מאמר שיטה

בידוד וכתמים של העור העכבר Keratinocytes עבור ניתוח מחזור התא הספציפי של חלבון הביטוי הסלולרי על ידי המוני הקיקומטריה

DOI:

10.3791/59353

⸱

9 במאי 2019

 , 
1Department of Dermatology and Charles C. Gates Center for Regenerative Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבודד keratinocytes העור מדגמי העכבר, כדי להכתים עם מתכת מתויג נוגדנים, ולנתח תאים ויטראז על ידי cy, try המונית כדי לפרופיל את דפוס הביטוי של חלבונים של עניין בשלבים שונים מחזור התא.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המטרה של פרוטוקול זה היא לזהות ולכמת ביטוי חלבון שינויים באופן תלוי מחזור התא באמצעות תאים בודדים מבודדים האפידרמיס של העור העכבר. ישנם שבעה צעדים חשובים: הפרדת האפידרמיס מן dermis, העיכול של האפידרמיס, כתמים של אוכלוסיות תאים באפידרמיס עם cisplatin טינית, מדגם barcoding, צביעת עם נוגדנים מתויג מתכת עבור סמנים מחזור התא וחלבונים של ריבית, זיהוי של נוגדנים מתויגים מתכת על ידי cy, המוניים לנסות, ואת ניתוח הביטוי בשלבים מחזור התא השונים. היתרון של גישה זו על שיטות היסטולוגית הוא הפוטנציאל לסדר את תבנית הביטוי של > 40 סמנים שונים בתא בודד בשלבים שונים של מחזור התא. גישה זו מאפשרת גם ניתוח מתאם מרובה משתנים של ביטוי חלבון הניתן לכימות יותר מאשר שיטות היסטולוגית/דימות. החיסרון של פרוטוקול זה הוא כי השעיה של תאים בודדים נדרש, אשר מביא לאובדן מידע מיקום שסופקו על ידי הצביעת של מקטעי רקמות. גישה זו עשויה גם לדרוש הכללה של סמנים נוספים כדי לזהות סוגים שונים של תאים בשעיות תא גולמי. היישום של פרוטוקול זה ניכרת בניתוח של מחלת עור hyperplastic מחלות. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לניתוח של תת סוג ספציפי של תאים (למשל, תאי גזע) על ידי הוספת נוגדנים ספציפיים לשושלת היוחסין. פרוטוקול זה יכול גם להיות מותאם לניתוח של תאי העור במינים ניסיוניים אחרים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קורלציה של ביטוי גנים עם שלבי מחזור התא נשאר אתגר בניתוח של מודלים בעלי חיים של מחלות hyperplastic כמו סרטן. חלק מאתגר זה הוא שיתוף זיהוי של חלבונים של עניין (פוי) עם סמנים של התפשטות. תאים מתרבים ניתן למצוא שלבים שונים מחזור התא כולל G1, S, G2, ו-M. Ki67 הוא אחד הסמנים הנפוצים ביותר של התפשטות והוא מתבטא בכל השלבים של מחזור התא. זה נעשה בשימוש נרחב בניתוח של רקמות האדם והעכבר1,2,3. עם זאת, כמו סמני התפשטות כלליות אחרים, Ki67 אינו משנה שלבים במחזור תאים בודדים. גישה מדויקת יותר משתמשת התאגדות של הנוקלאוטידים האנמיטין האנלוגיים כמו ברומאודאוקסילדין (brdu) לתאים הנמצאים באופן פעיל משכפל הגנום שלהם (כלומר, S-שלב)4,5. חיסרון אחד לשימוש של נוקלאוטיד מקבילים הוא הצורך לנהל אותם לחיות בחיים שעות לפני הניתוח. Ki67 ו BrdU מזוהים בדרך כלל על מקטעים רקמה קבועה על ידי שימוש של נוגדנים. אחד היתרונות של גישה זו היא כי המיקום של POIs ניתן לברר בתוך הארכיטקטורה רקמה (למשל, שכבת הבסיס של אפידרמיס העור). גישה זו גם אינה דורשת דיסוציאציה של רקמות שעלולה להוביל לשינויים בביטוי הגנים. חיסרון אחד הוא כי קיבוע רקמות או עיבוד של הרקמה עבור OCT קפוא או הפרפין מאפשר לסגר מטרות נוגדנים (כלומר, אנטיגנים). אחזור של אנטיגנים בדרך כלל דורש עיכול חום או רקמה. הכמת של עוצמות מכתים יכול גם להיות מאתגר. הדבר נובע מווריאציות של כתמים, עובי מקטעים, זיהוי אותות והטיית מע. יתר על כן, מספר מוגבל של סמנים ניתן להבחין בו זמנית ברוב הגדרות המעבדה טיפוסי. עם זאת, גישות חדשות יותר לצביעת מחדש מבטיחים להתגבר על מגבלות אלה; דוגמאות הן הדמיה מאסיבית של cy, והגברה אות של טירמידה6,7.

