ניתן לפתח תאים ראשוניים לטיפול קרדיווסקולרי אפקטיבי, כי התאים היו לעורר תגובה חיסונית על השרשה; יתר על כן, HUVECs וסוג התאים הראשוניים דומים אינם מסוימים המטופל ולא ללכוד חריגות כלי הדם המתרחשים בחולים עם מתכונת גנטית או מראש קיים תנאי הבריאות, למשל, סוכרת. המושרה בתאי גזע פלאוריטי (iPSCs) התפתחה בעשור האחרון כמו מקור מטופל ספציפי, המקור התא מתרבים כי ניתן לבדיל את כל התאים הסומטיים בגוף האדם⁹. בפרט, הפרוטוקולים פורסמו כי המתאר את הדור והבידוד של iPSC הנגזר ושלתי (iPSC-EPs)^10,11; iPSC-EPs הם בעלי עוצמה והוא יכול, ולכן, להיות מובחנת עוד לתוך תאים אנדותל ותאי שריר חלקה/קרום הלב, אבני הבניין של בוגרת, פונקציונלי תפקודית. רק מחקר אחד יש מפורט משכנעת את הפיתוח של מקלעת נימי העיקרי מ-iPSC-EPs ב מיקרוסביבה 3D¹²; למרות שמחקר זה הוא קריטי להבנת ההרכבה iPSC-EP ובידול טבעי וסינתטי הידרוג, זה לא להשוות את טופולוגיות הרשת של המערכת המתקבלת. עוד מחקר שנערך לאחרונה השתמש במודל חרוז פולימרי כדי להשוות את הנביטה של HUVECs ו-iPSC-נגזר ECs⁵. לכן, יש צורך ברור נוסף להבהיר את מנגנוני האיתות הפיזיים והכימיים לווסת iPSC-EP vasculogenesis בסביבות מיקרו 3D וכדי לקבוע אם תאים אלה מתאימים לטיפול איסכמי ומחלות לב וכלי דם דוגמנות.

בעשור האחרון, קווים שונים של מקור פתוח ואלגוריתמים השלד הינם מפותחים לכמת ולהשוות את אורך הרשת והקישוריות של כלי הדם. לדוגמה, charwat ואח ' פיתח צינור מבוסס פוטושופ כדי לחלץ תמונה מסוננת, בינארית של רשתות כלי דם נגזר תרבות שיתוף של תאי גזע נגזר של אדיפוז ו-ecs הצמיחה של מטריצה הפיטין^13,14. אולי הכלי הנפוץ ביותר להשוואת הטופולוגיה הוא אנגיוtool, תוכנית שפורסמה באינטרנט על ידי המכון הלאומי לסרטן¹⁵; למרות אימוץ נרחב של התוכנית נאמנות מתועדת היטב, התוכנית מוגבלת לניתוח מבנים כמו כלי בשני ממדים ותוכניות אחרות, כולל AngioSys ו Wimasis, לשתף את אותה הגבלה מימדי¹⁶. חבילות תוכנה רבות עוצמה כגון Imaris אריס, לוסיא והתמרה פותחו כדי לנתח את טופולוגיית הרשת של מיקרובילטורה מהונדסים; עם זאת, סוויטות אלה הן מעלות עבור מעבדות אקדמיות ביותר ולהגביל את הגישה לקוד המקור, אשר עשוי לעכב את היכולת של משתמש הקצה להתאים את האלגוריתם ליישום הספציפי שלהם. 3D מבצעה, מקור פתוח דימות תהודה מגנטית/חבילת טומוגרפיה ממוחשבת, מכיל ערכת מידול כלי דם שיכול לנתח ביעילות את הטופולוגיה של רשתות 3D כלי דם¹⁷; עם זאת, הניתוח תלוי במשתמש מציב ידנית את נקודות הקצה של הרשת, דבר העלול להיות מייגע בעת ניתוח ערכת נתונים גדולה ויכול להיות מושפע מהטיות התת-מודע של המשתמש. בכתב יד זה, צינור חישובית שיכול לכמת רשתות כלי דם 3D מתואר בפרוטרוט. כדי להתגבר על מגבלות הנ ל, זה צינור בחישוב מקור פתוח מנצל ImageJ כדי לעבד מראש התמונות מיקוד רכשה לטעון את נפח 3D לתוך מנתח שלד. מנתח השלד משתמש באלגוריתם מקביל של ציר דליל, והוא פותח במקור על ידי קרשניצקי ואח '. כדי לנתח את האורך והקישוריות של רשתות אוסטאופציט¹⁸; אלגוריתם זה ניתן להחיל באופן יעיל כדי לאפיין את האורך ואת הקישוריות של מיקרוקולטורה הנדסה.

בסך הכל, פרוטוקול זה מתאר את היצירה של רשתות microvascular מיקרונימי בסביבות תלת-ממד, ומספק צינור חישוב מקור פתוח ומשתמש-הטיה בחינם כדי להשוות את הפוטנציאל vasculogenic של iPSC-EPs.

