הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מדידה ישירה של התחייבות KDM1A יעד באמצעות החיסונית מבוססי כימוציל

6.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59390

⸱

13 ביוני 2019

 ,  , 
1Oryzon Genomics

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי למדוד KDM1A מטרת האירוסין בתוך תא אנושי או בעלי חיים, רקמות או דגימות דם שטופלו עם KDM1A מעכבי. הפרוטוקול משתמש תיוג כימית של האנזים KDM1A חינם וקוונפיקציה ישירה של הכיבוש היעד באמצעות החיסונית מבוססי כימופי מבוסס והוא יכול לשמש במחקרים פרה-קליניים וקליניים.

תקציר

הערכה של מעורבות היעד, המוגדרת כאינטראקציה של תרופה עם החלבון שהוא תוכנן עבורו, היא דרישה בסיסית לפרשנות הפעילות הביולוגית של כל תרכובת בתחום הפיתוח של הסמים או בפרויקטי מחקר בסיסיים. ב אפיגנטיקה, היעד התחייבות מוערך לרוב על ידי ניתוח של סמנים proxy במקום מדידת האיחוד של המתחם ליעד. במורד הזרם הביולוגי שנותחו כוללים את אפנון סימן האבן או משתנה הביטוי הגנטי. KDM1A הוא ליזין דמטקלז המסיר קבוצות מתיל מH3K4 מונו ודימתיל, שינוי המשויך להשתקה הביטוי הגנטי. אפנון סמני ה-proxy תלויה בסוג התא ובפונקציה של האיפור הגנטי של התאים שנחקרו, אשר יכול להפוך פרשנות והשוואת מקרה הצלב די קשה. כדי לעקוף בעיות אלה, פרוטוקול רב-תכליתי מוצג כדי להעריך את השפעות המינון ואת הדינמיקה של התחייבות ישירה KDM1A היעד. התיקון תיאר עושה שימוש KDM1A chemoprobe כדי ללכוד ולכמת אנזים עצורים, ניתן להחיל באופן נרחב על תאים או דגימות רקמות ללא צורך שינוי גנטי, יש חלון מצוין של גילוי, והוא יכול לשמש הן עבור מחקר בסיסי וניתוח של דגימות קליניות.

מבוא

ליזין מסוים demethylase 1 (KDM1A)1 הוא demethקלז מעורב בשליטה של תמלול גנים. חלבון זה התפתחה כיעד תרופתי מועמד2 באונקולוגיה; כולל לוקמיה מיאלואידית חריפה3 (AML), מיאלודיספלסטית סינדרום (MDS)4, myelofibrosis (MF)5,6, תא קטן סרטן ריאות (sclc)7; ב מחלת התאים המגל (scd)8,9, ו ב מחלות מערכת העצבים המרכזית כולל מחלת אלצהיימר (AD), טרשת נפוצה (MS); ובתוקפנות10.

רוב התרכובות הKDM1A מעכבות בהתפתחות הקלינית הן נגזרות ציקלופרופילטין ומעכבים את החלבון באמצעות כריכה בעלת כריכת שינוי בעלת הפלאונטי (באופנה). עיכוב של KDM1A גורם ביטוי גנים שינויים, אבל שינויים אלה משתנים מאוד על פני רקמות, סוגי תאים, או מחלות מקרים. עיכוב של KDM1A גם משנה את הסימנים היסטון12, אך שינויים אלה מיוצרים בדרך כלל באופן מקומי באתר מסוים בגנום, והם שוב, רקמות מאוד תאים ספציפיים.

הפרוטוקול פותח כדי למדוד באופן ישיר התחייבות KDM1A היעד בדגימות ביולוגיות והוא ממוטב לשימוש עם מעכבי נגזרות ציקלוקילאמין. הגישה מבוססת על טכנולוגיית אליסה ומנתחת, במקביל, סה כ חופשי (כלומר לא מאוגד על ידי מעכב) KDM1A בתמצית חלבון יליד ממדגם ביולוגי בתוך שיטת שלב מוצק. כצעד הראשון, המדגם הביולוגי הוא להיות לאחר הנוכחות של KDM1A ביולוגית כימית סלקטיבית OG-88113,14, נגזר KDM1A מעכב סלקטיבי אורי-1001 (i, מעכב), חזק מעכבי של KDM1A במחקר קליני פיתוח לטיפול במחלות אונקולוגי. לKDM1A יש IC50 של 120 nM וכולל moiety כריכת אופנה מקושר פוליאתילן ביולוגי גליקול (יתד)-זנב. הגלימה מקושרת בלעדית לKDM1A החופשי, אבל לא לKDM1A המדכא במדגם. לאחר הכריכה כימית, KDM1A המכיל מתחמי במדגם נלכדים על צלחות microtiter עם משטח מצופה streptavidin כדי לקבוע KDM1A חינם, או על צלחות מצופה עם נוגדן לכידת מונושבטיים נגד KDM1A כדי לקבוע את סך KDM1A. לאחר שטיפת, שתי הצלחות הן מודקות עם נוגדן זיהוי anti-KDM1A, שטף שוב, ו-מודעם עם משני HRP מצוח חמור נגד ארנב IgG נוגדן לאיתור באמצעות מצע וכימות זורח על ידי מדידת יחסי יחידות אור (RLU) בלומטר (איור 1).

