Method Article

מודל תלת מימד וצינור חישוב מתורבת לכמת את הפוטנציאל הוושלתי של iPSC-נגזר של התגובה האנטי-מגנטית

DOI:

10.3791/59342

⸱

May 13th, 2019

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Texas at Austin

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הושלתי האנדותל שנגזר מתאי גזע המושרה ביותר (iPSC-EPs) יש את הפוטנציאל לחולל מהפכה לטיפולי מחלות לב וכלי דם ולאפשר יצירת מודלים נאמנים יותר של מחלות לב וכלי דם. בזאת, כימוס של iPSC-EPs בתלת מימדי (3D) קולגן מיקרוסביבה וניתוח כמותי של הפוטנציאל הגלום בתאים אלה מתוארים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המושרה בתאי גזע פלוריטי (iPSCs) הם מקור ספציפי למטופל, תא שהתרבות שיכול להבדיל לכל סוג תא הסומטית. ביופוטנאל ושלתי (EPs), אשר יכול להבדיל בין סוגי התאים הדרושים כדי להרכיב בוגרת, פונקציונלית ולבלטורה, נגזר הן העובריים והמושרה תאים גזע pluripotent עם זאת, תאים אלה לא הוערכו בקפדנות בסביבות תלת ממדיות, ואת המדד הכמותי של הפוטנציאל הvas, שלהם נשאר חמקמק. כאן, הדור והבידוד של iPSC-EPs באמצעות מיון התא מופעל פלורסנט מתוארים תחילה, ואחריו תיאור של עטיפת ותרבות של iPSC-EPs ב קולגן הידרוג. מטריצה זו (ECM)-מחקה המיקרו-סביבה מעודדת תגובה חזקה ומרכזית; ליצור רשתות כלי דם לאחר שבוע של תרבות. יצירת צינור חישובית העושה שהוא משתמש בתוכנה מקור פתוח כדי לכמת את התגובה הזאת הוא התחום. צינור זה נועד במיוחד כדי לשמר את ארכיטקטורת 3d של מקלעת נימי כדי מכבש לזהות את מספר הענפים, נקודות הסתעפות, ואת אורך הרשת הכולל עם קלט משתמש מינימלי.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

וריד הטבור האנושי בתאי הטבורי (HUVECs) וסוגים אחרים של תאים אנדותל הראשי כבר מנוצל במשך שני עשורים לדגמן כלי דם לבלוב ופיתוח בתוך מבחנה1. פלטפורמות כלי דם כאלה להבטיח להאיר מולקולרית ברמת רקמות מנגנונים של מחלות לב וכלי דם והוא עשוי להציג תובנה פיזיולוגית לתוך פיתוח של רשתות כלי דם פרימיטיביים2,3. למרות שהשדה של מידול כלי הדם הגיע עד להתקדמות משמעותית, שיטת "תקן זהב" שיכולה לכמת את המודל ולהעריך את ההתפתחות הפיזיולוגית של כלי הדם, נותרה חמקנית. רוב הפרוטוקולים שפורסמו אינם מתפקדים כראוי את הנישה של כלי הדם כדי לעודד היווצרות של כלי דם בוגרים ופונקציונליים או שיטה להשוות את הפוטנציאל הגל....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת מדיה תרבותית ופתרונות ציפויים