פרוטוקול

1. הכנת מדיה תרבותית ופתרונות ציפויים

1. כדי להכין הפתרון ציפוי vitronectin, לדלל vitronectin 1:100 ב מלוחים פוספט באגירה של Dulbecco (DPBS).
   התראה: לאחר דילול, לא מומלץ לאחסן פתרון זה לשימוש עתידי.
2. עם קבלת פנול חינם אדום, גורם גדילה-מופחת תערובת חלבון ז'לטין (ראה שולחן חומרים) מהיצרן, להפשיר על קרח ב 4 ° צ' עד התערובת היא שקופה ונוזלית. שמירה על התערובת על קרח במכסה זרם למינארי, פיפטה 75 μL של התערובת לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה של 1.8 mL ולהקפיא ב-20 ° c מיד. ניתן לאחסן את הבליטים האלה עד לשנה אחת.
   התראה: תערובת חלבון הלטין הופכת לצמיגה מאוד כאשר היא נשמרת בטמפרטורת החדר וממשיכה להיות מועלת בטמפרטורות גבוהות יותר. . שמור על הפתרון הזה קפוא
3. כדי להכין את התערובת הזאת לציפוי, הפשרת 75 μl סדרת מחלקים על קרח ולדלל עם 6 מ ל של מדיום נשר שונה של הקרח קר מאוד בינונית: תערובת מזינים F-12 (dמאמ/F12). הכרך המוכן הזה מספיק. כדי לחלוק צלחת 12 היטב
4. הכנת מלאי 100 mg/mL של חומצה אסקורבית מגנזיום-2-פוספט (אבקה לבנה הלבן) ב-אלקטרופורזה מים על ידי הוספת 500 mg של אבקה ל 5 מ ל של מים ב 10 ml זכוכית בקבוקון. מתפרעים עם בר מהומה עד הפתרון הוא שקוף לחלוטין (זה עשוי להימשך עד שעה). ניתן לאחסן פתרון זה ב-20 ° צ' עד לשנה אחת.
5. צור 10 מ"מ מלאי של CHIR99021 (CHIR) על ידי המסת 10 מ"ג של אבקת ליאופהדיה ב 1.9928 mL של diמתיל סולפוקסיד (DMSO) בתוך 15 מ"ל שפופרת הצנטריפוגה של 1 מ ל וחמים ב 37 מעלות צלזיוס (או מים) אמבט עד הפתרון הוא שקוף. מחלקים לצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.8 mL ומאחסנים ב-20 ° צ' עד לשנה אחת.
6. צור 10 מ"מ מלאי של Y-27632, מעכב סלע (ROCKi), על ידי המסת 10 מ ג אבקה של ליאופהדיה ב 3.1225 mL של diמתיל סולפוקסיד (DMSO) ב 15 מ"ל שפופרת הצנטריפוגה ו חם ב 37 מעלות צלזיוס (או מים) אמבטיה עד הפתרון הוא שקוף. מחלקים לצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.8 mL ומאחסנים ב-20 ° צ' עד לשנה אחת.
7. כדי להכין Essential 8 (E8) בינונית, להפשיר תוספי מקפיא, להוסיף את הבקבוק 500 mL של בינונית בסיס, מסנן לעקר. ניתן לאחסן פתרון זה ב -4 ° c עד שבועיים.
   התראה: חשוב מאוד לא לחמם את המדיום בשעה 37 ° c, כאשר החלבונים בניסוח הבינוני עלולים להיפגם עם שימוש ממושך. במקום זאת, שמור את המדיום בטמפרטורת החדר במשך 15 עד 30 דקות לפני השימוש.
8. כדי להכין את מאגר מיון, להוסיף 1.33 mL של 7.5% בסרום שור חלבון אלבומין (BSA) ב DPBS ו 200 μL של 0.5 מ"מ חומצה ethylenediams (EDTA) כדי 48.5 mL של DPBS ליצור פתרון סופי של 0.5% BSA ו 2 מ"מ EDTA.
9. כדי להכין LaSR בסיס, להוסיף 300 μL של 100 mg/מ"ל חומצה אסקורבית מגנזיום-2-פוספט ו 5 מ ל של גלוטמקס ל 500 מ ל מתקדם Dמאמ/F12. ניתן לאחסן פתרון זה ב-4 ° צ' עד חודש אחד.
10. כדי להכין את הצמיחה של תאים אנדותל בינונית-2 (EGM-2), הפשרת תוספי תזונה והוסף לבקבוק 500 mL של המדיום הבזאלי. ניתן לאחסן פתרון זה ב-4 ° צ' עד חודש אחד.
11. כדי להכין את מאגר חסימת, להוסיף 500 mg של סרום ליאופד בנסיוב הפרה (BSA) ו 50 μL של אמולסיה מגיב (ראה טבלת חומרים) ל 48 ML של dpbs. מודקון ב 37 ° c עבור לפחות 15 דקות כדי להבטיח כי BSA לא לקבץ ולאחר מכן נפרד מהפתרון.