figure-introduction-1
איור 1. הסכמה של אליסה האנזים מקושר כימית מערכת מערכת לKDM1A יעד התחייבות: A) ההגדרה של סה כ KDM1A באמצעות סנדוויץ ' אליסה ו B) קביעת הKDM1A בחינם באמצעות כימול אליסה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

עקומה סטנדרטית כלולה בשתי צלחות ה-אליסה כדי לאמת את היניאריות של כל אחד מהסטנדרטים. הקביעה של התחייבות KDM1A יעד בכל מדגם מחושבת לאחר מכן כערך יחסי לדגם טרום-מינון או טיפול בכלי רכב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

דגימות הדם הושגו ממכון החקירה של ביודיקה סנט פאו ביאובנק על פי החקיקה הספרדית (האמת Decreto דה Biobancos 1716/2011) ואישור וועדות האתיקה המקומיות. מחקרים עם רקמות בעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות המוסדיות לטיפול ולשימוש בבעלי חיים מעבדתיים (הוראת מועצת הקהילות האירופית 86/609/eec) שהוקמה על ידי הוועדה האתית לניסויים בבעלי חיים ב פראאל-מעגלים מודפסים

1. הכנת דגימות ביולוגיות לצורך הדיגום.

התראה: פרוטוקול זה כרוך בטיפול בדגימות ביולוגיות שעשויות להיות נתונים לבטיחות תעסוקתית ומינהל בריאות (שיטוח ביולוגי) (29 cfr 1910.1030), הוראה 2000/54/EC של הפרלמנט האירופי וה מועצת 18 בספטמבר 2000 או תקנות שוות ערך. בנוסף, הדגימות הביולוגי עשויות להכיל שרידים של תרכובות כימיות פעילות ביולוגית והפרוטוקול עשוי לכלול מניפולציה נוספת של תרכובות כאלה. עיין בגיליון נתוני הבטיחות (SDS) של התרכובות המשמשות לפני תחילת הניסוי והתבונן בקפדנות בכל אמצעי הבטיחות הישימים שנקבעו במרכז המחקר, כולל שימוש בציוד הגנה אישי מספיק (PPE). לבשו בגדי הגנה נאותים והשתמשו במגן מתאים במהלך הניסוי. השמט שאריות ממיכלי הפסולת המתאימים (פסולת ביולוגית/ציטוטוקסיל).

הערה: פרוטוקול זה מתחיל עם תאים או דגימות של נושאים שטופלו עם מעכב KDM1A מטופל או הרכב/פלצבו שלהם שטופלו שליטה3.

  1. תאים מטופלים עם רכב או KDM1A מעכבי בתוך מבחנה
    1. עבור התאים גדל בהשעיה, כמו 10 mL תרבויות, להעביר את ההשעיה לתוך נקי 15 מ"ל צינורות חרוטי ולהמשיך 1.1.3.
    2. עבור תאים חסיד (גדל ב 75 ס"מ2 מבחנות), להסיר את המדיום מן הבקבוקון ולשטוף בקצרה באמצעות 4 מ"ל PBS. נתק את התאים מכלי הקיבול שלהם באמצעות 1.5 mL של 0.5% טריפסין-EDTA במהלך 2-5 דקות (תנאי טריסיזציה עשוי להשתנות, עקוב אחר המלצות הספק לקו התאים), להוסיף 4 מ"ל PBS ולהעביר את התאים לתוך נקי 15 מ"ל צינורות חרוטי.
    3. הכנס את הצינורות בצנטריפוגה העליון ספסל ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 400 x g ב 4 ° c. הסר את הסופרנטאנט, השהה מחדש את הגלולה ב-1 מ ל של ה-PBS באמצעות מיקרופיפטה והעבר את ההשעיה לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 mL.
    4. הכנס את הדגימות בצנטריפוגה מיקרוצינורית וצנטריפוגה אותם במשך 5 דקות ב-400 x g ב -4 ° c. הסר את ה-PBS על ידי השאיפה עם מיקרופיפטה, או שמור את כדורי על הקרח והמשך לשלב 2; או להקפיא את כדורי על קרח יבש ולאחסן אותם ב-80 ° c עד שלב 3.
  2. דגימות מנושאים או בעלי חיים שטופלו עם רכב/פלצבו או KDM1A מעכב
    1. רקמות: חותכים את הרקמה קטן, ≈ 1 ס מ3 חתיכות באמצעות אזמל. להקפיא את חתיכות הרקמות ב N2 נוזלי במיכל dewar ולאחסן אותם ב-80 ° צ' עד שלב 3.
    2. פולימנליים תאי דם מונוליתיים (PBMCs): לדלל 10 מ ל של דם טרי (תהליך מקסימום 2 h לאחר נסיגת הדם) שנאסף K2-edta צינורות עם 2 כרכים של PBS בצינור 50 mL חרוט. לבודד את PBMCs מן הדם באמצעות מסחרית שהתקבלו PBMC הפרדת צינורות לפי הוראות היצרן. לשמור על כדורי על הקרח ולהמשיך לשלב 3.2; או להקפיא את כדורי על קרח יבש ולאחסן אותם ב-80 ° c עד שלב 3.
      הערה: גלולה תא רטוב של 20 כדי 50 μL מכיל ≈ 1 x 107 תאים, בהתאם לגודל התא. גלולה PBMC רטוב שהושג 10 מ ל של דם אנושי בריא יש נפח של ≈ 20 μL ו מכיל ≈ 1 x 107 pbmcs. רקמות או כדורי תא ניתן לאחסן ב-80 º c במשך עד 6 חודשים.

