מאמר שיטה

הבידוד של העור האנושי על ידי מיון תאים שהופעלו על ידי קרינה פלואורסצנטית ורשתית

18.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59372

⸱

7 במאי 2019

 ,  , 
1Skin, Endothelium Research Division, Department of Dermatology, Medical University of Vienna

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מבוסס-FACS לבידוד של העור האנושי ושרירי הלסת. זה חוסם בתרבות מבחנה אשר היה בלתי נמנע עם פרוטוקול הבידוד הנפוץ ביותר דרך תרבויות ההסבר. ערכות המשנה שמקורם הפיצוץ הם ברורים מבחינה פונקציונלית ולהציג ביטוי גנים דיפרנציאלי ולוקליזציה בתוך dermis.

תקציר

פיברופיצוצים הם אוכלוסיית תאים הטרוגנית מאוד המעורב בפתוגנזה של מחלות אנושיות רבות. ב העור האנושי דרמיס, פיברופיצוצים באופן מסורתי יוחסו הלסת השטחית שטחית או נמוך יותר הרשתית על פי לוקליזציה היסטולוגית שלהם. ב-dermis העכבר, הלסת הימנית והרשתית מקורם בשני שנים שונים עם פונקציות מתפצלות לגבי תהליכים פיסיולוגיים ופתולוגיים ופרופיל ביטוי של משטח התא ברור שבו ניתן להבדיל.

חשוב מכך, הראיות של תרבויות ההסבר מפני שטחי העור שטחיים ותחתונות מראים כי לפחות שתי ברורים מבחינה פונקציונלית העור לינריסטיות לשונות להיות בבית האדם דרמיס גם. עם זאת, בניגוד לעור העכבר, סמנים משטח התא המאפשר אפליה של ערכות משנה שונות בפיברוהפיצוץ עדיין לא הוקמו עבור העור האנושי. פיתחנו פרוטוקול הרומן לבידוד של האדם האנושי והאוכלוסייה הרשתית פיברוקולסט באמצעות הפעלה פלואורסצנטית מיון התא (FACS) באמצעות שני המשטח תא סמנים ההפעלה חלבון (FAP) ו Thymocyte אנטיגן 1 (Thy1)/CD90. שיטה זו מאפשרת בידוד של מערכות שינוי העור טהור ללא מניפולציה מחוץ לגוף, אשר הוכח להשפיע על ביטוי גנים, ובכך מאפשר ניתוח פונקציונלי מדויק של תת-ערכות העור האדם ביחס להומאוסטזיס רקמות או מחלה פתולוגיה.

מבוא

כמו המרכיב התאי העיקרי של רקמת החיבור, פיברופיצוצים הם בעיקר אחראי על התצהיר של קולגן וסיבים אלסטיים כי בסופו של דבר בצורת מטריצה החילוץ1, ולכן, תפקידם בהומאוסטזיס רקמות, התחדשות ו מחלה לא העריכו זמן רב. עם זאת, לאחרונה באים תחת הזרקור של חוקרים, לא רק בגלל שהם מייצגים מקור הסלולר בולט עבור תאים גזע pluriפוטנטי2 אבל גם בגלל הפלסטיות הגבוהה שלהם משתמע הפתוגנזה של מספר רחב של מחלות כגון עוגב פיברוזיס3,4,5 או סרטן6,7.

העור האנושי מורכב האפיתל רב שכבתית, האפידרמיס, ואת רקמת החיבור הבסיסית שלה, דרמיס, אשר יכול להיות מחולק היסטולוגית לתוך הלסת העליונה העליון התחתון דרמיס והוא מורכב בעיקר מפיברוטות ו מטריצה מהיפודרמיס8 והכל. על פי המיקום שלהם בתוך הרקמה, שרירי העור מסווגים בערך לתוך הלסתהראשונהוהרשתית.

חשוב מכך, הנתונים האחרונים מצביעים על כך האוכלוסיות האלה בעלי הפיצוץ העורי הם לא רק להבדיל היסטולוגית, אלא גם כי תפקידם הוא מגוון באופן משמעותי. בעור העכבר, הלסת הימנית והראפיברוט נובעים משני שיננים נפרדים במהלך embryogenesis9. מספר שורות של ראיות מראים כי שתי הדורות להפעיל תפקידים שונים לא רק הומאוסטזיס רקמת, שיער זקיק מורגנזה, תיקון פצע פיברוזיס7,9,10, אבל הם גם להגיב שונים אותות בתאי גזע אפיניסטיים באפידרמיס11, הרומז על תפקידים בפתוגנזה בסרטן. באופן נוח, שני הצדדים לבטא קבוצה ברורה של סמנים הדדית בלעדית בעור העכבר למבוגרים, ובכך מאפשר בידוד של אוכלוסיות בעלי הפנים הטהורה וניתוח נרחב של הפונקציות הספציפיות שלהם ב מבחנה9 , . בסדר, 11

בהתאמה, לפחות שתי קבוצות משנה ברורים עם מורפולוגיה ופונקציות ברורים, כולל שיעורי הפצת התפשטות, שיפוץ רקמות יכולות12,13, כמו גם את היכולת לתמוך בצמיחה של תאי גזע עוריות בתוך מבחנה, תוארו עבור העור האנושי דרמיס14,15. עם זאת, רוב המחקרים שפורסמו על העור האדם פיברופיצוצים נערכו באמצעות מעורבים אוכלוסיות הפיצוץ מבודדים מתרבויות ההסבר מפני מעטפת דרמטלוגיה, מאז מוגדרים ספציפיים תא משטח הסימון המאפשר בידוד של האדם הטהור הלסת או הרשתית החוצה אוכלוסיות הפיצוץ באנלוגיה לדרמיס העכבר היו עדיין להקים.