2. הפשרה, אחזקה, והפסקתו של iPSCs

1. לפני הקפאת הקריובית בקבוקון iPSC שמור, מעיל באר אחת של 6-היטב צלחת עם 1 מ ל של פתרון vitronectin (מוכן כמתואר בשלב 1.1). . מבית המלון בטמפרטורת החדר אל תתנו זה ציפוי אוויר יבש לפני הוספת E8 בינוני לצלחת.
2. כדי להפשיר iPSCs, לשחזר בקבוקון cryopreserved של iPSCs מתוך המיכל הנוזלי שלה אחסון חנקן ולהפשיר ב 37 ° c עד גביש קטן של קרח נשאר. בזהירות (dropwise) להעביר את התוכן של הבקבוקון המוסדר עד 15 מ"ל צנטר חרוטי המכיל 8 מ ל של הקרח קר Dמאמ/F12. לשטוף את הבקבוקון המוסדר עם תוספת של 1 מ ל של הקרח קר DMEM F12 כדי למזער את אובדן התאים. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 300 x g.
3. בזמן ההמתנה לצנטריפוגה, לאכול את הפתרון vitronectin ולהוסיף 1 mL של E8 בינונית (מוכן כמתואר בשלב 1.6) לבאר. לאחר מכן, להסיר את DMEM/F12 supernatant מצינור centrifuged חרוט ולהשעות מחדש את הגלולה ב 1 mL של E8 medium. להעביר את התאים לצלחת החדשה מצופה, להיות בטוח להתסיס את ההשעיה כדי למנוע את המושבות מתוך ההתפייעות על זריעה.
4. בדרך כלל יש מוות משמעותי. בתאים לאחר הפשרה למחרת בבוקר, להסיר את המדיום ולהחליף עם E8 מדיום טרי.
   הערה: גם בתנאים אופטימליים, iPSCs נוטים להתאושש מהקריוגנית. מומלץ להפוך את הקפאת האזור לכמעט-שוטפת 6-ולכן לזריעה עתידית לתוך 6-היטב. נוכחות של פסולת תא נורמלי עבור 2-3 הימים הראשונים במהלך שחזור התא.
5. החלף E8 בינונית מדי יום עד שהתאים מוכנים לקראת המשך (70% – 80% שליטה).
6. למעבר, ראשית הכינו בארות מצופות ויטרופקטין (כמתואר בשלב 2.1).
   1. לאחר בארות vitronectin מצופה מוכנים (כ 1 h), מE8 בינוני מבאר להיות מעבר ולשטוף פעמיים עם 1 מ ל של DPBS. דגירה עם 1 מ ל של 0.5 mM EDTA עבור 5 – 7 דקות ב 37 ° c. בעוד הדגירה, להסיר את הפתרון vitronectin מן הבאר מצופה החדש ולהחליף עם 1 – 2 מ ל של E8 בינונית.
   2. הסר את פתרון EDTA מן הבארות להיות מעבר ולנתק את המושבות על ידי שטיפת בעדינות פעם או פעמיים עם 1 מ ל של E8. העבר 75-200 μL של השעיית התא אל הבארות הE8 מצופה טרי, מתפרעים את הצלחת להבטיח אפילו כיסוי, ומקום בחממה מיד.
      התראה: זמן הדגירה של הניתוק iPSC הוא תלוי קו התאים; מומלץ למשתמש בפרוטוקול זה בדיקות מגוון של פעמים על הרחבה מספקת של קו iPSC שהתקבל/נוצר. 75 μL של ההשעיה של התא בדרך כלל תוצאות 4 ימים בין מעברים; 150 μL או יותר מוביל ל-2 – 3 ימים בין מעברים.

3. יצירת הושלתי הנגזרת של iPSC (איור 1).