2. הכנת התמיסה

  1. להכין 2 μm OG-881 לעבוד פתרון: לקחת 10 μl להשתמש בודדת לשימוש של 20 מ"מ ב881 דיקה biotinylated הפתרון מניות של 4 ° c מתוך מקרר ארבע מעלות ולהשאיר אותו בטמפרטורת החדר (RT) עבור 10 דקות. להכין את הפתרון 2 μm עובד על ידי דילול סדרתי של OG-881 מ יון ב-PBS, באמצעות מיקרופיפטה עם טיפים לסינון ושינוי הקצה בין שלבי הדילול השונים.
  2. הכינו מעכבי הפרוטאז 10x: לפזר 1 טבליה ב 1 מ ל PBS בצינור מיקרוצנטריפוגה.
  3. הכן את הנפח הרצוי של מאגר לפירוק תאים בגודל 1x עם 25 nM-881 כותונת. עבור כל mL, לערבב 100 μL מסחרית השיגה 10x מאגר לפירוק תאים, 150 μL של 10x פרוטאז מעכבי, 12.5 μL של 2 μM OG-881, ו-737.5 μL של סוג 1 מים מזוקקים כפולים.
  4. באופן אופציונלי להכין את הנפח הרצוי של מאגר לפירוק תא 1x אבל עם 25 ננומטר ORY-1001 במקום OG-881 כמו בשלב 2.3. מעכבי פחות חזקים ניתן להשתמש אך עשוי לדרוש ריכוזים גבוהים יותר, לשימוש בשליטה חיובית עם 100% עיכוב (ראה שלב 3.5).
    הערה: לנקוט צעדים מתאימים כדי למנוע כל זיהום לא מכוון של פתרונות או דגימות עם OG-881 או KDM1A פתרונות מלאי מעכב. כדי לחשב את הנפח הרצוי של מאגר לפירוק תא 1x עם 25 ננומטר OG-881, נניח כי 400 μL נדרש לכל 40 mg של רקמת מרוסק, או 200 μL לכל גלולה רטובה של 107 תאים.

3. הפקת חלבון מקורי

  1. מרקמות:
    1. לרסק ו המגון לתוך ≈ 1 ס מ3 קוביה של רקמה קפואה עם מרגמה ולתקוע מקורר על קרח יבש. מחלקים את הדגימות בבקבוקונים לשימוש יחיד המכיל ≈ 40 מ ג של אבקת רקמות, להימנע מלהפשיר בכל עת. . המשך לשלב 3.1.2 לעיבוד מיידי או לחנות ב-80 ° c.
    2. השהה מחדש 40 מ"ג של אבקת רקמות ב 400 μl של מאגר לוליזיס תא 1x עם 25 ננומטר OG-881, מערבולת עבור 10 s, ולאלץ את המדגם לפחות חמש פעמים באמצעות מחט בוטה בצבע מזרק 18 עד הליזה של הרקמה מושגת האור נחל דלוח צהוב הבולם הכתום הוא השיג. למנוע היווצרות בועה.
    3. המשך לשלב 3.3
  2. מפלטות תא (PBMCs וקווי תא):
    1. להשעות מחדש את הגלולה של ≈ 1 x 107 תאים ב-200 μl של מאגר פירוק תאים 1x המכיל 25 ננומטר OG-881. מערבולת הדגימות לזמן קצר ולשמור אותם על הקרח עבור 5 דקות.
    2. Sonicate דגימות בsonicator באמצעות 3 פולסים של 20 כל אחד ב 45 kHz; שים אותם על קרח. במשך 20 שבין פולסים
      הערה: ברגע שהדגימות הביולוגי הושעו מחדש במאגר הפירוק של תא 1x, שמור אותם על הקרח במשך כל התהליך.
  3. לשמור את הדגימות על הקרח עבור 5 דקות נוספות, מערבולת בקצרה, צנטריפוגה את הדגימות עבור 10 דקות ב 14 000 x g בצנטריפוגה טרום מקורר ב 4 ° c.
  4. באמצעות מיקרופיפטה 1 mL, להעביר את הסופרנטנים לתוך טריים 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה צינורות ולהשאיר אותם על הקרח במהלך 2 h.. המשך לשלב 4
  5. באופן אופציונלי, שליטה חיובית להדמיית 100% התחייבות היעד עשויה להיות מוכנה כדלקמן:
    1. להשעות מחדש את הגלולה תא או אבקת רקמה מתוך רכב או מטופל (מינון מראש) באמצעי האחסון הנדרש של מאגר לליזה תא 1x עם 25 ננומטר ORY-1001 והתהליך כפי שמתואר בשלב 3.1 ל 3.3.
    2. להעביר את supernatants של השליטה החיובית לתוך טרי 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה צינורות ולהשאיר אותם על הקרח עבור 1 h. ORY-1001 במזיד לעכב KDM1A ולחסום את הכריכה כימית.
    3. הוסף 5 μL של 2 μM OG-881 פתרון עבודה על השליטה חיובי supernatant (אמצעי האחסון עבור בקרה חיובית שנוצר מדגם מתוך 40 מ ג) או 2.5 μL של 2 μM OG-881 פתרון עבודה (נפח לפקד חיובי שנוצר ממדגם 107תאים) כדי לקבל אותו OG-881 ריכוז כמו הדגימות האחרות ולהשאיר בקרח במהלך 2 h. המשך לשלב 4.