Cy, הזרמת הזרימה היא טכנולוגיה חזקה נוספת כדי לזהות תאים מתרבים. זה מאפשר זיהוי מולטיפלקס של סמנים בתאים זהים אך דורש הדיסוציאציה רקמות עבור סוגי תאים שאינם המטבטיים ביותר. ניתוח של תאים מתרבים נעשה באופן שגרתי על ידי שימוש בצבעים לאגד DNA (למשל, Propidium יודיד (PI))8. Cy, הזרמת מיתרים גם מאפשרת קביעה מדויקת יותר של שלבי מחזור התא כאשר ביחד עם זיהוי של התאגדות BrdU9. למרות גישה רבת עוצמה, BrdU/PI הזרימה cy, הזורם יש חסרונות שלה. אין אפשרות לפתור את השלבים G2/M ו-G0/G1 ללא הכללה של נוגדנים ספציפיים לפאזה. עם זאת, מספר נוגדנים שניתן להשתמש בו מוגבל על ידי הסלולר autoפלואורסצנטית, גולש ספקטרלי של פליטת fluorophore, ואת השימוש של שולטת פיצוי. מגבלה זו קומות אותו יותר מאתגרת ומפרך כדי לזהות את הביטוי של סמנים מחזור התא עם pois. גישה יותר נתיישב היא להשתמש cy, המסה המוני10,11. טכנולוגיה זו משתמשת בנוגדנים מצוצרים מתכת כי יש ספקטרום זיהוי צר. ברגע שהתאים מוכתמים בנוגדנים עם מתכת-מתויג, הם מתאדה, ואת המתכות שזוהו על ידי cy, לנסות זמן הטיסה (Cyתוף) המסה ספקטרומטריה. בשל מאפיינים אלה, cy, ההמוני הגדול מאפשר זיהוי של > 40 סמנים שונים באמצעות פלטפורמות קיימות10,11. בנוסף, ניתן לבצע דגימות ברקוד עם מתכות הגורמות לחיסכון של נוגדנים יקר תוך הפחתת דגימת לדוגמה לשונות מכתים. מצד שני, לציטומה ההמוני יש כמה חסרונות. יש מספר מצומצם של נוגדנים מסחרי זמין מתכת מתויג עבור תאים שאינם בדם נגזר. הכמת של תוכן ה-DNA הוא רגיש פחות לעומת השימוש של צבע ה-DNA פלורסנט ו cy, לנסות ההמוני יש טווח דינמי מופחת של זיהוי אותות לעומת זרם הזריחה cy, try.

הפרוטוקול המתואר כאן נועד לנתח את הדינמיקה מחזור התא מן keratinocytes מבודדים (KCs) מעור העכבר ולאפיין את מחזור התא ביטוי חלבון ספציפי בתאים אלה באמצעות cy, מאסה המונית. פרוטוקול זה יכול לשמש גם עם תאים מתורבתים או מותאמים לסוגי תאים אחרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הוועדה המייעצת לטיפול בבעלי חיים בקמפוס קולורדו אישרה את ניסויים בבעלי חיים המתוארים בפרוטוקול זה.