1. בעת שמירה על iPSCs, לוודא המושבות הם דחוס היטב וכי יש מספר נמוך של תאים הבדיל בתרבות. אם המושבות מתחילות ליצור קשר אחד עם השני, סביר להניח שהתאים מאוד שוטפת וצריכים להיות מיושנים באופן מיידי.
2. כאשר iPSCs הם 70%-80% שוטפת, מעיל צלחת 24-באר עם תערובת חלבון ז'לטין (מוכן כמתואר בשנת 1.2/1.3). פיפטה 250 μL של תערובת זו לתוך כל טוב ולשמור על 1 h בטמפרטורת החדר.
3. במהלך הדגירה למעלה 1-h, להסיר את E8 בינונית ו-Y-27632 מהמקרר והמקפיא, בהתאמה. לאחר E8 בינונית ו-Y-27632 להגיע לטמפרטורת החדר, להכין E8 + ROCKi על ידי הוספת 13 μL של 10 μM Y-27632 כדי 13 מ ל של E8 ב 15 מ"ל שפופרת צנטריפוגה חרוט.
4. הסר את המדיום E8 מן הבארות iPSC, לשטוף פעמיים עם 1 מ ל של DPBS, ולאחר מכן דגירה עם 0.5 mM EDTA עבור 5-7 דקות ב 37 ° c. לאחר תקופת הדגירה, להסיר את EDTA ולהטות במהירות את התאים לתוך השעיה תא יחיד עם טיפ P1000 מעלה עם תשר 1 מ ל של E8 + ROCKi מדיום.
5. . תספור את התאים באמצעות הומוטומטר עבור השעיה שעשוי להכיל מיליוני iPSCs, להוסיף 20 μL של השעיית התא כדי 180 μL של טרי כחול. קבע את מספר התאים הכולל בהשעיה של תא יחיד.
6. העברת 0.432 x 10⁶ כדי 1.296 x 10⁶ תאים (10⁴ עד 3 x 10⁴ תאים/cm²) אל E8 + rocki הנותרים. הסר את ציפוי בתערובת ז'לטין מן הלוח החדש מצופה 12-באר ולהוסיף 500 μL של השעיית התא לכל באר, להבטיח כי התאים הם מבוזרים היטב אינם יוצרים גושים קטנים.
   הערה: טווח זה של צפיפויות הוא אופטימלי לבידול CD34 תאים חיוביים; עם זאת, צפיפויות אלה הן תלויות-קו תאים וייתכן שיהיה צורך למטב על-ידי המשתמש בפרוטוקול זה.
7. לאחר 24 h של תרבות, להחליף בינוני עם 500 μL של מדיום E8 טריים. מודטה עבור 24 שעות נוספות תחת אותם תנאים.
8. הסר את המדיום E8 ולהחליף עם LaSR בסיס בתוספת עם 6-12 μM של CHIR99021. נקודת זמן זו מוגדרת כD0 של בידול. לאחר 24 שעות של תרבות, להחליף עם אותו מדיום תרבות התא.
   הערה: כפי שמתואר קודם לכן, כמות CHIR99021 שנוספה למדיום זה תהיה תלויה בקו iPSC שנוצל. נא בדוק מגוון של ריכוזי CHIR99021 כדי להבטיח תוצאות אופטימליות.
9. לאחר 48 h של דגירה עם CHIR99021, להחליף עם 1 מ ל של LaSR בסיס.
10. החלף את המדיום מדי יום עם 2 מ ל של LaSR בסיס עבור 2-3 ימים נוספים. בשלב זה (D5 of בידול), חלק משמעותי של תאים אלה יהיה לבטא CD34 והוא יכול להיות מאופיין כושלתי אנדותל. סכמטי של פרוטוקול זה מחולק לתוצאות מייצגות באיור 1 ומתואר במלואו על-ידי החוקרים שפרסמו לראשונה את השיטה הזאת ^11,19.
    הערה: ניתן לבדיל בין ושלתי האנדותל לאורך שושלת האנדותל (35%-99%) או שושלת שריר חלקה (1% – 65%). יעילות הבידול משתנה בהתאם לסוג ציפוי ECM ולמדיום התרבותי התאי המשמש במהלך בידול ²⁰.

4. FACS של אנדותל ושלתי

1. לפני הנתק את D5/D6 תאים הבדיל, להכין מאגר מיון כמתואר בשלב 1.8 ולשמור על קרח.
2. דגירה את התאים הבדיל עם 250 μL של פתרון התנתקות התא לכל טוב (ראה טבלת חומרים) עבור 10 דקות ב 37 ° c.
3. הנתק את התאים עם טיפ P1000 לתוך השעיה תא יחיד בפתרון ניתוק התא. לאחד את תערובת התא התא הפתרון ערבוב ב 15 מ"ל שפופרת הצנטריפוגה חרוטי ו צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 300 x g.
4. הסר את הסופרנטאנט והשהה אותו מחדש ב-200 μL של מאגר מיון קר-קרח (מוכן כמתואר בשלב 1.7. הוסף 5 μL של הנוגדן CD34-PE מרוכז לתוך התא-מיון ההשעיה מאגר ו הדגירה של 10 דקות ב 4 ° c.
5. השהה מחדש ב-5 מ ל של מאגר מיון קר-קרח. לסנן את ההשעיה דרך מסננת תא עם כובע 40 יקרומטר לפני הצבת על סדרן.
6. בערוץ הפלורסנט המתאים, מיין 10,000 תאים שאינם מתויגים עם נוגדן פלורסנט. שער אזור בעוצמה פלורסנט גבוהה שאינה מכילה כל אלה 10,000 תאים (איור 1D). . זה ישמש כשליטה שלילית
7. הפעל את הדוגמה המכילה את התווית iPSC-EPs עם פתרון פלורסנט והתחל במיון. CD34 מתבטאת במידה רבה בושלתי האנדותל, והיא מופרדת בקלות מהאוכלוסייה הראשית. לאחר מיון, להעביר את הפתרון ל 15 מ ל צנטריפוגה שפופרת חרוטי ו צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 300 x g. . הסר את הסופרנטאנט
   הערה: אם הפתרון הוא בצינור גדול יותר מאשר צינור מיקרוצנטריפוגה (למשל, 5 מ ל קלקר בדרך כלל מועסקים בפרוטוקולי FACs רבים), להשעות מחדש את הגלולה תא ממוין 1 מ ל של מיון מאגר ולהעביר את הפתרון לצינור מיקרוצנטריפוגה. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ולהסיר את supernatant.
   1. אופציונלי: אם יש צורך באפיון iPSC-EP נוסף, הוסף נוגדנים ראשוניים אחרים (למשל, CD31-APC) בו עם CD34-PE. ודא שטבלת הצלבות בין ערוצי פלורסנט שונה ממוזערת.

