כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי למדוד KDM1A מטרת האירוסין בתוך תא אנושי או בעלי חיים, רקמות או דגימות דם שטופלו עם KDM1A מעכבי. הפרוטוקול משתמש תיוג כימית של האנזים KDM1A חינם וקוונפיקציה ישירה של הכיבוש היעד באמצעות החיסונית מבוססי כימופי מבוסס והוא יכול לשמש במחקרים פרה-קליניים וקליניים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מדידה ישירה של התחייבות KDM1A יעד באמצעות החיסונית מבוססי כימוציל
במאמר זה
סיכום
תקציר
הערכה של מעורבות היעד, המוגדרת כאינטראקציה של תרופה עם החלבון שהוא תוכנן עבורו, היא דרישה בסיסית לפרשנות הפעילות הביולוגית של כל תרכובת בתחום הפיתוח של הסמים או בפרויקטי מחקר בסיסיים. ב אפיגנטיקה, היעד התחייבות מוערך לרוב על ידי ניתוח של סמנים proxy במקום מדידת האיחוד של המתחם ליעד. במורד הזרם הביולוגי שנותחו כוללים את אפנון סימן האבן או משתנה הביטוי הגנטי. KDM1A הוא ליזין דמטקלז המסיר קבוצות מתיל מH3K4 מונו ודימתיל, שינוי המשויך להשתקה הביטוי הגנטי. אפנון סמני ה-proxy תלויה בסוג התא ובפונקציה של האיפור הגנטי של התאים שנחקרו, אשר יכול להפוך פרשנות והשוואת מקרה הצלב די קשה. כדי לעקוף בעיות אלה, פרוטוקול רב-תכליתי מוצג כדי להעריך את השפעות המינון ואת הדינמיקה של התחייבות ישירה KDM1A היעד. התיקון תיאר עושה שימוש KDM1A chemoprobe כדי ללכוד ולכמת אנזים עצורים, ניתן להחיל באופן נרחב על תאים או דגימות רקמות ללא צורך שינוי גנטי, יש חלון מצוין של גילוי, והוא יכול לשמש הן עבור מחקר בסיסי וניתוח של דגימות קליניות.
מבוא
ליזין מסוים demethylase 1 (KDM1A)1 הוא demethקלז מעורב בשליטה של תמלול גנים. חלבון זה התפתחה כיעד תרופתי מועמד2 באונקולוגיה; כולל לוקמיה מיאלואידית חריפה3 (AML), מיאלודיספלסטית סינדרום (MDS)4, myelofibrosis (MF)5,6, תא קטן סרטן ריאות (sclc)7; ב מחלת התאים המגל (scd)8,9, ו ב מחלות מערכת העצבים המרכזית כולל מחלת אלצהיימר (AD), טרשת נפוצה (MS); ובתוקפנות10.
רוב התרכובות הKDM1A מעכבות בה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
דגימות הדם הושגו ממכון החקירה של ביודיקה סנט פאו ביאובנק על פי החקיקה הספרדית (האמת Decreto דה Biobancos 1716/2011) ואישור וועדות האתיקה המקומיות. מחקרים עם רקמות בעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות המוסדיות לטיפול ולשימוש בבעלי חיים מעבדתיים (הוראת מועצת הקהילות האירופית 86/609/eec) שהוקמה על ידי הוועדה האתית לניסויים בבעלי חיים ב פראאל-מעגלים מודפסים
1. הכנת דגימות ביולוגיות לצורך הדיגום.
התראה: פרוטוקול זה כרוך בטיפול בדגימות ביולוגיות שעשויות להיות נתונים לבטיחות תעסוקתית ומינהל בריאות (שיטוח ביולוגי) (29 cfr 1910.1030), הוראה 2000/54/EC של הפרלמנט האירופי וה מועצת 18 בספטמבר 2000 או תקנות שוות ערך. בנוסף, ה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
יניאריות of סך הכל וההגדרה חינם KDM1A.