1. ההכנות

  1. עיצוב מתכת מתויג הפאנל הלוח. השתמש בתוכנת העיצוב המקוונת החופשית של הפאנל12 וכוללים 127iododeoxyuridine (idu), 164Dy (דיירוסיום) שכותרתו Anti-CCNB1 (בשנת B1), 175Lu (לוטציום) פוספהו (p)-HISTONEH3Ser28 (pHH3), ו 150 Nd (ניאודימיום)-חלבון pRETINOBLASTOMASer807/811 (prb)13. הוסיפו נוגדנים נוספים שתויגו מתכת שאינם חופפים לערוץ14שלהם.
  2. הכן פתרון מלאי IdU. התמוססות IdU אבקה ב 10 מ"ג/mL ב 0.1 N NaOH ב 60 ° c. מניות IdU הפתרון מלאי לצינורות מיקרוצנטריפוגה ולהקפיא ב-20 ° c עבור אחסון לטווח ארוך.
    1. להתאים את ה-pH של פתרון IdU כדי 7.5 עם 12 N HCl מיד לפני השימוש. מבחן עם רצועת pH על מחיקת סדרת מחלקים כדי להבטיח את הפתרון הוא ב-ph 7.5.
      הערה: זמן ממושך (> 5 דקות) של IdU ב-pH 7.5 יביא משקעים ומים טריים של IdU נדרש כאשר זה קורה.
    2. השתמש בציוד הגנה אישי מתאים (למשל, כפפות, מעיל מעבדה ומשקפי בטיחות) ולעבוד בקבינט בטיחות בעת טיפול בפתרונות NaOH או HCl.
  3. הכינו פתרון של פאראמפורמלדהיד בגובה 2 x. שילוב 5 מ ל של 10x PBS (pH 7.5) ו-1 מ ל 16% הגמר עם 44 mL של dH כיתה מולקולרית טהור2O (3.2% הריכוז הסופי).
    הערה: ניתן להכין מלאי של כלת1 כאשר פורסם בעבר15 או לרכוש 16% מניות ללא מתכות מזהם.
    1. השתמש בציוד הגנה אישי מתאים ועבוד בקבינט בטיחות בעת טיפול באבקה ובפתרונות בתחום הלקלטיים.
  4. הכנת בריום (Ba2 +) חינם 1x pbs ידי שילוב של 5 מ ל של מתכת ללא תשלום 10x Pbs (pH 7.5) עם 45 Ml של dH טהור כיתה מולקולרית2O.
    הערה: האיכות של ה-PBS וריאגנטים אחרים חשוב מאוד להימנע מזיהום מתכות שיכולות להחדיר רעשי רקע במהלך ניתוח של נתוני הציטוטריק ההמוני.
  5. הכינו פתרון מניות של 100 מ"מ. התמוססות 300.5 מ ג של אבקת ציספלטין ב 10 מ ל של DMSO. חנות באליבטס ב-80 ° c. להכין פתרון 10 מ"מ עבודה ציספלטין עבור ניסויים לשימוש על 1 d.
  6. להכין פתרונות אפידרמיס/dermis הפרדה. הכן 20 x dispase פתרון מניות על ידי המסת 30 מ"ג ב 1 מ ל של HBSS או PBS. מסנן לעקר באמצעות פילטר 0.22 יקרומטר ולאחסן ב-ali, ב-20 ° c. הכנת 1x סוג הרביעי העירוי קולגן מניות פתרון ב 1 מ"ג/mL ב hbss, מסנן לעקר באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר, ולאחסן ali, ב-20 ° c.

2. הוספת תוויות לשלב של התאגדות IdU

  1. . שוקלים עכברים השתמש ב-P1-P3 גורי המין או בעכברים מבוגרים בן 8-10 שבועות ולהשתמש בעכברים זכרים או נקבות מC57BL/6, FvB, או 129 רקעים. לקבוע מינון ב 0.1 מ"ג IdU (pH 7.5)/g משקל הגוף. לדוגמה, a 25 g העכבר דורש 0.25 mL של IdU.
  2. לספק את המינון של IdU על ידי הזרקת הצפק ולחכות 2 h לפני איסוף התאים. השתמש במזרק טוברקולין. כדי להזריק לגורי התינוק
    הערה: מנה של 2 מ"ג/mL של IdU ניתן להשתמש עם תאים תרבות הרקמה עם הדגירה 1 h ב 37 ° צ' לפני הקציר ותיוג עבור cy, המוני המוניים.