5. כימוס ותרבות ארוכת טווח של הידרוג'לים קולגן של iPSC-EP

1. להכין זריעה בינונית על ידי הוספת 40 μL של 10x בינוני 199 ל 400 μL של הצמיחה אנדותל בינונית (EGM-2) בתוספת עם 10 μM Y-27632 בתוך מיקרוצנטריפוגה ב1.8 mL ושפופרת המקום על הקרח.
   הערה: בעוד השימוש באנטיביוטיקה הוא מיואש לתרבות תא גזע ותחזוקה של תאים הבדיל, מינון עם עט/דלקת מומלץ לאחר מיון כי קשה להבטיח עקרות בסביבת מיון (זה יותר חיוני אם הסדרן משותף בין מעבדות רבות).
2. הסר את כל supernatant מן ההשעיה התא ולהוסיף 200 μL של EGM-2 בתוספת עם 10 μM Y-27632. להעביר את ההשעיה התא לזריעה בינוני ולערבב במרץ.
3. הוסף 350 μL של קולגן לפתרון שהוכן בשלב 5.2 ומערבבים היטב. הפתרון יהפוך לצהוב בהיר.
   הערה: הריכוז הסופי של קולגן יכול להיות השפעה משמעותית על היווצרות של מקלעת נימי. פרוטוקול זה מניח כי הקולגן סופק ב 10 מ"ג/mL וכי ההידרוג'לים יש ריכוז סופי של 3.5 mg/mL. כוונן אמצעי אחסון אלה כדי להשיג את ריכוז הקולגן הסופי שלהם; מומלץ להגביל את ריכוז הקולגן הסופי מ 2 מ"ג/mL ל 4 מ"ג/mL.
4. להוסיף 5 μL של 1M NaOH לפתרון הכין ב 5.3 ומערבבים היטב, הימנעות המבוא של בועות אוויר. הפתרון יהיה ורוד בהיר.
5. פיפטה 56 μL של הפתרון לנטרל תא קולגן הכין ב 5.4 לתוך בארות בודדות של 96-ובכן אולטרה נמוך מצורף הלוח התחתון תרבות התאים. מודקון ב 37 ° c עבור 30 דקות. לפני הוספת מדיה, בדוק כי התאים הופצו באופן שווה על ידי בחינת הדגימות עם מיקרוסקופ ברייטפילד.
6. הכינו 1 מ ל של תרבות בינונית מורכב EGM-2 בתוספת עם 10 μM Y-27632 ו 50 ng/mL כלי הדם מקדם הצמיחה (הוסיף) על ידי הוספת 1 μL של כל פתרון מניות לצינור מיקרוצנטריפוגה. לאחר ערבוב היטב, פיפטה 100 μL של תרבות התא הזה בינונית על הידרו-לאדן התא. העבירו את הצלחת ל 37 ° c לתרבות ארוכת טווח.
7. החלף את מדיום התרבות מדי יום, תוך הוספת גורמי צמיחה אנגיוגנטיים נוספים או מעכבי מולקולה קטנה כפי שוכתב על-ידי מטרת המחקר. כדי להסיר את המדיה בצורה אופטימלית, הטה את הצלחת והשתמש בעצת P100 כדי להכניס בעדינות את המדיום מבלי להפריע להידרוג'ל.