הדגמנו לאחרונה, כי העור האנושי הלסת ושריפוריות מאופיינים על ידי סמנים משטח התאים הספציפיים המאפשרים בידוד של אוכלוסיות משנה בהתאמה באמצעות מיון תא המופעל באמצעות פלואורסצנטית (FACS)16: fap + CD90- פיברותקיעות מייצגים בעיקר פיברוסופיצוצים ממוקמים בראש dermis העליון, הצגת שיעורי התפשטות גבוהה יותר, חתימת גנים מובחנת אבל לא פוטנציאל adipogenic. FAP+CD90+ fap-CD90+ פיברופיצוצים שייכים השושלת הרשתית של תאי הבית התחתון, אשר הם פחות מתרבים אבל עוברים בקלות אדיפוגנזה-סימן ההיכר לפיברוהריות. שיטה זו מאפשרת לחקור בהרחבה אלה ברורים אוכלוסיות משנה שונות לא רק לגבי הפונקציות הספציפיות שלהם בתנאים פיסיולוגיים אלא גם בהקשר של הפתוגנזה של מחלות עורית כולל סרטן העור.

עם זאת, מאחר שפיברומוקס משנה את ביטוי התאים שלהם בתוך מבחנה דו-ממדית בתרבות החוץ-גופית16,17,19, היישום של הפרוטוקול שלנו מוגבל לבידוד של פיברוהכדורים העיקריים מן האדם דרמיס ואינו מאפשר זיהוי של פיברופסטיות הלסת או הרשתית באוכלוסיות מעורבות בתרבות התא. וחשוב מכך, למרות שהביטוי של סמני פני השטח משתנה באופן מתורבת, הדגמנו שערכות המשנה הפיברובליות מבודדות על פי הפרוטוקול המתואר להלן, שומרות על הפונקציונליות הספציפית שלהם כאשר מטפחים16, וכך מאפשרים במחקרים מיוחדים של מאפיינים ספציפיים לקבוצה בתנאים פיסיולוגיים או פתולוגיים.

לסיכום, פיתחנו פרוטוקול לבידוד של מערכות המשנה שונות לפיברוהפיצוץ באמצעות FACS, כי בפעם הראשונה מאפשר בידוד של אוכלוסיות העור הטהור מפני בעלי חיים במצב נאיבי.

פרוטוקול

עור האדם הושג מגברים לבנים ונשים בגילאי 26 עד 61 שנים (עור מוגן בשמש; תיקוני בטן, הפחתת שדיים). בכתב הסכמה המטופל הודיע התקבל לפני איסוף רקמות בהתאם הצהרת הלסינקי, ובאישור של הוועדה הרפואית של וינה רפואי המועצה לסקירה מוסדית.

הערה: אנו מספקים פרוטוקול לבידוד של אוכלוסיות שונות מבחינה פונקציונלית הפיצוץ משנה או מ בעובי מלאה (נא להתייחס לסעיף 1) או לאחר לפרק את העור האנושי דרמיס לתוך הרבדים השונים שלה (לדלג על סעיף 1 ולהפנות ישירות לסעיף 2) .

1. הכנת מלוא עובי

  1. מניחים 10 ס"מ x 10 ס מ פיסת עור האדם (למשל, מתיקוני הבטן או הפחתת שדיים) עם האפידרמיס הפונה כלפי מטה על נייר סינון עבה.
  2. להחזיק את האפידרמיס בחוזקה על הקצוות שלה עם מלקחיים לגרד את שכבת השומן התת עורית עם אזמל. ואז לחתוך את הרקמה לתוך 5 מילימטר מרצועות רחב לפני לשים אותם לתוך צלחת פטרי.
    הערה: זה מקל על החדירה של Dispase II (המכונה האנזים הנתק מעתה ואילך, ראה סעיף 3) והוא משמש אם האפידרמיס צריך להיות מופרדים מתוך dermis כולו. בסעיף זה דילוג 2 ולהפנות ישירות לסעיף 3. כדי למנוע זיהום, לשמור על הרקמה סטרילי לאחר הסרת כירורגי או לנקות אותו ביסודיות עם אתנול או תמיסת יוד. אם בכלל, טיפול אתנול של פני העור גורם רק מוות תאים מינורי. עבודה תחת תנאים סטריליים. במכסה הזרימה של תרבות הרקמה

2. שכבות של העור האנושי לתוך הלסת והשכבות הרשתית עם דרמטדראום

  1. מניחים פיסת עור בגודל 10 ס"מ או 10 ס מ (למשל, מתיקוני בטן או הפחתת שדיים) על נייר מסנן עבה, עם האפידרמיס הפונה כלפי מעלה. להחזיק את העור הדוק על הקצוות שלה עם מלקחיים.
  2. פורסים את העור ברקמה חשמלית, מותאמת לעובי חיתוך/עומק של 300 μm, על ידי הזזת הראש של מרחק העור מעצמו, כאשר הלהב נמצא בזווית 90 ביחס למשטח המעטפת.
  3. קח את השכבה הראשונה המורכבת של האפידרמיס ואת הלסת הזאת (300 יקרומטר עבה, "שכבת העור 1", איור 1 ואיור 2) ולשים אותו בצלחת פטרי. המשך מיד לסעיף 3 או הוסף 1x PBS כדי למנוע את הרקמה מייבוש.
    הערה: כדי למנוע זיהום, לשמור על רקמות סטרילי לאחר הסרת כירורגי או לנקות אותו ביסודיות עם אתנול או תמיסת יוד. עבודה תחת תנאים סטריליים. במכסה הזרימה של תרבות הרקמה
    זהירות: יש להתמודד בזהירות מרבית מכיוון שהלהבים חדים מאוד.
  4. חזור על השלב 2.2 התאמת הדרמטולי לעובי חיתוך של 700 יקרומטר ופורסים את dermis הנותרים. מניחים את הפרוסה העליונה המוגדרת כ/כפי שהשכבה העליונה של השכבה 2, איור 2) לצלחת פטרי נפרדת. המשך מיד לסעיף 4 או הוסף 1x PBS כדי למנוע את הרקמה מייבוש.
  5. מגרדים את שכבת השומן התת עורית עם אזמל מן השכבה התחתונה התחתון שיורית הרקמה (> 1000 μm) ולמחוק אותו. לאסוף את הרשתית התחתונה ("שכבת העור 3", איור 2) בצלחת פטרי אחרת. המשך מיד לסעיף 4 או הוסף 1x PBS כדי למנוע את הרקמה מייבוש.
    הערה: לחילופין, במקום לגרד את השומן עם אזמל, להסיר את שכבת השומן עם מספריים. זה עשוי לעזור לשים את הדלת הרשתית על הקרח לפני לגרד את השומן משם.