3. בידוד תאים לתיוג

  1. הפשרה dispase ו קולגן פתרונות מניות. לדלל את הפתרון 20x dispase כדי 1x (1.5 mg/mL) סטרילי HBSS או PBS. לשמור על הקרח עד מוכן לשימוש.
  2. לשלב 2 כרכים של dispase עם אחד הנפח של הקולגן בתוך אמצעי אחסון כולל המאפשר לעור לצוף בחופשיות. לדוגמה, העיכול של 5 עורות של העכבר האנ, ניתן צף על 8 מ ל של 1x dispase עם 4 מ ל של הקוליואז ב 100 מ"מ צלחת פטרי.
  3. עקבו אחר שיטות מאושרות להמתת החסד של עכברים ניסיוניים (למשל, בדיקת מנת יתר/צביטה בבוהן או2 שאיפת שאיפה/צוואר הרחם). נקו את עור האוזן המבוגר בתמיסה של יוד (ראו טבלת חומרים) ושטפו במים סטריליים כאשר תאים מבודדים משמשים לתרבות הרקמה.
  4. מסירים בניתוח את האוזן בבסיס (איור 1A). לשטוף את האוזניים PBS סטרילי כאשר תאים מבודדים היא לשמש לתרבות רקמות. מניחים על יבש 100 מ"מ צלחת פטרי.
  5. להפריד בזהירות קדמית מן העור האחורי על ידי יצירת בתחילה כיס באמצע או בקצה של אזור לחתוך באמצעות מלקחיים עדינים משיכת שני מדפים העור מלבד ( איור 1B-D). המשיכו עם העור הקדמי והאחורי.
    הערה: הוראות מפורטות לנתח את עור התינוק בבית התינוק מסופקים על ידי Litchi ואח '16 בנוסף, השימוש בהיקף מבתר עשוי לסייע בהפרדה בין העור האחורי לבין הזיהוי של האפידרמיס/הצדדים העורי של גזור העור: השיער נראה בצד האפידרמיס ואילו הדרמיס יהיה מראה ז'לטין.
  6. בזהירות מניחים את העורות הקדמי והאחורי של האוזן עם הצד דרמיס של העור נוגע dispase/קולגן הפתרון ( איור 1e). השתמש ב-1 mL עבור העור הקדמי והאחורי של אוזן אחת לכל באר של 12 לוחית התרבות הטובה. מודטה ב 37 מעלות צלזיוס עבור 1 h. לחילופין, לצוף עורות על פתרון 1x dispase ב 4 ° צ' עבור 16-18 h.3
    הערה: עבודה במכסה של תרבות רקמה עם טכניקה סטרילית כאשר התאים הם להיות מתורבתים.
  7. מניחים את העור מתעכל עם הצד האפידרמיס נוגע במשטח של צלחת פטרי נקי. לשטח את העור בעדינות להחליק את האפידרמיס על ידי עבודה מהמרכז לקצוות בתבנית מעגלית.
  8. להיפטר הדרמיס או לעכל את זה עוד כדי לשחרר את הגידולים עבור תרבות רקמות או ניתוח16.
    הערה: דרמיס יהיה כהה יותר במראה יש הרכב הז'לטין ודביק. . זה בסדר. כישלון או קושי בהסרת דרמיס מציע מספיק עיכול רקמות. עם זאת, דגירה מורחבת במאגר העיכול תפחית את הכדאיות בתאים. האפידרמיס יישאר על צלחת פטרי ויהיה מראה מולבן.
  9. להרים בעדינות את האפידרמיס על ידי לתפוס בקצוות ולקלף אותו מעל פני השטח של צלחת פטרי. בזהירות מניחים את האפידרמיס על פתרון התנתקות תא טרום מחומם (ראה טבלת חומרים) עבור 5 דקות ב 37 ° צ' או 20 דקות ב RT. השתמש 500 μl של התנתקות תא פתרון עבור 2 האוזן למבוגרים epidermises לכל טוב של 12 היטב לוחית התרבות ולהשתמש 750 μl של ניתוק התא פתרון לאפידרמיס של תינוק בודד לכל טוב של לוחית של 6 מיטב התרבות.
  10. לתפוס את האפידרמיס באמצעות מלקחיים סטרילי לשפשף על ידי גרירת האפידרמיס נגד החלק התחתון של המנה כדי לנתק תאים. הוסף 1 מ ל של dmem המכיל 1% fbs (0.01 mL) ולעבור דרך בתוך הנפה בתוך מסננת של תא 40 יקרומטר לתוך צינור אוסף. לשטוף היטב עם תוספת 2 מ ל של DMEM ולהוסיף את ההשעיה התא.
  11. צנטריפוגה ב 120 x g עבור 5 דקות. מרוב בזהירות על הסופרנטנט.
  12. השהה מחדש את מסכת התאים ב-1-2 mL של DMEM המכיל 1% FBS. לקבוע את ספירת התא ו-% live של התאים באמצעות טריקון כחול ומכשיר האו ספירה אוטומטי. התאים גלולה כמתואר בשלב 3.11.
    הערה: תאים יכולים להיות מתורבתים במדיה המתאימה לתרבות הרקמה אחרי שלב 3.12. מיכל בן 17