  1. כדי להכין הפתרון ציפוי vitronectin, לדלל vitronectin 1:100 ב מלוחים פוספט באגירה של Dulbecco (DPBS).
    התראה: לאחר דילול, לא מומלץ לאחסן פתרון זה לשימוש עתידי.
  2. עם קבלת פנול חינם אדום, גורם גדילה-מופחת תערובת חלבון ז'לטין (ראה שולחן חומרים) מהיצרן, להפשיר על קרח ב 4 ° צ' עד התערובת היא שקופה ונוזלית. שמירה על התערובת על קרח במכסה זרם למינארי, פיפטה 75 μL של התערובת לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה של 1.8 mL ולהקפיא ב-20 ° c מיד. ניתן לאחסן את הבליטים האלה עד לשנה אחת.
    התראה: תערובת חלבון הלטין הופכת לצמיגה מאוד כאשר היא נשמרת בטמפרטורת החדר וממשיכה להיות מועלת בטמפרטורות גבוהות יותר. . שמור על הפת....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאחר בידול (איור 1), facs ו כימוס של ipsc-EPs ב קולגן הידרוג'לים, התאים יישארו בדרך כלל מעוגל עבור 24 שעות לפני תחילת להגר וטופס הראשונית לומן. לאחר כשישה ימי תרבות, מקלעת נימי-המים הפרימיטיבית תהיה גלויה בהידרוג'ל כאשר היא מוצגת במיקרוסקופ ברייטפילד (איור 2). לאחר הדמיה קבועה, מוכתם התא לאדן הידרוג'לים על מיקרוסקופ קונפוקלית וקד (סרט 1, משלים סרט 1), התמונות מעיבוד מראש מומרים לשלד המאפשר ניתוח של האורך הכולל קי.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה כולל את התרבות הארוכת טווח של תאים בשלושה סוגים של מדיית תרבות התא: E8, LaSR בסיס ו-EGM-2. לכן יש לנקוט בזהירות רבה כדי לעקר את כל החומרים. בנוסף, מעילי מעבדה וכפפות שעברו ניקוי אתנול צריכים תמיד להיות שחוקים כשעובדים במכסה הזרימה המבינארי של המעבדה. מומלץ לבדוק לעתים קרובות לזיהום mycoplasma; אם כמות גדולה של פסולת נצפתה במהלך תרבות iPSC או ירידה פתאומית ביעילות הבידול הוא ציין, זיהום mycoplasma הוא גורם סביר. iPSC-EPs שנוצר עם פרוטוקול זה נוטים להפקיד כמות משמעותית של ECM, אשר מתארך את זמן הדיסוציאציה וגורם.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכת על ידי איגוד הלב האמריקני (מענק מספר 15SDG25740035, הוענק J.Z.), המכון הלאומי לדימות ביו-רפואי ו Bioהנדסאים (NIBIB) של המוסדות הלאומיים לבריאות (גרנט מספר EB007507, הוענק סיסי), ו הברית למחקר שיקום משובי & הדרכה (AR3T, גרנט מספר 1 P2C HD086843-01, הוענק J.Z.). ברצוני להכיר בפרופ ' ז'אן סטצ'ויאק (אוניברסיטת טקסס באוסטין) לעצתה הטכנית במיקרוסקופיה. אנחנו גם אסירי תודה על דיונים עם סמואל Mihelic (אוניברסיטת טקסס באוסטין), ד ר אלישיה אלן (אוניברסיטת טקסס באוסטין), ד ר ג ' ולי Rytlewski (ביוטכנולוגיה מסתגלת), וד ר ליאון Bellan (אוניברסיטת ואנדרבילט) על התובנה שלהם על אנליזה חישובית של רשתות תלת-מימד. לבסוף, אנו מודים לדר ' שיאופינג באו (אוניברסיטת קליפורניה ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
µ-Slide AngiogenesisIbidiN/Aצלחת תרבית רקמות שטוחה עם תחתית זכוכית עם דפנות צד מאפשרת הדמיה קונפוקלית קלה
96 באר, תחתית עגולה, מיקרו-צלחת חיבור נמוכה במיוחד, סטריליתקורנינג7007מונעת קשירה של הידרוג'לים קולגן עמוסי תאים לצלחת תרבית התאים
AccutaseSTEMCELL Technologies7920פתרון ניתוק תאים עדין; אינו פוגע באפיטופים חוץ-תאיים החיוניים ל-FACS
Advanced DMEM/F12Thermo Scientific12634010אמצעי הבסיס להתמיינות iPSC-EP. 
Barnstead GenPure xCAD Plus Thermo Fisher Scientific50136165; אחרים יכולים להיות מוחלפים בקלות
בתמיסת אלבומין סרום בקר, 7.5% ב-DPBS, מסנן סטרילי, BioXtra, מתאים לתרבית תאיםFisher ScientificA8412כדי לשמר את כדאיות התאים כאשר FACs ממיינים
