Method Article

מיקרוסקופ מעקב חד-מולקולה-כלי לקביעת המדינות התפוצבניות של מולקולות ציטוסולג

DOI:

10.3791/59387

⸱

September 5th, 2019

 , 
1Department of Chemistry, University of Virginia, 2Department of Molecular Physiology & Biological Physics, University of Virginia School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3D מיקרוסקופ לוקליזציה יחיד מולקולה מנוצל כדי לחקור את המיקומים מרחבי ומסלולי תנועה של חלבונים המסומנים באנרגיה בתאי בקטריאלי חיים. פרוטוקול ניתוח הנתונים הניסיוני והמידע המתואר להלן קובע את ההתנהגויות התפוצזות הנפוצות של חלבונים ציטוסולמים בהתבסס על מסלולים בעלי מולקולה בודדת.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופ חד-מולקולות לוקליזציה מטפל בעמדה ובתנועות של מולקולות בודדות בתאים חיים עם עשרות ברזולוציה מרחבית ומאלפית שניה של נאנמטר. יכולות אלה הופכים מיקרוסקופ חד-מולקולות לוקליזציה מתאים באופן אידיאלי לחקר פונקציות ביולוגיות ברמה המולקולרית בסביבות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית. כאן, אנו מדגימים פרוטוקול משולב עבור רכישת ועיבוד/ניתוח של מולקולה בודדת מעקב נתונים כדי לחלץ את המצבים המפזרים שונים חלבון הריבית עשוי להפגין. מידע זה ניתן להשתמש כדי לכמת היווצרות קומפלקס מולקולרי בתאי החיים. אנו מספקים תיאור מפורט של ניסוי לוקליזציה של מולקולה בודדת תלת-ממד המבוסס על המצלמה, כמו גם את הצעדים הבאים עיבוד נתונים התשואה מסלולים של מולקולות בודדות. מסלולים אלה נותחו לאחר מכן באמצעות מסגרת ניתוח מספרית כדי לחלץ את המצבים המפזרים הנפוצים של מולקולות המסומנות באמצעות פלואורוסקופים ואת השפע היחסי של מצבים אלה. מסגרת הניתוח מתבססת על סימולציות סטוכסטיים של מסלולים בראוניים מתחום הדיפוזיה התאית, אשר מוגבלים בגיאומטריה של תאים שרירותיים. בהתבסס על מסלולים מדומים, תמונות raw מולקולה אחת נוצרות ונותחו באותו אופן כמו תמונות ניסיוני. בדרך זו, מגבלות דיוק ודיוק נסיוניות, שקשה לכייל את הניסוי, משולבים באופן מפורש בתהליך הניתוח. מקדם הדיפוזיה ושברי האוכלוסיה היחסיים של מדינות הפיזור הנפוצות נקבעים על-ידי התאמת הפצות הערכים הניסיוניים באמצעות שילובים ליניאריים של הפצות מדומה. אנו מדגימים את השירות של הפרוטוקול שלנו על ידי פתרון המצבים המפזרים של חלבון אשר מציג מצבים מפזרים שונים על יצירת הומו-והטרוסקסואל מתחמים oligomeric ב ציטוסול של פתוגן חיידקי.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בחינת ההתנהגות הbiomolecules מספקת תובנה לתפקודים הביולוגיים. מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית מבוססי הפכו כלים יקרי ערך להתבוננות biomolecules בסביבת התא יליד שלהם. התאוששות פלואורסצנטית לאחר photobleaching לבנה (FRAP) ו ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטית (FCS)1 לספק התנהגויות ממוצעים של הרכב. לעומת זאת, מיקרוסקופ חד-מולקולות לוקליזציה מאפשר התבוננות של מולקולות מתויגות בודדות עם שתייגת מרחבית גבוהה וברזולוציה טמפורלית2,3,4. התבוננות במולקולות בודדות היא יתרון מאחר שחלבון של עניין עשוי להתקיים במצבים מפזרים שונים. לדוגמה, שני מצבים מפזרים בקלות מופיעים כאשר ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. כיול כפולה של נקודת-הכפולה

הערה: התמונות המתוארות בסעיף זה והסעיפים הבאים נרכשים באמצעות מיקרוסקופ הפוך מותאם אישית מובנה, כפי שמתואר ברוצ'ה ואח '23. אותו הליך חל על יישומי מיקרוסקופ שונים המיועדים ללוקליזציה של מולקולה אחת ולמעקב אחר מיקרוסקופ2,3,4. כל תוכנה לרכישת תמונות ועיבוד נתונים המתוארים במאמר זה זמינה (https://github.com/GahlmannLab2014/Single-Molecule-Tracking-Analysis.git).