4. תיוג cisplatin טינית כדי לקבוע תאים חיים/מתים

  1. השהה מחדש 1-3 x 106 תאים לכל 1 מ ל של dmm המכיל 25 μm ציספלטין טינית (2.5 μl של מלאי/mL). דגירה של 1 דקות וכיבוי על ידי ליטוף עם נפח שווה של FBS (למשל, 1 mL).
  2. צנטריפוגה ב 120 x g עבור 5 דקות decant הסופר לתוך גביע המכיל אקונומיקה מדולל ולהפוך צינורות לנקז את הפתרון הנותר על מגבת נייר. הקש בעדינות כדי לשחרר את הפתרון הנותר על הגלולה ואת הקיר צדדי של הצינור.
  3. השהה מחדש את הגלולה ב 2 מ ל של Ba+ 2-PBS חינם. התאים גלולה כמתואר בשלב 4.2.
    הערה: מומלץ לתקן תאים אם לא ניתן להכתם מיידית.

5. קיבעון של תאים המסומנים בתווית (אופציונלי)

  1. השהה מחדש 1-3 x 106 תאים מסומנים בלטינית ב 1 מ ל של Ba+ 2-PBS חינם. תאים מערבולת תחת כוח נמוך רציפה ולהוסיף dropwise 1 mL (1 אמצעי אחסון) של מאגר הקיבעון 2x בלטקס. דגירה ב-RT עבור 10 דקות על פלטפורמת נדנדה.
  2. התאים גלולה כמתואר בשלב 4.2, אבל צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דקות.
  3. לשטוף את התאים עם 2 מ ל של Ba+ 2-התאים החינם של PBS ו גלולה כמתואר בשלב 5.2. חזור על שלב 5.3 פעם אחת.
  4. השהה מחדש את הגלולה ב 2 מ ל של Ba+ 2-PBS חינם. חנות ב 4 ° c עבור < 3 ד. הוסף FBS ל 3% (למשל, 0.3 mL של FBS/mL של תאים) של נפח הכולל אם לאחסן יותר > 3 d, ואז לערבב ולהקפיא ב-80 ° c.
    הערה: קיבעון עלול להשפיע על גילוי של אפיסקופים מסוימים. ההשפעות של קיבוע אותות נוגדן צריך להיקבע באמצעות המחשב האמפירי.

6. ברקוד של דגימות (אופציונלי אך מומלץ)

  1. כדוריות התאים כמתואר בשלב 5.2 ולאחר מכן השהה מחדש 1-3 x 106 תאים ב 1 מ ל של מאגר קיבעון 1x (ראה טבלת חומרים). דגירה ב RT עבור 10 דקות. כדוריות התאים כמתואר בשלב 5.2.
  2. שטוף תאים בעלי 1 מ ל של מאגר חדירות ברקוד (ראה טבלת חומרים). התאים גלולה כמתואר בשלב 5.2. חזור על שלב 6.2 פעם אחת.
  3. הוסף 100 μL של מאגר חדירות ברקוד לברקוד (ראה טבלת חומרים)18 ומערבבים מיד בעוד התאים משלב 6.2 הם פלטינג.
  4. השהה מחדש את הגלולה בתא ב-800 μL של מאגר חדירות ברקוד. הוסף פתרון ברקוד לתאים, לערבב ו-דגירה ב RT עבור 30 דקות. התאים גלולה כמתואר בשלב 5.2. שטוף תאים 2 מ ל של מאגר צביעת תאים (ראה טבלת חומרים) וכלי גלולה שוב.
    הערה: ניתן לתייג עד 20 דגימות בצירופים שונים של מתכות של פלדיום18. אסטרטגיות אחרות לכתיבת ברמנים מתוארות במקום אחר15.