6. תיקון, חיסוני, והדמיה של רשתות כלי דם מבוססי EP

1. לאחר שבוע של תרבות, להוסיף 250 μL של 4% פאראפורמלדהיד (בתחתית) פתרון צלחת 48-באר. ממלאים כמו בארות רבות כמו הידרוג ' לים. הסירו את המדיום מההידרוג (בלגון) והשתמשו בפינצטה משובחת כדי להעביר את ההידרוג לתוך הל, הכולל בארות. דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר ולהסיר את הה, על ידי שטיפת במהירות עם PBS.
2. הפרראות על ידי הוספת 250 μL של 0.5% של החומר הגולש nonionic (ראה טבלת חומרים) עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף פעמיים עם 250 μL של PBS שיושלם עם 300 mM גליצין. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות עבור כל צעד כביסה כדי להבטיח את ההסרה של ניקוי עודף. לחסום על ידי האישר את ההידרוג'לים ב-250 μL של חסימת מאגר עבור 30 דקות.
3. מודלת עם הנוגדנים הראשוניים הרצוי מדולל במאגר חסימת לילה ב 4 ° c. לדוגמה, אם הגנה מפני הפאלואידיב ו-VE-קדהרין, דלל 1:40 ו-1:200, בהתאמה, במאגר חסימת.
4. למחרת, להסיר את פתרון הנוגדן העיקרי ולשטוף פעמיים עם 0.5% אמולסיה מגיב ב-DPBS. מכסה עם רדיד אלומיניום ו דגירה עם נוגדן משני ספציפי (g., 1:200 אלקסה Fluor 488 ב PBS) עבור 2 h בטמפרטורת החדר.
5. הסר את הפתרון נוגדן משני ולשטוף פעמיים עם 0.5% אמולסיה מגיב ב-DPBS. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות עבור כל צעד כביסה כדי להבטיח את הסרת fluorophores חינם.
6. כדי להמחיש את גרעיני התאים, דלל 4, 6-diamidino-2-פנייילידול (DAPI) 1:10000 ב PBS ולהוסיף למדגם (ים).
   1. דגירה 2 דקות בטמפרטורת החדר ולשטוף פעמיים עם PBS. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות עבור כל צעד כביסה כדי להבטיח את הסרת fluorophores חינם.
7. העבירו את הדגימות לתוך שקופית אנגיוגנזה או צלחת פטרי בתחתית זכוכית בעזרת מלקחיים משובחים. ודא כי אין בועות אוויר לכודים מתחת הידרוג'ל.
8. תמונה על מיקרוסקופ קונפוקלית וקד על ידי רכישת z-ערימות הנמתחים מלמטה לחלק העליון של המדגם. ודא שהגלאי אינו רווי ושההגדלה הנמוכה ביותר הזמינה בשימוש (שדה גדול של תצוגה רצוי).
   הערה: לעיבוד עתידי, ודא שערימות ה-z נשמרות עם דחיסה מינימלית (לדוגמה,. czi).