CD34-PE, אנושי (שיבוט: AC136)Miltenyi Biotec130-098-140נוגדן המשמש לבידוד FACs של iPSC-EPs
CHIR99021LC LaboratoriesC-6556גורם להיווצרות מזודרם מתאי גזע פלוריפוטנטיים
קולגן I זנב עכברוש חלבון גבוה 100 מ"גVWR354249מיקרו-סביבתיים תלת מימדיים
(15/50 מ"ל)פישר סיינטיפיק14-959-49D/Aמשמש לאחסון וערבוב כמויות גדולות יחסית של ריאגנטים ואמצעי
תרבית תאיםDAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Thermo Fisher ScientificD1306כדי להכתים ולדמיין גרעיני תאים
DMEM/F12Thermo Fisher Scientific11320-082לדילול מטריג'ל והפשרת תאי גזע פלוריפוטנטיים
מלח חוצץ פוספט של Dulbecco (DPBS)ThermoFisher14190-250לשטיפת תרביות חד-שכבתיות
EDTASigma-AldrichE8008למעבר של מושבות תאי גזע פלוריפוטנטיות ולמניעת צבירת תאים כאשר FACs ממיין
את צמיחת תאי האנדותל Medium 2PromoCellC-22011מקדם את הכדאיות וההתפשטות של תאי האנדותל
Essential 8Medium Thermo Fisher ScientificA1517001   לתחזוקה של תאי גזע פלוריפוטנטיים
גליצין, BioUltra, לביולוגיה מולקולרית, >=99.0% (NT)Sigma-Aldrich50046מנטרל את חומר הניקוי שנותר
חומצה L-אסקורבית 2-פוספט sesquimagnesium מלח הידרט,>=95%Sigma-AldrichA8960רכיב של מדיום התמיינות iPSC-EP
MATLABMathWorks1.8.0_152סביבת מחשוב מספרית רב-פרדיגמה (זמין בחינם ברוב המוסדות האקדמיים)
Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 מ"ל (תערובת חלבון ג'לטינית)Fisher Scientific356231מדולל ב-DMEM/F12 לציפוי צלחות להתמיינות iPSC-EP
Medium-199 10XThermo Fisher Scientific1825015משמש לאיזון אוסמולריות הידרוג'ל סופית וצינורות
מיקרוצנטריפוגה pH (1.7 מ"ל)VWR87003-294מאחסן כמויות קטנות של ריאגנטים
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)סיגמא-אולדריץ'P3813המרכיב העיקרי של תמיסות הצביעה החיסונית
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122אנטיביוטיקה המשמשת לאחר מיון להסרת זיהום אפשרי ממכשיר FACS
רקומביננטי אנושי VEGF 165 חלבוןR& D Systems293-VEמיטוגן הממריץ את התפשטות תאי האנדותל וטובולוגנזה
רודמין פלואידיןתמו פישר סיינטיפיקR415לזיהוי שקיעת F-actin ולפיכך לשרטט את גבולות רשתות כלי הדם
Triton X-100 (חומר פעילי שטח לא יוני)חומר ניקוי Sigma-AldrichX-100המשמש לחדירה עדינה של תאים
Tween-20 (מגיב מתחלב)Fisher ScientificBP337מגביר את ספציפיות הקישור של הנוגדנים הנוספים
VE-Cadherin (F-8)Santa Cruz Biotechnologysc-9989 לזהות לומן אנדותל תלת מימדי בהידרוג'לים של קולגן
VitronectinThermoFisherA14700לתחזוקה של תאי גזע פלוריפוטנטיים
Y-27632Selleck ChemicalsS1049משמר תאי גזע פלוריפוטנטיים וכדאיות iPSC-EP בעת ניתוק וזריעה מחדש
מערכת טיהור מים של המרכיב העיקרי של צינורות צנטריפוגה חרוטיים מי

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, K., Lin, R. -Z., Melero-Martin, J. M. Bioengineering human vascular networks: trends and directions in endothelial and perivascular cell sources. Cellular and Molecular Life Sciences. , 1-19 (2018).
  2. Kant, R. J., Coulombe, K. L. K.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

iPSC Derived Endothelial ProgenitorsFluorescent Activated Cell SortingCollagen Hydrogel EncapsulationVasculogenic Potential Quantification3D Vascular Network FormationConfocal Microscopy AnalysisOpen Source Computational PipelineEndothelial Growth Medium 2ROCK Inhibitor Y 27632Vascular Endothelial Growth Factor

Related Articles