3. הפרדת האפידרמיס והדראמיס

  1. הכן 3 U/mL האנזים הנתק (כלומר, Dispase II) פתרון סטרילי 1 x PBS. מניחים את 5 מילימטר פסים העור (מסעיף 1), או האפידרמיס/הלסת הראשונה (משלב 2.2), עם האפידרמיס פונה כלפי מעלה בצלחת פטרי 10 ס"מ עם 10 מ ל 3 U/mL הנתק פתרון האנזים. מודחת את צלחת פטרי ב 37 ° c עבור 1 h.
    1. ייתכן שהפרוטוקול הושהה כאן. דגירה האפידרמיס/הלסת מיותרת בתוך פרוטאז במקרר ב 4 ° c במקום. כנדרש לאחסן את השכבות האחרות (שכבת העורי 1, 2 ו-3) לילה שקוע ב-1x PBS בצינורות 50 mL ב 4 ° c.
      זהירות: עבוד בזהירות עם פרוטאז, זה עלול לגרות את העור והעיניים על מגע.
  2. לאחר הדגירה, להעביר את האפידרמיס/הלסת העליונה מכסה את המכסה היבש של צלחת פטרי ולהפריד את האפידרמיס מן דרמיס העליון (שכבת העור 1) עם שני מלקחיים כל אחד מחזיק את הקצה של או את האפידרמיס או דרמיס.

4. העיכול האנזימטי של רקמת העור

  1. הגון כל שכבת העורי (שכבת העורי 1, 2 ו-3) בנפרד עם מספריים/אזמל ביסודיות ככל האפשר; ככל שהחלקים קטנים יותר, כך עיכול הרקמה יהיה טוב יותר.
    הערה: קשיחות של דרמיס יכול להשתנות בהתאם לחלק הגוף הוא מקורו (למשל, הבטן או העור העליון הזרוע).
  2. להכין את מיקס העיכול על ידי שילוב 1.25 mg/mL בשנת, 0.5 mg/mL הקולגן השני, 0.5 mg/mL קולגן הרביעי ו0.1 mg/mL hyaluronidase במדיום של הנשר שונה של בינונית (DMPS) עם L-גלוטמין (לראות את הלוח חומרים), 10% סרום העוברי ( FCS) ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין (P/S).
    זהירות: לעבוד בזהירות עם הקולסים כמו אלה עשויים לגרות את העור והעיניים על מגע.
  3. לשים כל אחד הרקמות טחון עם 10 מ ל של תערובת העיכול מוכן לתוך צינור 50 mL ו דגירה ב 37 ° c מקלחת מים חמים עבור 1 h תחת עצבנות קבוע. במהלך העיכול להפוך את הצינורות מספר פעמים.
    הערה: יש לשקול לכוונן את עוצמת העיכול בהתאם לגודל פיסת העור הטחון. אין עומס יתר של 10 מ"ל לערבב העיכול עם רקמות יותר מדי אחרת את התשואה התא יהיה מינימלי. פחות משליש רקמות בתוך הנפח הכולל מומלץ (1:2 w/v).

5. הכנת הבולם היחיד של התא והליזה אריקיטה

  1. להפסיק את העיכול רקמות אנזימטיות על ידי הוספת 10 מ"ל בינוני הפיצוץ (DMEM זיכרון עם L-גלוטמין, 10% FCS ו 1% P/S) לרקמות מתעכל. . תעבוד על הקרח מכאן והלאה
  2. יוצקים את התוכן של כל צינור באמצעות מסננת תה מנירוסטה רגילה לאסוף ההשעיה התא בצלחת פטרי נקי. לשטוף את מסננת עם בינוני ומחית חתיכות רקמה מתעכל עם קצה של מזרק-בוכנה.
  3. לאחר מכן, פיפטה אסף השעיית תא באמצעות מסננת תא 70 יקרומטר לתוך שפופרת 50 mL. לשטוף את מסננת התא עם בינוני ולאסוף זרימת דרך לתוך הצינור אותו.
  4. צינורות צנטריפוגה ב 500 x g ב 4 ° c עבור 10 דקות להסיר ולמחוק supernatant ולשטוף את הגלולה תא עם 5 מ"ל מדיום פיברופיצוץ. חזור על השלב הצנטריפוגה.
  5. להסיר ולמחוק את supernatant ולהשעות את הגלולה ב 1 mL מתוצרת עצמית ACK מאגר הליזה (0.15 M NH4Cl, 10 מ"מ khco3, 0.1 mm Na2edta; pH 7.2 \ u 20127.4). השאר תאים במאגר הליזה למשך כ 1 דקות בטמפרטורת הסביבה (20 \ u201222 ° c).
  6. להפסיק את הליזה על ידי הוספת 9 מ ל של 1x PBS עם 10% FCS ו צנטריפוגה את הצינורות שוב ב 500 x g ב 4 ° c עבור 5 דקות. לבטל את הסופרנטאנט.
    זהירות: זמן הדגירה של הליזה אריתרופויוציה עשוי להיות מותאם אם הפירוק נראה לא שלם (הגלולה האדומה). עם זאת, לא להשאיר את התאים במאגר הליזה אריתרופוזיס למשך זמן רב מדי כדי למנוע הליזה של פיברותקיעות ותאים חיסוניים.