4. קוונפיקציה של חלבון מקורי באמצעות שיטת ברדפורד

  1. לדלל את המקור מסחרית ברדפורד חלבון שיטת מגיב 5 פעמים עם H2O סוג 1 מים מזוקקים כפול. חשב את הנפח של המינון הנדרש עבור הסכום הכולל של דגימות ותקנים (1 mL לכל מדגם או תקן + 5 מ"ל נפח עודף).
  2. עבור מעגל סרום של שור (BSA), להכין צינור מיקרוצנטריפוגה אחד עם 1 mL מדולל ברדפורד חלבון שיטת הפתרון (ריק) ושבעה צינורות מיקרוצנטריפוגה עם 995 μL של הפתרון שיטת ברדפורד חלבון מדולל. הוסף 5 μL של כל אחד מתקני BSA (ריכוז החל 125 כדי 2,000 μg/mL) לכל אחד 7 צינורות מיקרוצנטריפוגה ולערבב אותם על ידי היפוך בעדינות את הצינורות מספר פעמים. דגירה עבור 5 דקות ב RT.
  3. להעביר את התקנים מדולל לתוך כימיקלים ולקרוא את OD של הריק והסרום פרה אלבומין סטנדרטי בספקטרוסקופיה ב 280 nm.
  4. עבור דגימות ביולוגיות, להכין שפופרת מיקרוצנטריפוגה אחת עם 1 mL מדולל ברדפורד חלבון שיטת הפתרון (ריק) וכמו צינורות מיקרוצנטריפוגה רבים עם 999 μL של מדולל ברדפורד חלבון שיטת מגיב כמו דגימות שצריך להיות כימות. באמצעות שימוש אוטומטי P2 מיקרופיפטה, להוסיף 1 μL של תמצית חלבון יליד מוכן בשלב 3 לכל שפופרת מיקרוצנטריפוגה ולערבב על ידי היפוך בעדינות את הצינורות מספר פעמים. מודקון את הדגימות 5 דקות ב RT.
  5. להעביר את אמצעי האחסון לתוך כימיקלים ולקרוא את OD של דגימות ב ספקטרוסקופיה ב 280 nm.
  6. מעדיפים, המשיכו מיד לשלב 5. לחילופין, אחסן את תמציות החלבון היליד-80 ° צ' עד שלב 5. למנוע הקפאת מחזורי הפשרה.

5. מאיר אליאס לקביעת סה כ וחופשי KDM1A

הערה: המשיכו בטמפרטורת המעבדה ב23-24 ° צ' (RT).

  1. ציפוי של צלחות microtiter עם KDM1A לכידת נוגדן או Streptavidin
    1. סה כ KDM1A אליסה: עבור כל צלחת, להכין 10 מ ל של KDM1A לכידת נוגדן לריכוז הסופי של 2 μg/mL ב PBS. העבר 100 μL לתוך כל טוב של הצלחת.
    2. חינם KDM1A אליסה: עבור כל צלחת, להכין 10 מ ל של streptavidin ב 10 μg/mL ב PBS. העבר 100 μL לתוך כל טוב של הצלחת.
    3. Top-לאטום את הצלחות KDM1A אליסה ללא תשלום עם סרט דביק לבין הלוחות הלילה ב 4 ° c במקרר.
  2. כביסה וחסימת צלחות
    1. קח את הצלחות מהמקרר ולתת להם שיווי משקל סביב 45 דקות ב RT לפני השימוש.
    2. הכנת 1,000 mL לשטוף מאגר (0.1% הרצף ב-PBS) ו 50 mL חסימת מאגר (1% BSA ב-PBS) לכל צלחת.
    3. לשטוף את הצלחות 3 פעמים עם מאגר לשטוף. בשלב זה ובשלבים הבאים, הקש על הצלחת על מגבות נייר לאחר כל צעד כביסה כדי להסיר את הפתרון שיורית.
    4. הוסף 200 μL של חסימת מאגר לכל היותר לשני הצלחות, העליון חותם שתי צלחות עם סרט דביק ו-דגירה 2 h ב RT.
  3. הכנה לדוגמא ביולוגית
    1. לדלל את תמציות חלבון יליד בסוף שלב 3 לריכוז המתאים באמצעות PBS. הריכוז המומלץ ישתנה בהתאם לרמת הביטוי KDM1A במדגם הביולוגי. דוגמאות של טווחים מתאימים הם (1) כדורי תא: 0.5-10 μg לכל טוב. (2) PBMCs: 5-30 μg לכל טוב. (3) רקמת מרוסק (המוח, הריאה, העור): 20-100 μg לכל טוב. שמור את הדגימות על הקרח במהלך ההכנה. במידת האפשר, הפעל ניתוחי שלישיה טכניים.
    2. הכן עיקול רגיל באמצעות rKDM1A אנושי:
      1. כדי להכין את פתרון העבודה KDM1A Standard, ללטף את הנפח המתאים של rKDM1A לריכוז הסופי של 25 pg/μL, להוסיף 75 μL של 2 μM OG-881, ולהשלים עם 1 x PBS לנפח כולל של 6 מ ל בתוך 15 מ"ל שפופרת פלקון. שמור את הפתרון KDM1A תקן העבודה על הקרח במהלך 1 h ולערבב את הפתרון בעדינות על ידי היפוך 15 mL פלקון מספר פעמים כל 20 דקות.
      2. הכינו את סדרת הדילול הסטנדרטית KDM1A ב-1.5 mL בצינורות מיקרוצנטריפוגה בהתאם לטבלה 1 (הכנה סטנדרטית), בנפח מספיק עבור ניתוח הטרילקאט של 2 96 היטב מיקרוטיטר צלחות.
סדרת סטנדרטKDM1A פתרון עבודה רגיל (μL)
(pg KDM1A/טוב)ערוץ הPBS (μL)
2500 ג-*800-
2500800-
1750560240
1250400400
750240560
55W80720
258792
00800
הערה
(1) אמצעי האחסון המוכן לכל דילול מספיק כדי לפעול בטריליטה 2 צלחות של שיטת הספק.
(2) הטווח המומלץ בין 2.5 ל-5,000 pg/טוב
* עבור שליטה שלילית C-, ללא נוגדן זיהוי KDM1A