7. שימוש בצינור החישוביות לניתוח והשוואת טופולוגיות רשת כלי דם

1. בדוק כל אחת מערימות z כדי לוודא שפרוסות מכילות כלי קיבול בלבד. פתח את מחסנית z ב-ImageJ ושפר את הניגודיות על-ידי לחיצה על תמונה ≫ התאם ≫ בהירות /ניגודיות. הגבולות של כלי הקיבול נמצאים כעת בבירור, ורמת הרקע ממוזערת. לעתים קרובות, ממדי z אינם תואמים לממדי x/y. כדי לתקן זאת, לחץ על תמונה ≫ התאם > גודל ושנה את מספר הפרוסות של z כך שהמרחק בין כל פרוסה הוא שווה ערך לפיקסל אחד ב-x/y. imagej יבצע אינטרפולציה באופן אוטומטי. אם שלב זה לא יבוצע כראוי, אמצעי האחסון התלת-ממדיים האחרונים יופיעו דחוסים.
   התראה: ECs יועברו לעבר קצות הג והוא יצור מושבות אבנים קטנות. למרות שאלה שימושיים להערכת גבולות ההידרוג'ל, הם יפריעו לניתוח התמונה הסופי ויש למחוק אותם.
   הערה: ImageJ היא תוכנת ניתוח תמונה פתוחה המבוססת על Java שפותחה בקונצרט על ידי המכון הלאומי לבריאות והמעבדה למכשור אופטי וחישוביות. מומלץ להוריד את פיג'י, וזה פשוט ImageJ ארוזות עם תוספים שימושיים (https://fiji.sc/).
2. ב-ImageJ, יש לטשטש את התמונה בתהליך לחיצה של 3 ממדים ≫ מסננים ≫ -גאוס טשטוש תלת-ממד ולאחר מכן הגדרת ערכי סיגמא ב-3 הממדים ל-2.0 (ייתכן שיהיה צורך לכוונן ערך זה על-ידי משתמש הקצה).
3. ב-ImageJ, לחץ על עבד ≫ בינארי ≫ הפוך לבינארי ולאחר מכן בחר אלגוריתם סף מתאים. האלגוריתם סף הצלב האנטרופיה שפותחה על ידי Li et al. הוא יעיל בהפרדת כלי הקיבול מהרקע²¹. חשב את הסף עבור כל תמונה והגדר את הרקע "ברירת מחדל".
4. ב ImageJ, להסיר רעש מזויף ולמלא "חורים" ב לומן על ידי לחיצה על תהליך > רעש > להסיר outliers.
   הערה: הסרת החוצה "מוארת" תמלא חורים קטנים באוניות מחוברות; הסרת החוצה "כהה" תסיר תאים מתים. גודל רדיוס ההסרה ישתנה בהתאם להגדלה ולגודל כלי הקיבול. עבור תמונות שנרכשו עם מטרה שדות רחב כי הם 512 x 512 פיקסלים, רדיוi בדרך כלל נע בין 4-6 פיקסלים.
5. עבד את כל raw (למשל, הארכה czi) קבצים ולהמיר לתוך קבצי. tif לפני שתמשיך שלב 7.6. כדי לסייע בעיבוד זה, קובץ ImageJ, "Binarize ו-Filter. ijm" צורף לכתב היד הזה.
6. שמור את הקבצים המעובדים. tif באותה תיקיה כמו הקובץ "Batchמעבד שלד. m", זמין להורדה בכתב היד. סקריפט זה, שפותח על ידי המחברים, קורא את הפונקציות שפורסמו על ידי פיליפ Kollmannsberger²² ומבצעת מניפולציה קבצים נוספים.
7. להוריד ולפתוח את כל הקבצים המשויכים שתי הפונקציות העיקריות "Skel2Graph3D" (https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43527-skel2graph-3d) ו "Skeleton3D" (https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43400-skeleton3d). שמור את כל הפונקציות באותה תיקיה כמו מחסנית z מעובד שנפתחו.
8. פתח סביבת מיחשוב נומרית מרובת פרדיגמה (ראה טבלת חומרים) ונווט אל התיקיה שבה נשמרו כל הקבצים המתוארים לעיל.
9. הפעל את "השלד העצמי" או על- ידי הקלדת השלד בתוך חלון הפקודה או על-ידי פתיחת קובץ ה-script ופגיעה בלחצן הפעלה (חץ שפונה לימין) בעורך.
   הערה: כדי לנתח ערכת נתונים גדולה בעלת פקודה יחידה, ודא שהמחרוזת בתוך הפונקציה dir בשורה 6 מכילה כוכבית (לדוגמה, ' *. tif '). אחרת, החלף את הכוכבית בשם הקובץ אם הניתוח של קובץ יחיד רצוי.
10. משך הזמן שקובץ script זה לביצוע ישתנה באופן משמעותי בהתאם לכוח המחשוב הזמין. מומלץ לבצע ניתוח זה במחשב עם לפחות 8 GB של זיכרון RAM כך שהמשתמש יוכל לגשת לתוכניות אחרות בזמן שקובץ ה-script יופעל.
    התראה: בעוד שאין צורך בהכרח, העתק את הרכישה המקורית (באפור) והנחת היתר עם מטריצת תמונה זו עם מטריצת השלד (באדום) יכולה לסייע בהערכת הביצועים של אלגוריתם הסקלטונזציה. בנוסף, הקורא יכול ליצור גרף קטרי, כפי שיושם על ידי Kollmannsberger et al., כדי להעריך את הדיוק של ניתוח הרשת. כדי ליצור את שני הגרפים, בעוד שימושיים, תגדיל באופן דרמטי את זמן הריצה של הסקריפט וידרוש זיכרון נוסף; אם המשתמש פשוט דורש ניתוח טופולוגיה סופי ואינו מעוניין להמחיש את ערכת הנתונים, פשוט הגיבו על קווים 44 עד 61 (גרף שלד) ושורות 104 ל-143 (בגרף הטופולוגיה).
11. עם השלמתה, מטריצת הנתונים, המוצגת בסביבת העבודה, מכילה כעת את הנתונים המעובדים. לחץ פעמיים על נתונים ופתח תא זה בעורך המשתנים.
    1. שים לב כי מטריצה זו תכיל, משמאל לימין: 1) שם הקובץ, 2) מספר הצמתים (נקודות הסתעפות + נקודות קצה), 3) הסתעפות נקודות, 4) קישורים (כלומר, כלים), 5) אורך הרשת (כולל בידוד ספינות) ו-6) מספר הפרוסות הכלולות במחסנית z. שמור נתונים אלה כקובץ. csv וייצוא לצורך ניתוח נוסף לכל תוכנה שתבחר.

תוצאות

לאחר בידול (איור 1), facs ו כימוס של ipsc-EPs ב קולגן הידרוג'לים, התאים יישארו בדרך כלל מעוגל עבור 24 שעות לפני תחילת להגר וטופס הראשונית לומן. לאחר כשישה ימי תרבות, מקלעת נימי-המים הפרימיטיבית תהיה גלויה בהידרוג'ל כאשר היא מוצגת במיקרוסקופ ברייטפילד (איור 2). לאחר הדמיה קבועה, מוכתם התא לאדן הידרוג'לים על מיקרוסקופ קונפוקלית וקד (סרט 1, משלים סרט 1), התמונות מעיבוד מראש מומרים לשלד המאפשר ניתוח של האורך הכולל קי...