  1. הכנת רפידות agarose עבור דגימות הרכבה על כיסוי זכוכית שוברי לצפות מתחת למיקרוסקופ.
    1. להוסיף 1.5-2% על יד....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תחת התנאים הניסיוניים המתוארים כאן (20,000 מסגרות, אורך מסלול מינימום של 4 לוקליזציה) ובהתאם לרמות הביטוי של חלבונים היתוך בעלי תוויות פיוז'ן, כ 200-3000 לוקליזציה מניב 10-150 ניתן ליצור מסלולים לכל תא (איור 2a, b). יש צורך במספר רב של מסלולים כדי ליצור התפלגות שנדגמו היטב של מקדמי דיפוזיה לכאורה. בגודל של FOV שנאסף כאן הוא ~ 55 x 55 μm, עם 10 FOV נאסף לכל ניסוי. לכן, כדי להשיג > 5000 מסלולים לכל ניסוי כל FOV צריך להכיל לפחות 50 תאים. באופ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גורם קריטי ליישום המוצלח של הפרוטוקול המוצג הוא לוודא שאותות מולקולות בודדות מופרדים היטב זה מזה (כלומר, הם צריכים להיות דלילים בחלל ובזמן (Mov משלימים 1)). אם יש יותר ממולקולה רואה אחת בתא באותו זמן, לוקליזציה ניתן להקצות באופן שגוי מסלול אחר של מולקולות. הדבר נקרא בעיית הקישור30. תנאים ניסיוניים, כגון רמות ביטוי חלבונים ועוצמת לייזר עירור ניתן לבחור כדי למנוע את בעיית הקישור. עם זאת, טיפול יש לנקוט כדי להשיג מסוג פראי ביטוי חלבון רמות כדי להבטיח תוצאות הנציגה. כאן, השתמשנו allel.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים אלישה אחמוביץ ' וטינג יאן על הקריאה הקריטית של כתב היד. אנו מודים לאד הול, מדען סגל בכיר בקבוצת שירותי המחשוב המתקדם באוניברסיטת וירג, לקבלת עזרה בהקמת רוטינות האופטימיזציה המשמשות בעבודה זו. המימון לעבודה זו סופק על ידי אוניברסיטת וירג.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2,6-חומצה דיאמינופימליתChem Impex International5411הכרחי לגידול של תאי Y. enterocolitica בשימוש.
עדשות 4fThorlabsAC508-080-Af = 80 מ"מ, לייזר 2 אינץ'
514 ננומטרקוהרנטיGenesis MX514 MTMשימוש לעירור פלואורסצנטי
אגרוז Inivtrogen16520100משמש לייצור רפידות ג'ל להרכבת דגימת חיידקים נוזלית על מיקרוסקופ.
אמוניום כלורידסיגמא אולדריץ'A9434M2G מרכיב.
מסנן פס פס ChromaET510/bpמסלול עירור.
עירוי לב מוחSigma Aldrich53286מצע גדילה עבור Y. enterocolitica.
סידן כלוריסיגמא אולדריץ'223506מרכיב M2G.
מצלמה מקור הדמיהDMK 23UP031מצלמה להדמיית ניגודיות פאזה.
מסכת פאזה דיאלקטריתDouble Helix, LLCN/Aמייצרת אות DHPSF.
דיסודיום פוספטסיגמא אולדריץ'795410מרכיב M2G.
חומצה אתילנדיאמינטטראצטיתפישר סיינטיפיקS311-100כלאטים Ca2+. גורם להפרשה ב-T3SS.
מראה היפוךניופורט8892-Kמאפשר מעבר בין מסלולי פלואורסצנטיות וניגודיות פאזה.
fluospheresInvitrogenF8792חרוזים פלואורסצנטיים. 540/560 אורכי גל פליטה ופליטה. קוטר 40 ננומטר.
תלוש כיסוי זכוכיתVWR16004-302# 1.5, 22 מ"מ x 22 מ"מ
גלוקוזChem Impex International811M2G מרכיב.
שמן טבילהOlympusZ-81025מונח על עדשת האובייקט.
ברזל (II) סולפטסיגמא אולדריץ'F0518M2G מרכיב.
מסנן מעבר ארוךSemrockLP02-514RU-25מסלול פליטה.
מגנזיום גופרתיFisher ScientificS25414Aמרכיב M2G.
פלטפורמת מיקרוסקופMad City Labsמותאמת אישיתלמיקרוסקופ הפוך.
חומצה נלידיקסיתSigma AldrichN4382Y. enterocolitica תאים המשמשים עמידים לחומצה נאלידיקסית.
עדשת אובייקטאולימפוס1-U2B99160X, 1.4 NA
מנקה אוזוןNovascanPSD-UV4משמש לסילוק פלואורסצנטיות רקע על החלקות כיסוי זכוכית.
אשלגן פוספטסיגמא אולדריץ'795488מרכיב M2G.
LED אדוםThorlabsM625L3מאיר דגימה להדמיית ניגודיות פאזה. 625 ננומטר.
מצלמת sCMOSHamamatsuORCA-Flash 4.0 V2להדמיית פלואורסצנטיות.
מסנן מעבר קצרChromaET700SP-2P8מסלול פליטה.
עדשת צינורThorlabsAC508-180-Af=180 מ"מ, 2 אינץ'
Yersinia enterocolitica dHOPEMTasdN/A/AStrain AD4442, eYFP-YscQ
צלחת רבע גל בסדר אפסThorlabsWPQ05M-514מסלול עירור.
פלטפורמה מצלמת N

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kapanidis, A. N., Uphoff, S., Stracy, M. Understanding Protein Mobility in Bacteria by Tracking Single Molecules. Journal of Molecular Biology. , (2018).
  2. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule Tracking3D Localization MicroscopyDiffusive States AnalysisFluorescent Bead FiducialDouble Helix Point Spread FunctionMATLAB Data ProcessingApparent Diffusion CoefficientStochastic Simulation FrameworkCytosolic Protein ComplexesBacterial Pathogen Imaging

Related Articles