שולחן 1: הכנה סטנדרטית. כדי להכין את הסדרה הסטנדרטית של חלבון KDM1A, פיפטה את הכרכים המצוינים של פתרון העבודה KDM1A רגיל ו-PBS לתוך שמונה שכותרתו כראוי 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה צינורות.

figure-protocol-1
שולחן 2: עיצוב הצלחת במעמקי הבאר. תקנים (כחול) ודגימות (צהוב) משלב 5.4.2. היו מושחצים לתוך התנוחות המשתקף של צלחת הבאר העמוקה כדי להקל על הטעינה לתוך הצלחות אליסה בעקבות הכיוון של הכחול (סטנדרטי) וצהוב (דגימות) חיצים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

figure-protocol-2
שולחן 3: עיצוב לוחית אליסה. לוח השיטות כולל את עקומת התקן עם כמויות הפחתת היעד רקומביננטי KDM1A (בכחול); דגימות ביולוגיות (ים) בצהוב; ופקדים שליליים מקבילים (מכילים את הדגימות אך לא את נוגדן הזיהוי הראשי) בלבן, שייטענו על צלחות ה-אליסה מלוחית הבאר העמוקה. הריק (0 בעקומה סטנדרטית) מכיל את כל ריאגנטים לכידה ואיתור, אך לא מדגם. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

  1. אליסה
    1. (המשך משלב 5.2.4.) לאחר 2 שעות דגירה, למחוק את מאגר חסימת ולשטוף את לוחיות עם מאגר לשטוף.
    2. להעביר את הדגימות מדולל כראוי (תמציות חלבון מקורי ועקום רגיל משלב 5.3.) לבלוק בקירור 96 לחסום היטב בעקבות התפלגות לוחית המוצגת בטבלה 2 (בלוח הצלחת עמוק).
    3. שמור על הבלוק הזה על הקרח עד pipetting יטוף 100 μL לדוגמה/גם בצלחות ה-Total ו-דיאגנוסטיקה חינם בעקבות התפלגות הצלחת המוצגת בטבלה 3 (עיצוב לוחית הרישוי של אליסה).
    4. דגירה עבור 1 h ב RT, למחוק את הדגימות ולשטוף את הצלחות 5 פעמים עם מאגר לשטוף.
    5. הכינו 20 מ ל של הארנב anti-KDM1A נוגדן זיהוי ב 0.125 μg/mL במאגר חסימת, להוסיף 100 μL לכל טוב בכל צלחת של השיטת, למעט בארות המתאימות לפקדים שליליים C-. העליון-לאטום את הצלחת ו הדגירה 1 h ב RT.
    6. למחוק את הפתרון נוגדן זיהוי ולשטוף את הצלחות 6 פעמים עם מאגר לשטוף.
    7. הכינו 25 מ ל של עז משנית אנטי הארנב נוגדן HRP כדי דילול 1:5000 במאגר חסימת, להוסיף 100 μL לכל טוב לצלחות microtiter; ו-מודטה 1 h ב RT.
  2. גילוי כימומינטאואת
    1. .30 דקות לפני סיום שלב 5.4.7 ותחת תנאי תאורה רכים, מערבבים חלקים שווים של הלומירול ומשפר את התמיסה (10.5 mL: 10.5 mL, עבור 2 צלחות) בבקבוק ענבר ולהשאיר אותו ב-RT.
      הערה: שמור את פתרון העבודה של הלומינול בבקבוק ענבר והימנע מחשיפה ממושכת לכל אור אינטנסיבי. חשיפה לטווח קצר לתאורת מעבדה טיפוסית לא תפגע בפתרון העבודה.
    2. לפחות 20 דקות לפני מדידת האור, לעבור על קורא מיקרופלייט ב 25 ° צ' ולהגדיר את הקריאות 1,000 ms זמן האינטגרציה ו 150 ms זמן להתיישב. הגדרות פרמטר עשויות לדרוש אופטימיזציה בתפקוד הכלי.
    3. אחרי 1 h של דגירה בשלב 5.4.7., למחוק את הפתרון נוגדן משני ולשטוף את הצלחות 6 פעמים עם מאגר לשטוף.
    4. הפיפטה 100 μL לכל היותר של פתרון העבודה של הלומינול (מצע הכימומינטאנמטר) המוכן בשלב 5.5.1. פיפטה לאט מאוד. ולהימנע מהיווצרות בועות השתמש שעון עצר כדי לשלוט על הזמן בין הוספת התוספת של הפתרון ואת מדידת האור של לוחיות ולשמור על הזמן הזה קבוע כדי להשיג שימוש טוב בין שיטת התשובה.
    5. העליון-חותם את הצלחות צנטריפוגה כדי 500 x g ב RT עבור 45 s בצנטריפוגה צלחת לחסל את כל הבועות הנותרים. מודקת את הצלחות עבור 1 דקות על צלחת שייקר ב 100 סל ד.
    6. הכנס את הצלחת בתוך הקורא והשאר אותו למשך 3 דקות כדי לייצב את הטמפרטורה ב -25 ° צ' (ללא דבק). התחל תמיד בצלחת החינם של אליסה.
    7. קרא את יחידות האור היחסיות (RLU) של כל שיטת הצלחות אליסה (KDM1A בחינם וכסה).
    8. שמור והעתק את ערכי RLU הגולמיים מקבצי הנתונים הגולמיים של excel לניתוח נוסף של התוצאות.