סדרות סטנדרטיות הוכנו כמתואר בשלב 5.3.2., באמצעות 0 עד 2500 pg של אנזים רקומביננטי KDM1A אנושי באורך מלא. ערכי ה-RLU של Total ו-rKDM1A Free העריכו לאמת את היניאריות (איור 2A ו- 2a). נתונים מיוצגים כממוצע מ 3 ניסויים עם 3 משכפל טכני (n) ± SD. ערכי RLU של Total ו חינם KDM1A זוהו ב-PBMCs של האדם מן הדם של 3 מתנדבים עצמאיים הם הציג.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקול המוצג כאן פותחה כדי למדוד ישירות KDM1A היעד באמצעות רומן KDM1A chemoprobe ללכוד מבוסס אליסה. השיטה אומתה על קווי הגוף האנושי התרבותי ודגימות vivo לשעבר מן האדם, עכברוש ועכבר בבון (כולל PBMCs, ריאות, המוח, העור, גידולים), אבל יכול להיות מיושם בקלות על מינים אחרים שבו KDM1A נוגדן היעד אפיסקופים ו קטליטי המרכז משומרו. כמו OG-881 הוא מבוסס על פעילות כימית, איכות המדגם חשוב מניפולציה נאותה שימור של דגימות צריך להיות נרדף במיוחד במהלך השלבים הראשוניים של הפרוטוקול, כדי להבטיח את הפעילות KDM1A הוא שימור.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחבר תמרה Maes הוא מנהל בכיר ובעלי מניות, ואת המחברים כריסטינה Mascaró ו רקל רואיז רודריגז הם עובדי Oryzon גנומיקה דרום אמריקה Oryzon גנומיקה מפתחת KDM1A מעכבי ומחזיק פטנטים כיסוי תרכובות ושיטות המשמשות במאמר זה.
תודות
מחקר זה ממומן על ידי Oryzon גנומיקה. דרום אמריקה, הופמן-לה רוש, ונתמך באופן חלקי על ידי CIIP-20152001 ו RETOS תוכנית שיתוף פעולה RTC-2015-3332-1.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0,05% טריפסין-EDTA (1X) | תרמו מדעי | #25300-062 | |
| 10 X טבליות מעכב פרוטאז | Roche | #11836153001 | |
| 96 בלוק אחסון באר עמוק | VWR | #734-1679 | |
| 96 באר צלחות ELISA | Nunc | #436110 | |
| דבק שחור סרט דבק | פרקין אלמר | #6050173 | |
| דבק סרט שקוף | VWR | #60941-062 | |
| בדיקה ביוטינילית KDM1A OG-881 | Oryzon Genomics SA | ||
| בקר סרום אלבומין | סיגמא | # 3117057001 | |
| בקר סרום אלבומין סטנדרטי תרמו | מדעי | #23208) | |
| ברדפורד בדיקת חלבון | BioRad | #500-0001 | |
| מאגר ליזה תאים 10X | איתות תאים | #9803 | |
| צנטריפוגה לצלחות 96 באר | Hettich | Rotina 420R | |
| בקבוק | תרמו מדעי | #156499 | |
| באורך מלא, פעיל אנזימטית אנושי רקומביננטי LSD1 / KDM1A | מוטיב פעיל | #31426 | |
| Graphpad Prism 5 פרויקט | GraphPad תוכנה | NA | |
| לומינול-אנהאסר ותמיסת מי חמצן (מצע כימילומינסנט ) | Thermo Scientific | #37074 | |
| מיקרו צנטריפוגה | אפנדורף | 5415 R | |
| קורא מיקרופלייט אינסופי 200-Tecan | Tecan אינסופי 200 | ||
| עכבר נוגדן לכידת חד שבטי Anti-KDM1A (N-terminal epitope) | Abcam | #ab53269 | |
| מחט G18 מד קהה | BD | #303129 | |
| ORY-1001 (iadademstat) | Oryzon Genomics S.A. | ||
| צינורות הפרדה NA PBMC 10 מ"ל | גריינר ביו-וואן | #163288 | |
| צינורות הפרדה PBMC 50 מ"ל | גריינר ביו-וואן | #227288 | |
| PBS 1x | סיגמא | #D8537 | |
| שייקר צלחות | מכשירי היידולף | רוטמקס 120 | |
| פוליסורבט 20 | סיגמא | #P7949 | |
| נוגדן לזיהוי חד שבטי של ארנב אנטי-KDM1A (אפיטופ C-terminal) | איתות תאים | #672184BF-100 | |
| נוגדן משני חמור מצומד פרוקסידאז אנטי ארנב IgG | Thermo Scientific | #31458 | |
| ספקטרופוטומטר קובטה 1.5 | Deltalab | #302100 | |
| ספקטרופוטומטר לקובט | GE Healthcare | GeneQuant 1300 | |
| Streptavidin | Promega | #Z704A | |
| מזרק | BD | #303172 | |
| סוג 1 מים טהורים | במיוחד Millipore | Milli-Q Advantage A10 | |
| מנקה אולטרסאונד | VWR | USC200T |
מקורות
- Shi, Y. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell. 119 (7), 941-953 (2004).
- Maiques-Diaz, A., Somervaille, T. C. LSD1: biologic roles and therapeutic targeting. Epigenomics. 8 (8), 1103-1116 (2016).
- Maes, T.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
