פרוטוקול זה מציג כיצד לחיות התמונה ולנתח את meristems apical לירות מכל מיני צמחים שונים באמצעות סריקת מיקרוסקופיה קונפוקלית לייזר.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
קונאפוקלית חי הדמיה של לירות Meristems הפסגה מ שונים זנים של צמחים
במאמר זה
סיכום
תקציר
הפונקציות apical meristem (SAM) לירות כמו מאגר תאי גזע שנשמרת וזה יוצר כמעט לכל רקמות מעל פני הקרקע במהלך הפיתוח postembryonic. פעילותן ואת המורפולוגיה של סאמס לקבוע תכונות אגרונומית חשובים, כגון ארכיטקטורה לירות, הגודל והמספר של איברי הרבייה, וחשוב, התשואה תבואה. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לניתוח המורפולוגיה השטח והן המבנה התאי פנימי של חיים סאמס ממינים שונים דרך מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר. ההליך כולו משלב הכנת המדגם רכישת תמונות תלת מימד (3D) ברזולוציה גבוהה יכול להתבצע במרחק קצר ככל 20 דקות. נדגים כי פרוטוקול זה הוא יעיל ביותר ללמוד לא רק התפרחת סאמס של המין מודל, אלא גם את meristems וגטטיבי של גידולים שונים, מתן כלי פשוט אך רב עוצמה כדי ללמוד את הארגון ואת התפתחות meristems על פני מינים שונים.
מבוא
Meristem הצמח מכיל מאגר של תאי גזע מובחן, ברציפות ומקיימת את צימוח איברים ואת פיתוח1. במהלך הפיתוח postembryonic, כמעט כל רקמות מעל פני הקרקע של צמח נגזרות של meristem apical לירות (SAM). בגידולים, פעילותן ואת גודל את סאם שלה meristems פרחוני נגזר הם קשורים בחוזקה רבים אגרונומית תכונות כגון ארכיטקטורה לירות, פירות ייצור זרע התשואה. לדוגמה, בעגבניה, סאם מוגדל גורמת עלייה הצילומים ואת תפרחת הסתעפות, ולכן התוצאות על מנת לייצר פרח נוסף ופרי איברים2. תירס, גידול בגודל סאם מוביל מספר הזרעים גבוה יותר, התשואה הכוללת3,4. סויה, indeterminacy meristem גם קשורה קשר הדוק עם ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת מנות מדיה והדמיה
- MS צלחות: להוסיף 0.5 x Murashige & Skoog MS בינוני, 1% אגר למים יונים ולאחר מכן התאם את ה-pH ל 5.8 שימוש אשלגן הידרוקסידי פתרון (אופציונלי: להוסיף 1% סוכרוז לגידול צמחים לטווח ארוך). אוטוקלב, יציקת פלטות.
- הדמיה מנות: מילוי פלסטיק צלחות פטרי (6 ס"מ, עומק של 1.5 ס מ) ל- 0.5-0.8 ס מ עם agarose מותכת 1.5%.
2. צימוח
-
תודרנית צמיחה
- לזרוע זרעים סטיריליים על MS צלחות והנח הצלחות מתחת לגיל 4 ° C במשך יומיים. לאחר מכן, להעביר צלחות MS יום קצר (8 שעות אור / כהה 16 h), ב 22 מעלות צלזיוס במשך שבועיים.
- השתלת השתילים אדמה ולצמוח אותם יום קצר (8 שעות אור / כהה 16 h) ב ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כדי להעריך את היעילות של פרוטוקול שלנו וכדי לחקור את המורפולוגיה של meristems של מינים שונים, ערכנו הניסויים קונאפוקלית הדמיה בשידור חי את meristem תפרחת של תודרנית ו את צמח meristems מ עגבניות וגם סויה. זה מחקר, תודרנית אקוטיפ לנדסברג זקופה, עגבניות לדבורי מיקרו-טום, סויה לדבורי וויליאמס 82 שימשו כדוגמאות.
ראה בחלק אורתוגונלית דרך האמצע של תודרנית סם, זה ברור כי PI היה מסוגל כתם על הקירות אופ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאן, אנו מתארים שיטה הדמיה פשוטה שניתן להחיל בחקר לירות apical meristems מצמחים שונים עם מינימאליים, פתיחת שדרה חדש ללמוד ברגולציה meristem בשלבים הן וגטטיבי לבין הרבייה בצמחים מודל ו יבולים. בניגוד SEM ופעולות היסטולוגית מוכתמים, פרוטוקול זה יכול לעזור לחשוף בתצוגת משטח והן מבנים הסלולר פנימי של סאמס, ללא צורך קיבוע הדגימה עתירי עבודה ו/או רקמות חלוקתה צעדים. פרוטוקול זה הוא גם תואם לשיטת הדימות הוקמה עבור הכתבים פלורסצנטיות מבוסס ב סאמס, שעשוי להיות מתן החלטה סלולרית טובה אשר מאפשר לנו לקבל תצוגה תלת-ממדית של דפוסי ביט.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
המחברים מתקן הדמיה מרכז פרדו Bindley Bioscience לגישה הלייזר מיקרוסקופ קונפוקלי סורק, לתמיכה טכנית, ומסכים המחברים מעריך את העזרה של אנדי Schaber במתקן הדמיה Bindley פרדו. פעילות זו מומן על ידי אוניברסיטת פרדו כחלק AgSEED פרשת דרכים מימון לתמוך החקלאות ופיתוח הכפר של אינדיאנה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| אגר פיטו | דוט סיינטיפיק בע"מ | DSA20300-1000 | |
| אגרוז | דוט סיינטיפיק בע"מ | AGLE-500 | |
| מלקחיים | ROBOZ | RS-4955 | Dumont #5SF מלקחיים סופר עדינים גודל קצה אינוקס .025 X .005 מ"מ, לניתוח קודקודי יורה. |
| LSM 880 מיקרוסקופ קונפוקלי זקוף | זייס | ||
| מוראשיג'ה & Skoog MS בינוני | Dot Scientific Inc. | DSM10200-50 | |
| Plan APO 20x/1.1 עדשת טבילה במים | Zeiss | ||
| צלחות פטרי מפלסטיק 100 מ"מ X 15 מ"מ | CELLTREAT מוצרים מדעיים | 229694 | לשימוש להכנת צלחות MS |
| צלחות פטרי מפלסטיק 60 מ"מ X 15 | CELLTREAT מוצרים מדעיים | 229665 שימוש ככלי הדמיה | |
| תערובת ריבוי | Sungro גננות | ||
| Propidium iodide | Acros Organics | 440300250 | תמיסה של 1 מ"ג/מ"ל במים, כדי להכתים את דפנות התא |
| סכין גילוח | PERSONNA | 62-0179 | לחיתוך קודקוד יורה מצמחים |
| סטריאומיקרוסקופ | Nikon | SMZ1000 | |
| Tissue | VWR | 82003-820 | |
| Zen black | Zeiss | תוכנת רכישת תמונות |
מקורות
- Meyerowitz, E. M. Genetic control of cell division patterns in developing plants. Cell. 88 (3), 299-308 (1997).
- Xu, C., et al. A cascade of arabinosyltransferases controls shoot meristem size in tomato. Nature Genetics. 47 (7), 784-792 (2015).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