7. מתייג תאים לצילנסות המונית

  1. השהה מחדש 1-3 x 106 תאים ב 1 מ ל של החומר הגרעיני אנטיגן מכתים פתרון העבודה (ראה טבלת חומרים). שילוב דגימות לתוך צינורית אחת עבור השלבים הבאים בעת שימוש בדגימות ברקודים. דגירה ב RT עבור 30 דקות. גלולה כמתואר בשלב 5.2.
  2. השהה מחדש 1-3 x 106 תאים ב 2 מ ל של מאגר החדירות הגרעיניות (ראה טבלת חומרים). . קנה מידה לפי הצורך לדוגמה, השתמש 6 mL של מאגר עבור 10 דגימות משולבות עם ספירת תאים של 9 x 106 תאים. גלולה כפי שתוארה בשלב 5.2.
  3. חזור על שלב 7.2. מערבולת בעדינות את הגלולה התא בתוך הכרך השאריות שנשאר בתוך הצינור.
  4. הוסף 50 μL של קוקטייל הנוגדן תאיים לכל 1-3 x 106 תאים. . קנה מידה לפי הצורך לדוגמה, השתמש 150 μL של קוקטייל הנוגדן עבור 10 דגימות משולבות עם ספירת תאים של 9 x 106 תאים. מערבבים ו-דגירה ב-RT עבור 45 דקות. הוסף 2 mL של מאגר צביעת התא ואת הגלולה כפי שמתואר בשלב 5.2.
  5. השהה מחדש 1-3 x 106 תאים גלולה ב 2 מ ל של מאגר צביעת תאים. התאים גלולה כמתואר בשלב 5.2. חזור על שלב 7.5 פעם אחת.
    הערה: פתרונות מאגר אחרים יכולים לשמש לצביעת קרום מערות או סמנים cytoplasmic ו-ניסויים יכול להיות למטב את הצביעת אם יש צורך לזהות אפיסקופים במיקומים סלולריים שונים. תאים יכולים גם להיות קבוע בתוך הכדורגלן אחרי שלב 7.5 כאשר משתמשים בתאים חיים לצביעת.
  6. השהה מחדש 1-3 x 106 תאים ב-1 מ ל של פתרון עיבור וחנות עבור 1-3 d ב -4 ° c.
    1. לאחסן את התאים ב-80 ° c ב-dmso המכיל את הפתרון עבור > 3 ד. כדוריות התאים כמתואר בשלב 5.2 אם התאים נמצאים בפתרון עיבור. להשעות את הגלולה מחדש (1-3 x 106 תאים) ב 1 מ ל של תא צביעת תאים מאגר ו גלולה כמתואר בשלב 5.2. השהה מחדש את הגלולה ב 1 מ ל של 10% DMSO/90% FBS19, העברה להקפאה, מקום במיכל הקפאה איזופרופיל, ולאחסן ב-80 ° c.
  7. התאים גלולה כמתואר בשלב 5.2. לשטוף 1-3 x 106 תאים עם 2 מ ל של תא מכתים מאגר, הפלטינג כפי שמתואר בשלב 5.2. בצע שני שוטף נוסף עם 2 mL מים, הפלטינג כפי שמתואר בשלב 5.2.
  8. לדלל מחרוזת כיול EQ 1:9 במים (פתרון מניות ב 3.3 x 105 חרוזים/mL).
  9. השהה מחדש את הגלולה הסלולרית בריכוז של 1 x 106 תאים/mL בתמיסה מדוללת באמצעות חרוז EQ. לסנן תאים דרך מסננת 35 יקרומטר כובע תזרים צינורות.
  10. הפעל דגימות על cytometer ההמוני ולרכוש נתונים. הנתונים יופקדו בתבנית קובץ מסוג Flow Cy, Standard (FCS).