6. חישוב התחייבות היעד

  1. בתוכנת גיליון אלקטרוני, חשב את הערכים הכולל של RLU בחינם ו-RLU של דגימות SX ודגימות הפניה REF (מטופל, רכב או מינון טרום-מנה) מתוך שכפול הנתונים הטכניים שלהם מהנתונים הגולמיים שלהם כמפורט להלן:
    1. הזן את הנתונים האישיים Raw RLUi Total ו-Raw RLUi חינם ממקומות ריקים, עקומה סטנדרטית, פקדים שליליים C-ודגימות ביולוגיות (SX ו-REF) לתוך גליון הנתונים של הניתוח (לדוגמה, Excel). כמו כן, הזן את הסכומים (בתוך pg) של KDM1A מתוך עקומת התקן בגליון הנתונים.
    2. חישוב ממוצע Raw RLU, הסטיות הסטנדרטיות σrlu, ומקדם וריאציה של קורות חייםrlu מהנתונים raw חינם Raw ונתוני rlu ללא תשלום עבור כל נקודת נתונים שכפול טכני.
    3. החל את חיסול החריג (דוגמה לטריליטים): עבור כל הנתונים הפנויים rlu כולל של כל היחידות ו-rlu של מקטע מתוך מאגר מידע, החל את הקריטריונים של Grubbs כאשר קורות החיים עבור הטרילקאט > 0.15, ודחה את ערך ה-RLU של החשוד היחיד כאשר
      figure-protocol-3,
      לפיו Z = 1.148 עבור n = 3 ו 90% מרווח ביטחון (CI).
    4. אם חיסול בלתי מושלם הוחל, לחשב מחדש את ממוצע Raw RLU, סטיית תקן σrlu ו-CVrlu מן לא נדחה (Nr) Raw rlu כולל ערכים raw rlu חינם עבור כל נקודת נתונים.
    5. החל את תיקון הרקע: חשב את הערכים הכולל של RLU חינם ו-RLU עבור כל מדגם רגיל, וכל אחד מהדוגמאות SX ו-REF לדוגמה הפניה:
      figure-protocol-4
      figure-protocol-5
  2. מייצגים באופן גרפי את הנתונים כדלקמן:
    1. התווה את הערכים הכולל של Rlu בחינם ו-rlu (ציר Y) ביחס לזיהוי המדגם שלהם (ציר X) בגרף עמודות.
    2. כמו כן, התווה את ערכי ה-RLU (ציר Y) של התקנים בהתוויה של פיזור יחסית לכמות הpg של חלבון rKDM1A (ציר X) עבור מדידות בחינם וכולל, כמו גם קווי מגמה של שורה מקבילים וחישוב ה-r2 (ריבוע הלינארי מקדם מתאם).
  3. חישוב התחייבות היעד (TE); i.e. את אחוז KDM1A כרוך על ידי המעכב KDM1A בכל מדגם SX יחסית למדגם הפניה REF (מטופל, רכב או מינון טרום מדגם) כדלקמן:
    1. חשב את היחס R של הערכים הממוצע של RLU ללא תשלום עבור הדוגמאות SX ו-REF בשם:
      figure-protocol-6
      figure-protocol-7
    2. לאחר מכן לחשב את האירוסין היעד (TE) של המדגם SX as:
      figure-protocol-8
      אופציונלי: (1) אם התבצע שכפול ביולוגי של נסיונות N, כל אחד עם n משכפל טכני; לחשב תחילה את ה-TESX עבור ערכות השכפול הטכניות. לאחר מכן, לחשב את ממוצע ה-TE, SD ואת ערכי קורות החיים עבור ערכת השכפול הביולוגית.
  4. שנה אם קריטריוני קבלת הדרישות מתקיימים: ודא כי (1) רקע הקבלה מקובל והממוצע ריק < 0.05 x 107 rlu; (2) המדגם אוטומטי לאור נעדר ואת RLUs של הפקדים השליליים C-נמצאים מתחת לגבול נמוך של קוונפיקציה (יוסה = ממוצע ריק + 10x SD); (3) העקומה הסטנדרטית rKDM1A היא לינארית ו-r2 ≥ 0.98; (4) הדגימות הביולוגי כוללים ערכי RLU הנופלים בטווח הדינמי והליניארי של השיטת הצריכה הבין ל-יוסה ו-2,500 pg/היטב.
    הערה: שלבים 6.1. ל6.4. יכול להיות אוטומטי בקלות בגליון נתונים אינפיניטסימלי.
  5. יצא את נתוני ה-TE לתוכנה בעלת מקור פתוח או סטטיסטיקה מסחרית של בחירה עבור הייצוג הגרפי של ערכי ה-TE והערכות סטטיסטיות נוספות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