6. חסימת וצביעת פיברוהכדורים עבור FACS

  1. להכין 5 μL של פתרון חסימת הקולטן Fc של האדם ב-100 μL של 1x PBS עם 10% FCS ולהשעות את התאים מחדש ב 100 μL של חוסם Fc האדם. . מודקון על קרח במשך 10 דקות
  2. עיצוב פאנל מכתים של FACS כדי להכתים את הכדורים בעלי העורי האנושי. מערבבים נגד האדם APC FAP (1:20), אנטי אדם CD90 AF700 (1:30), אנטי אדם E-קדהרין PE (1:20), אנטי אדם CD31 FITC (1:30), אנטי אדם CD45 פסיפיק כחול (1:20), אנטי אדם ITGA6 PE (1:20), אנטי אדם CD235ab פסיפיק כחול (1:1000) ואנטי אדם CD106 פסיפיק כחול (1:100) ב-1x PBS עם 10% FCS.
  3. לאחר חסימת קולטן Fc, התאים ספין למטה ב 500 x g ב 4 ° c עבור 3 דקות להסיר ולמחוק את התאים הללו ולהשעות מחדש ב 100 μl של ערבוב נוגדן. מודקון תאים בחושך ב 4 ° c עבור 20 דקות.
    1. לפני כתמים, להסיר 20 μL של מדגם עם מספר תאים גבוה עבור בלתי מוכתם ובודד FACS שולטת כתם.
  4. שטוף את התאים המוכתמים ו-FACS שולטת פעמיים עם 500 μL 1x PBS עם 10% FCS ו צנטריפוגה ב 500 x g ב 4 ° c עבור 3 דקות. בינתיים, להוסיף 4 ′, 6-diamidino-2-פניינידול (DAPI) ל-1x PBS עם 10% FCS לבצע ריכוז סופי של 1 μg/mL.
  5. להסיר ולמחוק supernatant, להשעות מחדש את התאים בפתרון μl dapi 200 ולסנן כל השעיית תא דרך מסננת תא 70 יקרומטר לתוך צינור של 5 mL facs.
    הערה: אם FACS הולך להתבצע עם עיכוב, להוסיף DAPI ולסנן זמן קצר לפני ההקלטה.

7. לאחר האסטרטגיה האנושית לבידוד בידוד ומערכת התקנים

  1. הקלט את הפקדים של זרימת הרשומות, לקבוע הגדרות מתח נכונות ולבצע את הפיצוי המתאים. שער לתאים בודדים וחיים (DAPI-), פסיפיק כחול, PE ו-fitc תאים שליליים (CD45-, CD31-, CD235ab-, CD106-, ITGA6- ו-E-קדהרין-) כדי לקבל שלוש אוכלוסיות הפיצוץ: fap+ CD90-, fap+CD90+ ו fap-CD90+ תאים. ראה איור 3.
  2. מיין שלוש אוכלוסיות הפיצוץ משנה לתוך הנפרד 1.5 mL בורג כובע מיקרוצנטריפוגה צינורות מילא או עם 350 μL מאגר הליזה לבידוד RNA או מלא עם 350 μL הצמיחה פיברוהפיצוץ בינונית (לראות את הטבלה של חומרים) עבור תרבות התא. היפוך צינורות מיד לאחר מיון או לשים צינורות מאגר הליזה לתוך חנקן נוזלי לקפוא או לשים שפופרות בינוניות על הקרח.
    זהירות: הכן מאגר לפירוק עם 0.1% b-Mercaptoethanol בתוך מכסה המנוע ולהימנע משאיפת.

8. שיטת פיברותקיעות ואדיפוגנזה

  1. לאחר FACS, התאים ספין למטה ב 500 x g עבור 3 דקות ב 4 ° צ' ולוחית שוויון מספרי תאים (5000 \ u201210, 000 תאים/ובכן) ב הצמיחה פיברופיצוץ בינונית (לראות את הטבלה של חומרים) ב 48-ובכן מנות תרבות התא. להשאיר את התאים לגדול עד שהם מגיעים 70% השטף.
  2. להוסיף 5 μg/mL אינסולין, 5 μM troglitazone, 0.5 mM 3-isobutyl וטיל-1-מתילקסאתה (IBMX) ו-1 μM dexametone כדי הצמיחה פיברוהפיצוץ בינוני כדי להכין בידול מדיום.
  3. החלף את המדיום של תאים מתורבתים עם בידול בינוני ולתת תאים להבדיל 14 ימים. החלפת מדיום אחרי יום 2 עם מופחת adipogenesis בינונית המכיל 5 μg/mL אינסולין ו 5 μM troglitazone. . לחדש את המדיום כל 3 או 4 יום
  4. תקן את התאים עם 4% בכיוון הכל1 עבור 20 דקות בטמפרטורת הסביבה (20 \ u201222 ° c) בבידול יום 14. רוחצים את הבארות עם 60% איזופנול ומאפשרים לו להתאדות לחלוטין. כתם תאים עם 5 מ"מ שמן אדום O (מסנן לפני השימוש) עבור 20 דקות. שטוף תאים מוכתמים ארבע פעמים עם מים מזוקקים. . המשך לבצע מיקרוסקופ
    זהירות: היחידה לה, רעילה ומזיקה. . טפל בזהירות
    הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן. תאים קבועים ניתן לאחסן ב-1x PBS ב 4 ° צ' עד כתמים שמן אדום O מבוצע. כיסוי הצלחת עם הסרט פרפין לפני האחסון כדי למנוע אידוי.
  5. תאים תמונה שקועים במים עם מיקרוסקופ הפוך בהגדלה 10x עם אור משודר.

תוצאות

סקירה של השלבים העיקריים לעיבוד רקמת העור כדי להשיג השעיית תא בודד מוצג באיור 1, הצגת העור החדש (איור 1a), שכבות עורי שונות (איור 1a), הסרת שומן תת עורית (איור1C) והפרדת האפידרמיס והלסת (איור 1c), כמו גם השלבים השונים של הדיסוציאציה הידנית והפרמטית של הרקמה (איור 1c, F). ערכה של שלוש השכבות העורי מסופקת באיור 2.

איור 3 מציג את אסטרטגיית המחזור של הזרם cy, לנסות כתמים לניתוח של תת מערכות שונות של העור בפיברומה מהעור האנושי. נוסף סמנים פני השטח שאינם מבוטאים באמצעות היתרים לאפשר את החרגה של תאים אחרים שונים נוכח בעור כגון תאים חיסוניים, תאים באפידרמיס, תאי גזע mesenchymal (MSCs), כדוריות דם אדומות או תאי האנדותל להשיג טוהר מקסימלי באוכלוסיות הבודדות. זה לא קריטי להשתמש בלוח FACS זהה בשימוש באיור 2 לזיהוי של אוכלוסיות אלה הפיצוץ הפיברומה, אולם זוהי ההמלצה שלנו. אפשר להשתמש בנוגדנים עם צבעי פלורסנט שונים או לשנות את השילוב של סמנים הדרה.