8. עיבוד וניתוח של מערכות הנתונים המוניות של cy,

  1. נרמל קבצי FCS. השתמש בתוכנה חופשית הזמינה ב https://github.com/nolanlab/bead-normalization/releases/latest20
  2. . בסדר. להפריד את אוכלוסיית ברקוד במאגר לתוך קבצים נפרדים ברקודים עם תוכנה חופשית זמין ב https://github.com/nolanlab/single-cell-debarcoder/releases/latest18
  3. ניתוח קבצי FCS מנורמל. השתמש מסחרי21,22 או תוכניות freeware (ראה web.stanford.edu/group/nolan/resources.html).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טבלה 1 מראה את תשואות התאים הצפויות ויכולת הכדאיות מתוך האוזן של העכבר המבוגר (איור 1) והעור הבין-מחלות בתנאים לא פתולוגיים. הטבלה גם מציגה נתונים מייצגים של בעלי חיים מעורב C57/126 רקע. הוא צפוי כי העור של זנים אחרים יגרום התשואות תאים דומים והviabilities. התשואה המשוערת תלויה על פני השטח של העור ומצביעה על כך שעור התינוק יהיה בחירה טובה יותר לניסויים הדורשים מספר גדול יותר של תאים (שולחן 1). תשואות נמוכות או כדאיות מופחתת (...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר בנייר זה ניתן להשלים בערך 8 h. התוצאה הסופית היא השעיה של תאים מועשר KCs שניתן לנתח עבור ביטוי חלבון באופן תלוי מחזור התא. מספר מחקרים קודמים יש שיטות מתווה לבידוד kcs מעור אדם ועכבר16,25. מחקרים אלה כוללים גם פרוטוקולים עבור בידוד של KCs עבור זרימה cy, מנסה26. עם זאת, פרוטוקול מפורט לא תוארה בעבר המשלב בידוד של KCs עם ניתוח של ביטוי חלבון ודינמיקה מחזור התא באמצעות cy, המונית המוניות.

המשוכה הג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תמיכה עבור עבודה זו הגיע מהמחלקה לדרמטולוגיה, מרכז השערים לרפואה רגנרטיבית באוניברסיטת קולורדו ואוניברסיטת קולורדו (UC) מחלת העור המרכז מורפולוגיה וליבות פנוטיפים (NIAMS P30 AR057212). המחברים מכירים את ה-UC סרטן מרכז זרימה Cy, משאב משותף ותמיכה מענק (NCI P30 CA046934) עבור הפעולה של cytometry המוני ואסירי תודה על קארן הלם וכריסטין צ'יילדס בליבה עבור הייעוץ המומחים שלהם על הזרימה המונית cy, המוני טכניקות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחת 12 בארותטיפול בתא229512
תמיסת אינטרקלטורFluidigm201192A125 ומיקרו; M - תמיסת אינטרקלטור IR
פרפורמלדהידמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית30525-89-416 % 
צינורות זרימת כובע מסננתפישר/קורנינג35223535 ומיקרו; גודל נקבוביות 
מסננת תאיםפישר2236354740 μ גודל נקבוביות 
תמיסת פירוק תאיםCELLnTECCnT-ACCUTASE-100תמיסת יוד Accutase
ThermoFisher/Purdue67618-151-17בטדין 7.5%-קרצוף כירורגי יוד
ברקוד מאגר פרמיביליזציה Fluidigm201060Cell-ID 20-Plex Pd ברקודים
ברקודיםFluidigm201060Cell-ID 20-Plex Pd ברקודים
רצועות pH EMD9590colorpHast
DMEMHycloneSH30022.01Dulbecco' s Modified Eagle Media
מלקחיים עדיניםDumont & Fils0109-5-PODumostar #5
מלקחיים מדויקים מעוקליםDumont & Fils0109-7-PODumostar #7
חרוזי כיולFluidigm201078EQ חרוזי כיול ארבעה אלמנטים
HBSSGibco14175-095תמיסת מלח מאוזנת של האנק
פישרמיםSH30538.03Hyclone ביולוגיה מולקולרית בדרגת מים
Iododeoxyuridine  SigmaI7125IdU
Cryo בקבוקוניםThermoFisher366656PKחוט פנימי
מאגר צביעת תאיםFluidigm201068Maxpar Cell מאגר צביעה
תיקון & מאגר סלסולFluidigm201067Maxpar Fix & מאגר סלסול
תיקון I חוצץנוזלים201065Maxpar Fix I חוצץ
פוספט חוצץ מלחRocklandMB-008ללא מתכת 10x PBS
מיכל הקפאה איזופרופנולThermoFisher5100-0001Mr.Frosty
נתרן הידרוקסידפישרBP359-500NaOH
צלחת פטריKord-Valmark2900סופק על ידי Genesee 32-107 
15 מ"לאולימפוס חרוטי / ג'נסי28-101
50 מ"ל אולימפוס חרוטי/ ג'נסי28-106
צלחת 6 בארותטיפול בתא229506
ציספלטיןסיגמא479306
Dispase IIסיגמא / רוש4942078001
DMSOסיגמאD2650
FBSAtlanta BiologicalsS11150
חומצה הידרוכלוריתפישרA144-212
צביעת אנטיגן גרעיני  מאגר חדירותFluidigm201063
מאגר צביעת אנטיגן גרעיניFluidigm201063
טריפן כחולSigmaT8154
מזרק טוברקוליןBD309626
קולגנאז סוג IV וורת'ינגטון ביוסיינסCLSS-4
PFA