דיון

פרוטוקול זה כולל את התרבות הארוכת טווח של תאים בשלושה סוגים של מדיית תרבות התא: E8, LaSR בסיס ו-EGM-2. לכן יש לנקוט בזהירות רבה כדי לעקר את כל החומרים. בנוסף, מעילי מעבדה וכפפות שעברו ניקוי אתנול צריכים תמיד להיות שחוקים כשעובדים במכסה הזרימה המבינארי של המעבדה. מומלץ לבדוק לעתים קרובות לזיהום mycoplasma; אם כמות גדולה של פסולת נצפתה במהלך תרבות iPSC או ירידה פתאומית ביעילות הבידול הוא ציין, זיהום mycoplasma הוא גורם סביר. iPSC-EPs שנוצר עם פרוטוקול זה נוטים להפקיד כמות משמעותית של ECM, אשר מתארך את זמן הדיסוציאציה וגורם...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
µ-Slide Angiogenesis	Ibidi	N/A	צלחת תרבית רקמות שטוחה עם תחתית זכוכית עם דפנות צד מאפשרת הדמיה קונפוקלית קלה
96 באר, תחתית עגולה, מיקרו-צלחת חיבור נמוכה במיוחד, סטרילית	קורנינג	7007	מונעת קשירה של הידרוג'לים קולגן עמוסי תאים לצלחת תרבית התאים
Accutase	STEMCELL Technologies	7920	פתרון ניתוק תאים עדין; אינו פוגע באפיטופים חוץ-תאיים החיוניים ל-FACS
Advanced DMEM/F12	Thermo Scientific	12634010	אמצעי הבסיס להתמיינות iPSC-EP.
Barnstead GenPure xCAD Plus	Thermo Fisher Scientific	50136165	; אחרים יכולים להיות מוחלפים בקלות
בתמיסת אלבומין סרום בקר, 7.5% ב-DPBS, מסנן סטרילי, BioXtra, מתאים לתרבית תאים	Fisher Scientific	A8412	כדי לשמר את כדאיות התאים כאשר FACs ממיינים
CD34-PE, אנושי (שיבוט: AC136)	Miltenyi Biotec	130-098-140	נוגדן המשמש לבידוד FACs של iPSC-EPs
CHIR99021	LC Laboratories	C-6556	גורם להיווצרות מזודרם מתאי גזע פלוריפוטנטיים
קולגן I זנב עכברוש חלבון גבוה 100 מ"ג	VWR	354249	מיקרו-סביבתיים תלת מימדיים
(15/50 מ"ל)	פישר סיינטיפיק	14-959-49D/A	משמש לאחסון וערבוב כמויות גדולות יחסית של ריאגנטים ואמצעי
תרבית תאיםDAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermo Fisher Scientific	D1306	כדי להכתים ולדמיין גרעיני תאים
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	11320-082	לדילול מטריג'ל והפשרת תאי גזע פלוריפוטנטיים
מלח חוצץ פוספט של Dulbecco (DPBS)ThermoFisher		14190-250	לשטיפת תרביות חד-שכבתיות
EDTA	Sigma-Aldrich	E8008	למעבר של מושבות תאי גזע פלוריפוטנטיות ולמניעת צבירת תאים כאשר FACs ממיין
את צמיחת תאי האנדותל Medium 2	PromoCell	C-22011	מקדם את הכדאיות וההתפשטות של תאי האנדותל
Essential 8	Medium Thermo Fisher Scientific	A1517001	לתחזוקה של תאי גזע פלוריפוטנטיים
גליצין, BioUltra, לביולוגיה מולקולרית, >=99.0% (NT)	Sigma-Aldrich	50046	מנטרל את חומר הניקוי שנותר
חומצה L-אסקורבית 2-פוספט sesquimagnesium מלח הידרט,>=95%	Sigma-Aldrich	A8960	רכיב של מדיום התמיינות iPSC-EP
MATLAB	MathWorks	1.8.0_152	סביבת מחשוב מספרית רב-פרדיגמה (זמין בחינם ברוב המוסדות האקדמיים)
Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 מ"ל (תערובת חלבון ג'לטינית)	Fisher Scientific	356231	מדולל ב-DMEM/F12 לציפוי צלחות להתמיינות iPSC-EP
Medium-199 10X	Thermo Fisher Scientific	1825015	משמש לאיזון אוסמולריות הידרוג'ל סופית וצינורות
מיקרוצנטריפוגה pH (1.7 מ"ל)VWR		87003-294	מאחסן כמויות קטנות של ריאגנטים
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)	סיגמא-אולדריץ'	P3813	המרכיב העיקרי של תמיסות הצביעה החיסונית
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122	אנטיביוטיקה המשמשת לאחר מיון להסרת זיהום אפשרי ממכשיר FACS
רקומביננטי אנושי VEGF 165 חלבון	R& D Systems	293-VE	מיטוגן הממריץ את התפשטות תאי האנדותל וטובולוגנזה
רודמין פלואידין	תמו פישר סיינטיפיק	R415	לזיהוי שקיעת F-actin ולפיכך לשרטט את גבולות רשתות כלי הדם
Triton X-100 (חומר פעילי שטח לא יוני)	חומר ניקוי Sigma-Aldrich	X-100	המשמש לחדירה עדינה של תאים
Tween-20 (מגיב מתחלב)	Fisher Scientific	BP337	מגביר את ספציפיות הקישור של הנוגדנים הנוספים
VE-Cadherin (F-8)	Santa Cruz Biotechnology	sc-9989	לזהות לומן אנדותל תלת מימדי בהידרוג'לים של קולגן
Vitronectin	ThermoFisher	A14700	לתחזוקה של תאי גזע פלוריפוטנטיים
Y-27632	Selleck Chemicals	S1049	משמר תאי גזע פלוריפוטנטיים וכדאיות iPSC-EP בעת ניתוק וזריעה מחדש