מתוך הערה, פרוטוקול זה מאפשר זיהוי של שלוש אוכלוסיות המעורשות בעור האדם, הנמצאות עם לוקליזציה שונה בעורי, פרופילי ביטוי גנים ופונקציות גם (איור 4). FAP+CD90- מועשר בלסת הזאת בעוד fap+CD90+ fap-CD90+ הם שופע יותר ב-הרשתית (איור 4a). כל שלושת אוכלוסיות המשנה מציגים את המבנה האופייני לפיברוהגל על מיון בתרבות התא (איור 4B). מעניין, הם שונים לגבי היכולת שלהם להבדיל לתוך adipocytes שהוא סימן ההיכר של שרירי הרשתית. שילוב התוצאות האלה עם ביטוי גנים פרופיל באמצעות תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת (RT-PCR)16 (איור 4c), מראה כי fap+CD90- תאים express רמות גבוהות של סמנים מיוחס בדרך כלל ל שרירי העין CD26, NTN ו-PDPN בעוד CD90+ תאים לבטא את סמני הרשתית הידוע כגון CD36, ACTA2 ו PPARγ ברמות גבוהות, אנו מסיקים כי fap+CD90- תאים שייכים הלסת העליונה וCD90+ תאים שייכים לשושלת השושלת הרשתית.

רצף חיתוך ועיבוד רקמות; חיתוך בשר, צביעת דגימה, סינון וניתוח תמיסות.
איור 1: בידוד של תא בודד הבולם מעור אדם שלם. (א) העור חתוך עם דרמטדרבית חשמלית ללסת ולכיוון ההפוך. (ב) הלסת התחתונה עם האפידרמיס הסמוך הוא 300 יקרומטר עבה (למעלה) בעוד הפינה העליונה של הרשתית הוא 700 יקרומטר עבה (למטה). (ג) שכבת שומן תת עורית מגורד-משומן נמוך יותר עם אזמל. (ד) לאחר הדגירה של הלסת התחתית פתרון אנזים הדיסוציאציה ב 37 ° צ' עבור 1 h, אפידרמיס ניתן בקלות להסיר עם מלקחיים. (ה) שכבות העורי שונות הם כתוש עם מספריים והועברו לתערובת העיכול אנזים המורכב של קולגן האני, II ו-IV ו hyaluronidase. (ו) אחרי 1 h של הדיסוציאציה ב 37 ° צ', העיכול מופסק וההשעיה היא נשפך דרך מסננת תה כדי להסיר חתיכות עור מתעכל. (G) השעיית תא מסונן פעם נוספת באמצעות מסננת תא 70 יקרומטר ו centrifuged ב 500 x G ב 4 ° c עבור 10 דקות. (H) לאחר צנטריפוגה, את הגלולה התא הוא שטף עם 1x PBS עם 10% fcs והוא מוכן עבור כתמים של facs. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

תרשים עור אנושי; שכבות: אפידרמיס, דרמיס פפילרי, דרמיס רשתית, מבנה היפודרמיס.
איור 2: הבנת העור האנושי בשכבות הלסת והרשתית עם דרמטולי. התוכנית המציגה את שלוש השכבות העור שהתקבלו על ידי חיתוך מעטפת בעובי מלא לתוך הלסת התחתונה (כולל אפידרמיס; 0 \ u2012300 μm; שכבת העיצוב 1), הרשתית העליונה (300 \ u20121, 000 μm; שכבת העור 2) ו-מעגל התחתון (ב> 1000 μm; שכבת ה . דרמטדראום אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

דיאגרמות ניתוח ציטומטריית זרימה; מיון תאים, סמני CD, עלילות פיזור, זיהוי פלואורסצנטי.
איור 3: FACS מאשר את האסטרטגיה של האדם החוצה בגידולים תת-מימי. (A\u2012e) ראשית, התאים מגודרת בתאים בודדים (B) ובתאי קיימא (dapi-) (C). התאים החיסוניים (CD45+), תאי גזע mesenchymal (CD106+), כדוריות הדם האדומות (CD235ab+) הם נשלל (C) ותאים שליליים כחולים באוקיינוס השקט מגודרת נוסף על E-קדהרין (ecad) ו ITGA6 תאים שליליים כפולים (ערוץ PE, D ). E-קדהרין ו ITGA6 הם סמנים מבוטא על תאים עוריות. הבא, CD31-FITC תאים חיוביים (אנדותל ותאי הלימפה) אינם נכללים (D) וכתוצאה מכך שלוש אוכלוסיות הפיצוץ ביטוי אחד או שניהם של שני משטח התא בפיברוהפיצוץ סמנים fap ו-CD90: fap+CD90-, Fap+CD90+ fap-CD90+ (E). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

זרימה ציטומטרית, מיקרוסקופיה, ניתוח ביטוי גנים של תאי FAP+ CD90; השוואת נתונים מדעיים.
איור 4: FAP+CD90-, fap+CD90+ ו fap-CD90+ פיברופיצוצים שונים לוקליזציה עורי, ביטוי גנים ופונקציונליות. (א) מגרשים של facs מייצגים של פיברוסוסודים מגודרת מבודדים מהלסת העליונה, הרשתית העליון ושרירי הרשתית התחתון. תכנית הפעולה מוסברת באיור 3. FAP+CD90- פיברותקיעות מועשר בלסת הזאת (19.2%) בהשוואה ליותר נמוך (0.83%) Fap+CD90+ תאים ניתן למצוא ברחבי דרמיס אבל השפע שלהם הוא ברמה הגבוהה ביותר של הרשתית (40.7%). FAP-CD90+ מועשר התחתונה הנמוך ביותר (64.4%). (ב) כל שלושת אוכלוסיות המשנה הממויינות להציג מורפולוגיה טיפוסית לפיברוביסט על התרבות במשך 7 ימים (משמאל). מעניין, הם מתנהגים בצורה שונה בתוך שיטת אדיפוגנזה. לאחר 14 ימים בתרבות, FAP+CD90- לא להבדיל לתוך adipocytes בעוד fap+CD90+ ו fap-CD90+ לעבור בקלות אדיפוגנזה (מימין; שמן אדום O כתמי שומנים בתאי הנושאת אדום). קנה מידה ברים = 1,000 μm. (ג) מיון ישירות fap+CD90- פיברותקיעות לבטא את סמנים הפיצוץ הלסת CD26, NTN1 ו-PDPN, בעוד fap-CD90+ תאים express CD36, ACTA2 ו PPARγ, ידוע להיות ביטא על ידי השושלת הרשתית. * p ≤ 0.05; p ≤ 0.0005 לעומת FAP+/cd90- תאים; p ≤ 0.05; p ≤ 0.0005 לעומת fap-/cd90+ תאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

במאמר זה, אנו מתארים שיטה לבידוד של שרירי הלסת והרשתית מהעור האנושי. CD90 כבר בשימוש נרחב לזיהוי או בידוד של פיברותקיעות העורי18,20,21. עם זאת, הדגמנו כי מלבד CD90 + פיברותקיעות, דרמיס האדם גם הנמלים האוכלוסייה CD90- פיברובלסט המבטא fap16, אשר הוקם כסמן עבור הפעלת פיברוהפיצוצים וסרטן הקשורים התרופות ( Cafs)22,23,24,25. חשוב מאוד, הצלחנו לזהות שלושה אוכלוסיות משנה פיברופ+CD90-, fap+CD90+ fap-CD90+ ב העור ביופסיות מכל התורמים האנושיים בריאים. לפיכך, אנו מסיקים כי FAP הוא לא רק סמן עבור הפעלת פיברוהתקיעות או כקפה, אלא גם רקמות נורמלי הרקמה.

של הערה, האוכלוסייה FAP-CD90- cell הנותרים לאחר היישום של הדרה הנ ל-והפעלת האסטרטגיה אינו מכיל פיברומוט, משום שתאים אלה אינם מתרבים במדיום טיפוח בלתי מתורבת, אבל רוב כנראה לאוכלוסיית תאים מעורבים, כולל תאי לימפציטים וכלי קרום הלב בין השאר16.

התשואה התא המתקבל על ידי שימוש בפרוטוקול הנ ל יכול להשתנות בהתאם הגוף-חלק כי העור המשמש לבידוד מקורו. Dermis מחלקי גוף שונים שונה לגבי המבנה שלה, עובי, כמו גם הלחנה קולגן. לדוגמה, עור מן הפנים או הזרוע העליונה היא רזה הרבה יותר מאשר עור מן הבטן או הירך, אשר גם לעתים קרובות להציג שכבת שומן עבה יותר תת עורית. בנוסף, גיל ומין של תורמים העור יכול להיות עוד יותר לא רק להשפיע על יעילות הדיסוציאציה של הרקמה, אבל יכול גם להשפיע על התפלגות שלוש אוכלוסיות משנה פיברוהפיצוץ (איור 3) כאשר מבודדים מעור עובי מלא. התוצאה היא העובדה כי הלסת הקטנה מתכווץ ומספרים הכולל פיברולסט מפחיתים בגיל11,26,27,28. יתר על כן, את הגלולה תא מתוך הלסת העליונה יהיה כנראה גדול יותר מאשר מעבר הרשתית, מאז דרמיס העליון הוא מאוכלס יותר בצפיפות על ידי הפיברומסטיות מאשר מעבר הרשתית. חוץ מזה, דרמיס התחתון הוא גם קשה יותר צפוף יותר בצפיפות עם קולגן, מה שהופך את זה קשה יותר לנתק את הרקמה ולשחרר את הפיברותקיעות. של הערה, את הגלולה התא עשוי להיראות אדום מאוד, ולכן מומלץ הליזה תא דם אדום מומלצת.

בנוסף לזיהוי של שלוש אוכלוסיות משנה בעור אנושי שלם, אנו גם מראים כי בעור דרמטמד, כל מערכת משנה של פיברובסט מועשרת בלסתהתחתית או הרשתית. חיתוך מדויק של העור עם דרמטלובית הוא קריטי כדי לקבל העשרה נאותה של כל תת האוכלוסייה משכבות העור שונים. מאז דרמיס הלסת הוא דק מאוד, את הפרוסה דרמטמד המייצג אותו לא צריך לחרוג עובי של 300 μm. הרשתית העליונה ופיברומקולריות התחתון הן מייצגות את השושלת הרשתית ולהציג פונקציות דומות וחתימות גנים, לכן, אפשר גם לשקול לא להפריד ביניהם.

חשוב מכל, כל שלוש אוכלוסיות הגידולים מצויים ברחבי הדרסטיות ואינן מקיימות באופן בלעדי בשכבה אחת, ולכן מדוע לחקור את התרבויות מתוך התוצאה של הלסת או הרשתית בתרבויות מעורבות. עם זאת, fap+CD90- הלסת פיברובלסט הם הנפוצים ביותר ב-הלסת התחתונה ולעקוב אחר הדרגתי מן שטחי לשכבות העור התחתון בעוד fap+CD90+ fap-CD90+ פיברופיצוצים לעקוב אחר ה מעבר צבע הופכי לשכבות השטוליות16. יתר על כן, רוב CD90+ פיברותקיעות של הלסת המהירה מצויים כמעט באופן בלעדי כלי הדם המקיפים ולבטא את הסמן הפריסקולרית CD14629, ובכך כנראה התערוכה פונקציות שונות מאשר ה CD146 נותרים- שרירי הרשתית16. CD146 יכול לשמש כסמן נוסף באסטרטגיית העליה כדי להוציא אוכלוסיה זו.

בעקבות הדיסוציאציה של שכבות העורי, התאים המבודדים מוכתמים בקוקטייל נוגדן מעוצב במיוחד המכיל נוגדנים שונים להדרה של תאים חיסוניים, בתאי אנדותל והלימפה, תאים באפידרמיס, אריתרופוציטים ו MSCs כדי ל להשיג אוכלוסיות טהור לפיברוהפיצוץ. של הערה, בחירת סמן לזיהוי ולאי של MSCs עשויה להיות מסובכת בשל המספר הגבוה של הסימונים המתפרסמים MSC30,31. מאז MSCs express CD90 כמו פיברותקיעות, מסמנים נוספים מסוג MSC כגון CD105 או CD271 יכולים להיות שימושיים לזיהוי שלהם. עם זאת, MSCs רק מייצגים אחוז נמוך מאוד של כל התאים הפנים ומאז CD90+ פיברותקיעות תכונות טיפוסיות מורפולוגיים של פיברותקיעות על מיון, אחד יכול לטעון כי הדרה של MSCs על ידי שימוש של סמנים משטח התא נפרד עשוי היות מיותרים.

חשוב, ניתחנו FAP וביטוי הגנים CD90 לאחר שמירה על התאים בתרבות עבור 7-14 ימים לאחר מיון (נתונים לא מוצגים) ומצא כי הביטוי של שני סמנים הוא upregulated בהתאמה חיובי יחיד ממוין (FAP+CD90- or FAP-CD90+) תאים16. לפיכך, אנו מדגישים כי מערכות הסמן והפרוטוקול שתוארו לעיל מאפשרות לבידוד של תת-ערכות של בעלי החיים הראשוניים ישירות מהרקמה, אך לא מן האוכלוסיות המעורבות בגידולים מעורבים.

למרות זאת, אנו מדגימים כי הפונקציונליות של כל שלוש אוכלוסיות משנה נשמרת בתרבות התא ללא קשר לשינוי ביטוי סמן המשטח התא, מאז הפיברוביגים מיון FAP+CD90- הלסת פיברותקיעות לא לרכוש את היכולת לעבור אדיפוגנזה לאחר תקופה ארוכה יותר של תרבות, בעוד הפיברוביריות ממוינות כ-FAP+CD90+ או fap-CD90+ רשתית הריאה לשמור על היכולת שלהם להבדיל לתוך אדיפוציטים 16 . וחשוב מכך, מצאנו גם שגנים ספציפיים ללסת ולרשת מוגדרים עדיין מבוטאים במידה גבוהה יותר ב- fap+CD90-ו-CD90+ בהתאמה.

לסיכום, הקמנו פרוטוקול לבידוד של מערכות המשנה שונות מבחינה פונקציונלית באמצעות FACS, כי בפעם הראשונה מאפשר בידוד וניתוח של אוכלוסיות טהורות ונאיבית הפיצוץ של העור האנושי dermis. שיטה זו מקימה התקדמות מרכזית בדרך כלל בידוד התרבות לחקור את הפרוטוקול מפני דרמיס העליון והתחתון (i) מעבר הדרגתי של הלסת העליונה והרשתית העין קיים מפני העור להיפודרמיס ו (ii) לשנות את חתימת הגנים. שלהם בתוך מבחנה

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

אנו מודים בהכרת התודה ב-FACS-מיון ריינגר וולפגנג באוור. עבודה זו הייתה נתמכת על ידי מענקים ל-B. M. מ הקרן האוסטרית למדעים (FWF: V 525-B28), והפדרציה של אגודות ביוכימיות אירופיות (FEBS, מעקב קרן מחקר). ס. פ. הוא המקבל של מלגת הרופא של האקדמיה האוסטרית למדעים (OeAW). אנו מודים בהכרת תודה על תמיכה מצויינת ממתקני הליבה באוניברסיטת וינה. אנו מודים לברנרד גסיבאואר, כריסטין רדטקה ומרטין וויאושר על הענקת חומר מעור אנושי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>חומר:
3-isobutyl-1-methylxanthineSigmaI5879
אמוניום כלורידSigma9718המשמש למאגר ליזה ACK מתוצרת עצמית
Amniomax-C100 (1x) Basal MediumGibco17001-074המשמש למדיום גידול פיברובלסטים
ובטא;-מרקפטואתנולScharlauME0095זהירות
C100 תוסףThermo Scientific12556015המשמש למדיום גידול פיברובלסטים
קולגנאז IThermo Scientific17100017זהירות
קולגנאז IIGibco17101015זהירות
קולגנאז IVSigmaC5138זהירות
DAPIThermo Scientific62248
DexamethasoneSigmaD8893
Dispase IIRoche4942078001זהירות
Dulbecco' s Modified Eagle Medium + GlutaMAXGibco31966-021
EDTA מלח דיסודיוםSigmaE1644המשמש לייצור עצמי ACK Lysis
Buffer סרום בקר עוברי (מופעל בחום)Gibco10500-064
HyaluronidaseSigmaH4272זהירות
אינסוליןSigmaI5500
IsopropanolMerck1,096,341,011
OilRed OSigmaO-0625
ParaformaldehydSigma158127זהירות סרטני. מגרה את העור והעיניים. טפל בזהירות.
פניצילין/סטרפטומיציןGibco15070-063
תמיסת מלח חוצצת פוספט ללא Ca2+ & Mg2+LonzaBE17-512F
אשלגן ביקרבונטסיגמא237205המשמש למאגר ליזה ACK מתוצרת עצמית
PureLink RNA MicroKitInvitrogen12183-016
SuperScript III סינתזה גדיל ראשון SuperMix עבור qRT-PCRInvitrogen11752
Taqman 2x אוניברסלי PCR Master MixApplied Biosystems4324018זהירות: גורם לגירוי בעור ובעיניים.
TroglitazoneSigmaT2573
NameCompanyCatalog NumberComments
Flow Flow Cytometry נוגדנים:
anti human CD31-AF488Biolegend303109דילול: 1:30, פריט: B213986, RRID: AB_493075
אנטי אנושי CD45-Pacific blueBiolegend304029דילול: 1:20, פריט: B218608, RRID: AB_2174123
אנושי CD49f/ITGA6-PESerotecMCA699PEדילול: 1:20, פריט: 0109, RRID: AB_566833
אנטי אנושי CD90/Thy-1-AF700Biolegend328120דילול: 1:30, פריט: B217250, RRID: AB_2203302
אנטי אנושי CD106-AF421BD744309דילול: 1:100, מגרש: 7170537, RRID: x
אנטי אנושי CD235ab-Pacific blueBiolegend306611דילול: 1:1000, מגרש: B224563, RRID: AB_2248153
אנטי אנושי E-cadherin-PEBiolegend147304דילול: 1:20, מגרש: B197481, RRID: AB_2563040
אנטי אנושי FAP-APCR& DFAB3715Aדילול: 1:20, לוט: AEHI0117111, RRID: x
Human TruStain FcXBiolegend422302דילול: 1:20, לוט: B235080, RRID: x
NameCompanyCatalogComments
ציוד:
1.4 מ"ל צינורות מיקרונייםThermo Scientific4140
1.5 מ"ל מכסה בורג מיקרו צינורSarstedt72,692,405
5 מ"ל פוליסטירן צינור תחתון עגול עם מכסה מסננת תאיםFalcon352235
אשכול תרבית תאים 48 בארותCostar3548
50 מ"ל צינורות קנוניים מפוליפרופילןFalcon352070
70 ומיקרו; מסננת תאים m ניילוןFalcon352350
Aesculap Acculan 3Ti DermatomeVWRAESCGA670
להבי Aesculap DermatomeVWRAESCGB228R
MicroAmp מהיר אופטי 96wellApplied Biosystems4346906
צלחת תרבית תאים ראשוניתCorning353803
להבי אזמלFST10022-00
מסננת תהxx
שםCompanyCatalogComments
מדיום גידול פיברובלסטים:
AmnioMAX מדיום בסיסי עם תוסף AmnioMAX C-100, 10% FCS ו-1% P/S

מקורות

  1. Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblast heterogeneity: more than skin deep. Journal of Cell Science. 117 (Pt 5), 667-675 (2004).
  2. Lowry, W. E., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2883-2888 (2008).
  3. Kisseleva, T. The origin of fibrogenic myofibroblasts in fibrotic liver. Hepatology. 65 (3), 1039-1043 (2017).
  4. LeBleu, V. S., et al. Origin and function of myofibroblasts in kidney fibrosis. Nature Medicine. 19 (8), 1047-1053 (2013).
  5. Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens. Circulation Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).
  6. Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat Rev Cancer. 6 (5), 392-401 (2006).
  7. Rinkevich, Y., et al. Skin fibrosis. Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential. Science. 348 (6232), (2015).
  8. Abhishek, S., Palamadai Krishnan, S. Epidermal Differentiation Complex: A Review on Its Epigenetic Regulation and Potential Drug Targets. Cell Journal. 18 (1), 1-6 (2016).
  9. Driskell, R. R., et al. Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair. Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).
  10. Mastrogiannaki, M., et al. beta-Catenin Stabilization in Skin Fibroblasts Causes Fibrotic Lesions by Preventing Adipocyte Differentiation of the Reticular Dermis. Journal of Investigative Dermatology. 136 (6), 1130-1142 (2016).
  11. Lichtenberger, B. M., Mastrogiannaki, M., Watt, F. M. Epidermal beta-catenin activation remodels the dermis via paracrine signalling to distinct fibroblast lineages. Nature Communications. 7, 10537(2016).
  12. Harper, R. A., Grove, G. Human skin fibroblasts derived from papillary and reticular dermis: differences in growth potential in vitro. Science. 204 (4392), 526-527 (1979).
  13. Hiraoka, C., et al. Two clonal types of human skin fibroblasts with different potentials for proliferation and tissue remodeling ability. Journal of Dermatological Science. 82 (2), 84-94 (2016).
  14. Higgins, C. A., et al. Multifaceted role of hair follicle dermal cells in bioengineered skins. Br Journal of Dermatology. 176 (5), 1259-1269 (2017).
  15. Korosec, A., Lichtenberger, B. M. Ch. 12. Skin Tissue Models. Marques, A. P., Pirraco, R. P., Cerqueira, M., Reis, R. L. , Elsevier. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-810545-0.00012-7 279-301 (2017).
  16. Korosec, A., et al. Lineage identity and location within the dermis determine the function of papillary and reticular fibroblasts in human skin. Journal of Investigative Dermatology. , (2018).
  17. Higgins, C. A., Chen, J. C., Cerise, J. E., Jahoda, C. A., Christiano, A. M. Microenvironmental reprogramming by three-dimensional culture enables dermal papilla cells to induce de novo human hair-follicle growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19679-19688 (2013).
  18. Philippeos, C., et al. Spatial and Single-Cell Transcriptional Profiling Identifies Functionally Distinct Human Dermal Fibroblast Subpopulations. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 811-825 (2018).
  19. Walmsley, G. G., et al. Live fibroblast harvest reveals surface marker shift in vitro. Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (3), 314-321 (2015).
  20. Jiang, D., Rinkevich, Y. Defining Skin Fibroblastic Cell Types Beyond CD90. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 133(2018).
  21. Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblasts-a diverse population at the center of it all. International Review of Cell and Molecular Biology. , 161-214 (2009).
  22. Huang, Y., et al. Isolation of Fibroblast-Activation Protein-Specific Cancer-Associated Fibroblasts. BioMed Research International. 2017, 4825108(2017).
  23. Jiang, G. M., et al. The application of the fibroblast activation protein alpha-targeted immunotherapy strategy. Oncotarget. 7 (22), 33472-33482 (2016).
  24. Pure, E., Blomberg, R. Pro-tumorigenic roles of fibroblast activation protein in cancer: back to the basics. Oncogene. 37 (32), 4343-4357 (2018).
  25. Hamson, E. J., Keane, F. M., Tholen, S., Schilling, O., Gorrell, M. D. Understanding fibroblast activation protein (FAP): substrates, activities, expression and targeting for cancer therapy. PROTEOMICS – Clinical Applications. 8 (5-6), 454-463 (2014).
  26. Gilchrest, B. A. A review of skin ageing and its medical therapy. Br Journal of Dermatology. 135 (6), 867-875 (1996).
  27. Gilchrest, B. A., Krutmann, J. Skin Aging. , Springer. 198(2006).
  28. Makrantonaki, E., Zouboulis, C. C. Molecular mechanisms of skin aging: state of the art. Annals of the New York Academy of Sciences. 1119, 40-50 (2007).
  29. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
  30. Kundrotas, G. Surface markers distinguishing mesenchymal stem cells from fibroblasts. Acta Medica Lituanica. 19 (2), 75-79 (2012).
  31. Lupatov, A. Y., Vdovin, A. S., Vakhrushev, I. V., Poltavtseva, R. A., Yarygin, K. N. Comparative analysis of the expression of surface markers on fibroblasts and fibroblast-like cells isolated from different human tissues. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 158 (4), 537-543 (2015).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

1
הבידוד של העור האנושי על ידי מיון תאים שהופעלו על ידי קרינה פלואורסצנטית ורשתית
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.