יניאריות of סך הכל וההגדרה חינם KDM1A.

סדרות סטנדרטיות הוכנו כמתואר בשלב 5.3.2., באמצעות 0 עד 2500 pg של אנזים רקומביננטי KDM1A אנושי באורך מלא. ערכי ה-RLU של Total ו-rKDM1A Free העריכו לאמת את היניאריות (איור 2A ו- 2a). נתונים מיוצגים כממוצע מ 3 ניסויים עם 3 משכפל טכני (n) ± SD. ערכי RLU של Total ו חינם KDM1A זוהו ב-PBMCs של האדם מן הדם של 3 מתנדבים עצמאיים הם הציג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול המוצג כאן פותחה כדי למדוד ישירות KDM1A היעד באמצעות רומן KDM1A chemoprobe ללכוד מבוסס אליסה. השיטה אומתה על קווי הגוף האנושי התרבותי ודגימות vivo לשעבר מן האדם, עכברוש ועכבר בבון (כולל PBMCs, ריאות, המוח, העור, גידולים), אבל יכול להיות מיושם בקלות על מינים אחרים שבו KDM1A נוגדן היעד אפיסקופים ו קטליטי המרכז משומרו. כמו OG-881 הוא מבוסס על פעילות כימית, איכות המדגם חשוב מניפולציה נאותה שימור של דגימות צריך להיות נרדף במיוחד במהלך השלבים הראשוניים של הפרוטוקול, כדי להבטיח את הפעילות KDM1A הוא שימור.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחבר תמרה Maes הוא מנהל בכיר ובעלי מניות, ואת המחברים כריסטינה Mascaró ו רקל רואיז רודריגז הם עובדי Oryzon גנומיקה דרום אמריקה Oryzon גנומיקה מפתחת KDM1A מעכבי ומחזיק פטנטים כיסוי תרכובות ושיטות המשמשות במאמר זה.

תודות

מחקר זה ממומן על ידי Oryzon גנומיקה. דרום אמריקה, הופמן-לה רוש, ונתמך באופן חלקי על ידי CIIP-20152001 ו RETOS תוכנית שיתוף פעולה RTC-2015-3332-1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0,05% טריפסין-EDTA (1X)תרמו מדעי#25300-062
10 X טבליות מעכב פרוטאזRoche#11836153001
96 בלוק אחסון באר עמוקVWR#734-1679
96 באר צלחות ELISANunc#436110
דבק שחור סרט דבקפרקין אלמר#6050173
דבק סרט שקוףVWR#60941-062
בדיקה ביוטינילית KDM1A OG-881Oryzon Genomics SA
בקר סרום אלבומיןסיגמא# 3117057001
בקר סרום אלבומין סטנדרטי תרמומדעי#23208)
ברדפורד בדיקת חלבוןBioRad#500-0001
מאגר ליזה תאים 10Xאיתות תאים#9803
צנטריפוגה לצלחות 96 בארHettichRotina 420R
בקבוקתרמו מדעי#156499
באורך מלא, פעיל אנזימטית אנושי רקומביננטי LSD1 / KDM1Aמוטיב פעיל#31426
Graphpad Prism 5 פרויקטGraphPad תוכנהNA
לומינול-אנהאסר ותמיסת מי חמצן (מצע כימילומינסנט )Thermo Scientific#37074
מיקרו צנטריפוגהאפנדורף5415 R
קורא מיקרופלייט אינסופי 200-TecanTecan אינסופי 200
עכבר נוגדן לכידת חד שבטי Anti-KDM1A (N-terminal epitope)Abcam#ab53269
מחט G18 מד קההBD#303129
ORY-1001 (iadademstat)Oryzon Genomics S.A.
צינורות הפרדה NA PBMC 10 מ"לגריינר ביו-וואן#163288
צינורות הפרדה PBMC 50 מ"לגריינר ביו-וואן#227288
PBS 1xסיגמא#D8537
שייקר צלחותמכשירי היידולףרוטמקס 120
פוליסורבט 20סיגמא#P7949
נוגדן לזיהוי חד שבטי של ארנב אנטי-KDM1A (אפיטופ C-terminal)איתות תאים#672184BF-100
נוגדן משני חמור מצומד פרוקסידאז אנטי ארנב IgGThermo Scientific#31458
ספקטרופוטומטר קובטה 1.5Deltalab#302100
ספקטרופוטומטר לקובטGE HealthcareGeneQuant 1300
StreptavidinPromega#Z704A
מזרקBD#303172
סוג 1 מים טהוריםבמיוחד MilliporeMilli-Q Advantage A10
מנקה אולטרסאונדVWRUSC200T
NA

מקורות

  1. Shi, Y. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell. 119 (7), 941-953 (2004).
  2. Maiques-Diaz, A., Somervaille, T. C. LSD1: biologic roles and therapeutic targeting. Epigenomics. 8 (8), 1103-1116 (2016).
  3. Maes, T. ORY-1001, a Potent and Selective Covalent KDM1A Inhibitor, for the Treatment of Acute Leukemia. Cancer Cell. 33 (3), 495-511 (2018).
  4. Sugino, N. A novel LSD1 inhibitor NCD38 ameliorates MDS-related leukemia with complex karyotype by attenuating leukemia programs via activating super-enhancers. Leukemia. 31 (11), 2303-2314 (2017).
  5. Kleppe, M., Shank, K., Efthymia, P., Riehnhoff, H., Levine, R. L. Lysine-Specific Histone Demethylase, LSD1, (KDM1A) As a Novel Therapeutic Target in Myeloproliferative Neoplasms. Blood. 126, 601(2015).
  6. Jutzi, J. S., et al. LSD1 Inhibition Prolongs Survival in Mouse Models of MPN by Selectively Targeting the Disease Clone. HemaSphere. 2 (3), 54(2018).
  7. Mohammad, H. P. DNA Hypomethylation Signature Predicts Antitumor Activity of LSD1 Inhibitors in SCLC. Cancer Cell. 28 (1), 57-69 (2015).
  8. Rivers, A., et al. RN-1, a potent and selective lysine-specific demethylase 1 inhibitor, increases γ-globin expression, F reticulocytes, and F cells in a sickle cell disease mouse model. Experimental Hematology. 43 (7), 546-553 (2015).
  9. Rivers, A. Oral administration of the LSD1 inhibitor ORY-3001 increases fetal hemoglobin in sickle cell mice and baboons. Experimental Hematology. 67, 60-64 (2018).
  10. Buesa, C., et al. The dual LSD1/MAO-B inhibitor ORY-2001 prevents the development of the memory deficit in samp8 mice through induction of neuronal plasticity and reduction of neuroinflammation. Alzheimer’s & Dementia. 11 (7), P905(2015).
  11. Schmidt, D. M., McCafferty, D. G. Trans-2-Phenylcyclopropylamine is a mechanism-based inactivator of the histone demethylase LSD1. Biochemistry. 46 (14), 4408-4416 (2007).
  12. Forneris, F., Binda, C., Vanoni, M. A., Battaglioli, E., Mattevi, A. Human histone demethylase LSD1 reads the histone code. Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41360-41365 (2005).
  13. Oryzon Genomics, Methods to determine kdm1a target engagement and chemoprobes useful therefor. , WO2017158136 (2016).
  14. Mascaró, C., Ortega, A., Carceller, E., Rruiz Rodriguez, R., Cicero, F., Lunardi, S., Yu, L., Hilbert, M., Maes, T. Chemoprobe-based assays of histone lysine demethylase 1A target occupation enable in vivo pharmacokinetics and -dynamics studies of KDM1A inhibitors. Journal of Biological Chemistry. , In Press (2019).
  15. Rodriguez-Suarez, R. Development of Homogeneous Nonradioactive Methyltransferase and Demethylase Assays Targeting Histone H3 Lysine 4. Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 49-58 (2011).
  16. Lynch, J. T., Cockerill, M. J., Hitchin, J. R., Wiseman, D. H., Somervaille, T. C. CD86 expression as a surrogate cellular biomarker for pharmacological inhibition of the histone demethylase lysine-specific demethylase 1. Analytical Biochemistry. 442 (1), 104-106 (2013).
  17. Schulz-Fincke, J. Structure-activity studies on N-Substituted tranylcypromine derivatives lead to selective inhibitors of lysine specific demethylase 1 (LSD1) and potent inducers of leukemic cell differentiation. European Journal of Medicinal Chemistry. 144, 52-67 (2018).
  18. Ishii, T., et al. CETSA quantitatively verifies in vivo target engagement of novel RIPK1 inhibitors in various biospecimens. Scientific Report. 7, 13000(2017).
  19. Maes, T. ORY-2001: An Epigenetic drug for the treatment of cognition defects in Alzheimer’s disease and other neurodegenerative disorders. Alzheimer’s & Dementia. 12 (7), P1192(2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ImmunoassayKDM1AELISAAnti KDM1A
מדידה ישירה של התחייבות KDM1A יעד באמצעות החיסונית מבוססי כימוציל
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.