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Guzinska-Ustymowicz, K., Pryczynicz, A., Kemona, A., Czyzewska, J. Correlation between proliferation markers: PCNA, Ki-67, MCM-2 and antiapoptotic protein Bcl-2 in colorectal cancer. Anticancer Research. 29 (8), 3049-3052 (2009).
  2. Ladstein, R. G., Bachmann, I. M., Straume, O., Akslen, L. A. Ki-67 expression is superior to mitotic count and novel proliferation markers PHH3, MCM4 and mitosin as a prognostic factor in thick cutaneous melanoma. BioMedCentral Cancer. 10, 140(2010).
  3. Ryan, W. K. Activation of S6 signaling is associated with cell survival and multinucleation in hyperplastic skin after epidermal loss of AURORA-A Kinase. Cell Death & Differentiation. , (2018).
  4. Magaud, J. P. Double immunocytochemical labeling of cell and tissue samples with monoclonal anti-bromodeoxyuridine. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 37 (10), 1517-1527 (1989).
  5. Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
  6. Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
  7. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  8. Kraemer, P. M., Petersen, D. F., Van Dilla, M. A. DNA constancy in heteroploidy and the stem line theory of tumors. Science. 174 (4010), 714-717 (1971).
  9. Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
  10. Bandura, D. R. Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
  11. Bjornson, Z. B., Nolan, G. P., Fantl, W. J. Single-cell mass cytometry for analysis of immune system functional states. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 484-494 (2013).
  12. http://www.dvssciences.com. , http://www.dvssciences.com (2019).
  13. Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).
  14. Brodie, T. M., Tosevski, V. High-Dimensional Single-Cell Analysis with Mass Cytometry. Current Protocols in Immunology. 118, 5.11.11-15.11.25 (2017).
  15. McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of Visual Experimentation. 122, (2017).
  16. Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).
  17. Zhang, L. Defects in Stratum Corneum Desquamation Are the Predominant Effect of Impaired ABCA12 Function in a Novel Mouse Model of Harlequin Ichthyosis. PLoS One. 11 (8), e0161465(2016).
  18. Zunder, E. R. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
  19. Sumatoh, H. R., Teng, K. W., Cheng, Y., Newell, E. W. Optimization of mass cytometry sample cryopreservation after staining. Cytometry A. 91 (1), 48-61 (2017).
  20. Finck, R. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).
  21. http://www.cytobank.org. , http://www.cytobank.org (2019).
  22. http://www.flowjo.com. , http://www.flowjo.com (2019).
  23. Trowbridge, I. S., Thomas, M. L. CD45: an emerging role as a protein tyrosine phosphatase required for lymphocyte activation and development. Annual Review of Immunology. 12, 85-116 (1994).
  24. Torchia, E. C., Boyd, K., Rehg, J. E., Qu, C., Baker, S. J. EWS/FLI-1 induces rapid onset of myeloid/erythroid leukemia in mice. Molecular and Cellular Biology. 27 (22), 7918-7934 (2007).
  25. Liu, Z. A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue. Journal of Visual Experimentation. (138), (2018).
  26. Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis. Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).
  27. Germain, L. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19 (2), 99-104 (1993).
  28. Fluhr, J. W. Impact of anatomical location on barrier recovery, surface pH and stratum corneum hydration after acute barrier disruption. British Journal of Dermatology. 146 (5), 770-776 (2002).
  29. Webb, A., Li, A., Kaur, P. Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of the skin. Differentiation. 72 (8), 387-395 (2004).
  30. Torchia, E. C., et al. A genetic variant of Aurora kinase A promotes genomic instability leading to highly malignant skin tumors. Cancer Research. 69 (18), 7207-7215 (2009).
  31. Frei, A. P. Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells. Nature Methods. 13 (3), 269-275 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים