הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Opsonophagocytic הריגה הנועד להעריך תגובות אימונולוגי נגד פתוגנים חיידקיים

13K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59400

⸱

5 באפריל 2019

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Center for Molecular Medicine and Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

במאמר זה

סיכום

שיטת ההרג הזה opsonophagocytic משמש כדי להשוות את היכולת של תאים חיסוניים phagocytic להגיב ולהרוג חיידקים בהתבסס על טיפולים שונים ו/או תנאים. באופן קלאסי, assay הזה משמש תקן זהב להערכת אפקטור פונקציות של נוגדנים שהועלו נגד חיידק בשם opsonin.

תקציר

היבט מרכזי של התגובה החיסונית מושבת חיידקים של הפונדקאי היא phagocytosis. Assay הריגה opsonophagocytic (OPKA) הוא תהליך ניסוי שבו תאים phagocytic הם תרבותי משותף עם יחידות חיידקי. תאים חיסוניים phagocytose ולהרוג את התרבויות חיידקי באופן תלוי-המשלים. היעילות של ההרג בתיווך החיסון התא תלויה במספר גורמים, והוא יכול לשמש כדי לקבוע כמה שונה בקטריאלי תרבויות להשוות מבחינת עמידות בפני מוות של תאים. בדרך זו, וצריך להעריך את היעילות של פוטנציאל הרפוי המבוסס על החיסון נגד זני חיידקים ספציפיים ו/או אשר נגרמו מהזנים אליהם. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים OPKA מפושטת אשר מנצל תנאים בסיסיים תרבות ותא לספור כדי לקבוע את הכדאיות תא החיידק אחרי תרבות משותפת עם הטיפול והתנאים תאים חיסוניים HL-60. בשיטה זו יש כבר מנוצל בהצלחה עם מספר שונה pneumococcal אשר נגרמו מהזנים אליהם, הסיבה acapsular זנים, ואת מיני חיידקים אחרים. היתרונות של פרוטוקול זה OPKA הם הפשטות שלה, צדדיות (כמו assay זו אינה מוגבלת נוגדן טיפולים כמו opsonins), ומינימיזציה של ריאגנטים להעריך קבוצות מעבדה בסיסית וזמן.

מבוא

Opsonophagocytic הורגת assay (OPKA) הוא כלי חיוני עבור קישור שינויים במבנה חיידקי או פונקציה לשינויים הבאים התגובה החיסונית ותפקוד. ככזה, הוא משמש לעתים קרובות כמו assay משלימים כדי לקבוע המבוסס על החיסון יעילותם של טיפולים נוגדן, חיסון מועמדים, אנזים אופטימיזציה, וכו '. בזמן מבחני ויוו נחוצים לקבוע סיווג יעיל או הגנה במודל של זיהום חיידקי, OPKA יכול לשמש כדי להעריך את התרומה חסין מוות תאים חיידקיים מרכיבים בסיסיים ביותר: חיידקים, תאי מערכת החיסון, וניסויים טיפולים. מחקרים קודמים הראו כי OPKAs יכול להיות שונה, המשמש למגוון רחב של חיידקים, אשר נגרמו מהזנים אליהם, כולל סטרפטוקוקוס pneumoniae1, Staphylococcus aureus2, Pseudomonas aeruginosa3. יתר על כן, מבחני ממוטבת אלה ניתן להשתמש כדי להעריך את ניסיוני טיפולים שונים, כולל היכולת של אנזים לגרום החיידק יותר נגיש4 תאים חיסוניים בתיווך המשלים וטיפולי נוגדנים כדי לשפר opsonization5. באופן קלאסי, OPKA assay בהצלחה שימש במחקר בסיסי וקליני הגדרות כמו מחוון עוצמה להגנה המושרה על ידי נוגדנים ספציפיים הפתוגן6,7,8,9 .

סוגים שונים של תאים חיסוניים עשוי לשמש להערכה של opsonophagocytic רצח. אוכלוסייה אחת phagocytic נפוץ הוא הקו תאי לוקמיה אדם HL-60. קו תא זה יכול להישמר כמו promyelocytes מוחלש בתרבות; עם זאת, הם יכול להיות מובחן המצבים השונים מופעל באמצעות סמים שונים טיפולים10,11. טיפול של HL60 עם N, N-dimethylformamide מבדילה את שורת התאים לתוך נויטרופילים הופעל עם פעילות חזקה phagocytic11. בעוד HL-60 תאים מוטבו משמשים לעתים קרובות אלה מבחני phagocytosis10, לויקוציטים אורך חייהם העיקרית אחרים יכול לשמש כזרוע המערכת החיסונית הניסוי12.

בנוסף, מבחני אלה יכולה להיות מפושטת13 או מרובב14 להסתכל על מספר זנים עמידים לאנטיביוטיקה של החיידק להיבדק. השיטה מרובבת נעשה יותר ריאלי דרך פיתוח תוכנה יעילה יכולה לסמוך מושבת חיידקים ויוצרים יחידות (CFUs) לכל נקודה על מטוס צלחת אגר15. כאן, אנו מתארים שיטה יעילה באמצעות אחד זן חיידקי, HL-60 תאים, המשלים ארנב התינוק פלטות אגר דם. בשיטה זו, טיפולים מרובים יכולים להיות מוערך במהירות כדי לטפל שאלות מחקר ספציפי על איך יכול להיות מאופנן התגובה החיסונית מולדת זיהום חיידקי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. תרבות, בידול, ובדיקת התאים HL-60

  1. להכין HL-60 תא תרבות המדיה המורכבת של 500 מ"ל RPMI עם-גלוטמין ו- 50 מ ל חום-לא פעיל העובר שור סרום. אל תוסיף אנטיביוטיקה כמו זה משפיע על התמיינות של התאים HL-60.
  2. עבור הפצת/אחזקה של תאים HL-60, פרקו תרבות 5 x 106 תאים 10 מ"ל של HL-60 תא תרבות התקשורת 75 ס מ2 מבחנות-CO 37 ° C ו-5%2. מעבר תאים כל ימים 3−4 לשמור על ריכוזים תא אופטימלית.
    הערה: ריכוז תא לא יעלה על 5 x 106/mL.
  3. ליצור עבודה מניות של תאים HL-60 על ידי aliquoting כ עונה 1 פרק 106 תאים למ"ל בתקשורת התרבות HL60 עם 10% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) לתוך צינורות קריוגני 1 מ"ל.
    הערה: ניתן לאחסן עבודה מניות ב- 80 ° c מאסטר המניה צריך להיות מאוחסן ב-120 ° c
  4. להבדיל תאים HL-60 על ידי culturing 1.5 x 107 תאים ב-15 מיליליטר HL-60 תא תרבות המדיה עם 0.6% N, N-dimethylformamide (DMF)-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 ב סטרילי הכתיר מסנן 75 ס מ2 מבחנות במשך 3 ימים לפני OPKA.
  5. לאמת כי התאים HL-60 יש כבר הבדיל בהצלחה, מתאימים לשימוש ב וזמינותו OPKA על-ידי בדיקת הכדאיות וסמנים תא השטח על פי זרימת הוקמה cytometry פרוטוקולים16,17, 18,19. לאחר בידול, לקצור תאי HL-60, כתם כ עונה 1 פרק 10 תאים4 עם נוגדנים/כתמים מצומדת fluorescently CD71, CD35, annexin V של יודיד propidium.
    הערה: תאים צריך להיות % ≥55% קיימא, ≥65 CD35+, ו ≤20% CD71+ כפי שנקבע דרך נוסדה פרוטוקולי אימות14 (איור 1).

2. הכנת OPKA Buffers וראגנטים

  1. הכן 50 מ של מאגר opsonization סטרילי B (OBB) על ידי ערבוב 42.5 מ ל 1 סטרילי x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) עם Ca2 +/Mg2 +5 מ של חום-להשבית את העובר סרום שור, 2.5 מ של 0.1% ג'לטין סטרילי. חנות ב 4 º C.
  2. לקבל ארנב התינוק המשלים ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס.
  3. להשיג או להכין צלחות התרבות חיידקי (קרי, צלחות אגר דם של כבשים 5%2 15 x 100 מ מ).

3. הכנת דוגמאות מלאי חיידקים

  1. להשיג מלאי של strain(s) חיידקי להיבדק.
    הערה: עבור פרוטוקול זה, serotype 3 pneumoniae סטרפטוקוקוס (WU2, בנדיבות שסופקו על-ידי ד ר מון Nahm) משמש.
  2. תגדל את זן חיידקי ב מרק המתאים (קרי, טוד יואיט מרק + 0.5% תמצית שמרים לנבג WU2) עבור 2−4 h ב- 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: הצפיפות האופטית-600 nm (OD600) של התרבות צריכה להיות בין 0.6 0.8.
  3. גלולה את החיידקים על ידי צנטריפוגה ב x 6,000 g למשך 2 דקות, resuspend תאי 10−30 מ"ל של גליצרול 15% במרק המתאים. Aliquot התרבות חיידקי (500 µL לכל aliquot) לתוך צינורות צנטריפוגה mL 1.5 סטרילי, חנות ב-80 מעלות צלזיוס.
  4. להפשיר בקבוקון אחד של מניות חיידקי באמבט מים 37 º C. גלולה תאי חיידקים, resuspend ב µL 500 של OBB בתנאים סטריליים.
  5. להכין דילולים שונים של המניה חיידקי ב- OBB (קרי, µL 10 של לא דילול, 10 µL של 1:10, 10 µL של בטחונות, וכו '). לבצע את הבדיקה OPKA (סעיפים 4-6, כולל HL-60/המשלים תרבות משותפת) כמפורט להלן באמצעות דילולים שונים של המניה חיידקי לא מטופל. תרבות הלוחות ללון ב- 30 מעלות צלזיוס (CO2).
    הערה: בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס הוא ספציפי WU2 למנוע יתר; אחרים זנים/אשר נגרמו מהזנים אליהם עשויה לגדול בצורה אופטימלית ב 37 º C.
  6. לספור את המושבות עבור כל דילול מניות חיידקי לא מטופל תרבותי משותף עם תאים HL-60, המשלים. לקבוע אילו דילול של חיידקים התשואות המספר האופטימלי של אפשר לספור מושבות (כ CFUs 80−120 לחיידקים לא מטופל תרבותי משותף עם תאים HL-60). שימו לב זה דילול עבור OPKAs בעתיד הכרוכים במניה הזו חיידקי.

4. חיידקי טיפול ותרבות

  1. הפשרת שפופרת אחת של חיידקי מניות מוכן בשלב 3.3. גלולה חיידקים (6,000 x g למשך 2 דקות), resuspend תא גלולה ב OBB-דילול אופטימלית כפי שנקבע בשלב 3.6.
  2. פיפטה 10 µL של דילול חיידקי resuspended לכל טוב בצלחת תרבות תא 96-ובכן סיבוב המדרגה.
  3. הוסף 20 µL של הטיפול המתאים נוגדן או סמים מכל קידוח ניסיוני ב כפילויות.
    הערה: פרוטוקול זה, נוגדנים ספציפיים serotype שנוצר בעכברים מתווסף כטיפול X, אנזים ההידרולז גליקוזיד ידוע כדי להשפיל את הקפסולה רב-סוכר 3 serotype נוסף כטיפול Y (איור 2)4,20. לשימוש שליטה וולס, 1 x PBS או OBB, בהתאם המאגר המשמש עבור טיפול בארות.
  4. לנער את הצלחת מדגם כ 90 סל ד לשעה בטמפרטורת החדר. להתאים את התנאים האלה תלוי טמפרטורה אופטימלית או תנאים חזק של טיפולים נבדק.

5. HL-60 התרבות חיידקי שיתוף

  1. להכין HL-60 תאים בבציר התאים HL-60 הבדיל מטופלים עם DMF לפני שלושה ימים (ראה שלב 1.4) לתוך צינורות חרוט 15 מ"ל. גלולה התאים (x 500 g, 3 דקות), למחוק את תגובת שיקוע, לשטוף עם פחות 10 מ"ל של PBS 1 x.
  2. גלולה התאים שטף (x 500 g, 3 דקות), למחוק את תגובת שיקוע, resuspend תאי OBB (להתחיל עם 1 מ"ל OBB ולהתאים עבור ריכוז הסופי של /mL עונה 1 פרק 107לאחר ספירת תאים).
  3. להוסיף המשלים ארנב התינוק (סרום ארנב התינוק סטרילי, לא מדולל, גיל 3−4 שבועות) בכל אמצעי אחסון הסופי של 1:5.
    הערה: הריכוז הסופי של התערובת HL-60-המשלים צריך להיות /mL7עונה 1 פרק 10. אם בדיקת תלות המשלים, פתרון השני המכיל תאים פעילים HL-60 עם המשלים להשבית חום יכול לשמש (המשלים עלולה להיות מומת על ידי המקננת באמבט מים-> 55 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות).
  4. לאחר התרבות חיידקי 1 h מלאה (שלב 4.4), לחלק כל דגימה (קרי, 10 µL של כל מדגם µL 30 גם לתוך שתי בארות חדשות) וולס כפולים עבור שתי קבוצות (קרי, שימוש רק 20 µL של התרבות המקורית של שיתוף 30 µL עבור שגיאה pipetting) : קבוצה אחת יהיה תרבותי משותף עם HL-60-המשלים, אחד יכלול חיידקים בלבד. להוסיף 50 µL של תערובת HL-60-המשלים (מתוך שלב 5.3) לכל קבוצה ניסיונית של וולס (משניות + HL-60); להוסיף 50 µL של OBB לבד הבארות של חיידקים בלבד (משניות -HL-60).
    הערה: עבור דוגמה זו, כ- 800 חיידקי CFUs משמשים עבור התרבות שיתוף הראשונית עם 5 x 105/50 µL HL-60 תאים. אם זה ריבוי של זיהום גבוה מדי או נמוך מדי כמצוין על-ידי מספרים המושבה הסופי, להתאים דילול חיידקי ראשוני לעומת ספירת HL-60.
  5. לנער את הצלחת 96-ובכן ב 37 ° C עבור h 1 (CO2).

6. לטעום יופיצ, דגירה לילה

  1. לדלל כל טוב 1:5 עם OBB, כך כל מדגם יש נפח של פחות 50 µL.
  2. פיפטה 50 µL של כל מדגם ישירות על גבי אזור ייעודי של צלחת התרבות חיידקי, הבטחת ריווח מתאים בין הדגימות. עבור 15 x 100 מ מ עגול2 פלטות אגר, pipet כ 4 דוגמאות על גבי לוח אחד.
  3. לכסות ולאפשר דגימות לייבוש למשך כ 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. היפוך צלחות ותרבות בין לילה ב 30 מעלות צלזיוס (CO2). לחלופין, תרבות צלחות בצנצנות אנאירובית כדי לבדוק אם תנאי אנאוקסיים משפיעים על התפתחות חיידקים או לפקד על מורפולוגיה.
  5. לאחר לילה תרבות, לספור את המושבות בכל אזור מדגם המיועד. ניתוח נתונים באמצעות השוואת מספר תאים חיים מתוך כל ערכה המתאימה שליטה ו/או מדגמים שאינם מקבלים HL-60 תא תרבות משותפת (מצביע על הישרדות cell 100%, 0% תא הרג).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

אימות של בידול HL-60 יש לבצעו לפני שמתחילים את OPKA. זה יכול להתבצע באמצעות cytometry זרימה כדי לקבוע את הביטוי חוץ-תאי של CD11b, CD35, CD71, annexin V (איור 1). יודיד Propidium יכול גם לשמש כסמן הכדאיות. לאחר מטופל עם DMF במשך 3 ימים, צריך להיות מוגברת הביטוי של CD35 (≥55% של כל התאים), ביטוי של CD71 צריך להיות ירד (≤20% של כל התאים). האחוז של annexin V + ותאים propidium יודיד (PI +) ביחד צריך להיות < 35% כדי להבטיח מספיק תא הכדאיות. אם אחוזי אלה אינם עומדים בדרישות הסף, התנאים תרבות צרי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

OPKAs מגישים תפקידים חיוניים בהערכת תגובות חיסוניות מתווכת נוגדן המושרה על ידי חיסונים6,8. המשמעות העיקרית של OPKA פשוטה זו היא הסתגלות, בתנאים להיבדק (קרי, נוגדנים, אנזימים טיפולים, וכו '.). במובן זה, בעוד assay זה יכול לשמש כדי לבדוק את התרומה של opsonins (קרי, נוגדנים) phagocytosis, זה יכול לשמש גם כדי להעריך דרכים להתגבר על הגורמים התקפה אלימה (כלומר, הסיבה סוכרים) המעכבות בדרך כלל מסלולים phagocytic. צמצום מספר הצעדים המשמשים בדרך כלל OPKA מרובבת פוטנציאל ממ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

אנו מודים ד ר מון Nahm (אוניברסיטת אלבמה ברמינגהם) על שלו בפז סיוע בהקמת OPKA מבחני במעבדה שלנו. עבודה זו נתמכה על ידי מוסדות לאומיים של בריאות גרנט 1R01AI123383-01A1 כדי FYA.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נספח V (מצומד APC)BioLegend640919
אנטי-CD35, אנושי (מצומד PE)BioLegend333405
אנטי-CD71, אנושי (מצומד PE)BioLegend334105
זן חיידקים לשימוש (כלומר, Streptococcus pneumoniae, WU2)מעבדת ייחוס חיידקי נשימה (ד"ר מון נהם) 
צלחות אגר דםHardy DiagnosticA10
סרום שיבוט עובריHyCloneSH30080.03
גליצרולSigmaG9012-1L
HL-60 תאיATCCCCL-240
IgG בקרת איזוטיפ (מצומד PE)BioLegend400907
N,N-dimethylformamide (DMF)Fisher כימיקלUN2265
פרופידיום יודידSigmaP4864
RPMI מדיה עם L-גלוטמיןקורנינג10-040-CV

מקורות

  1. Romero-Steiner, S., et al. Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).
  2. Nanra, J. S., et al. Capsular polysaccharides are an important immune evasion mechanism for Staphylococcus aureus. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 9 (3), 480-487 (2013).
  3. Ishibashi, K., Yamaguchi, O., Shiraiwa, Y., Ogihara, M., Shigeta, S. Combination therapy of Pseudomonas aeruginosa pyelonephritis in neutropenic mice with human antilipopolysaccharide monoclonal antibody and cefsulodin. Journal of Urology. 155 (6), 2094-2097 (1996).
  4. Middleton, D. R., Paschall, A. V., Duke, J. A., Avci, F. Y. Enzymatic Hydrolysis of Pneumococcal Capsular Polysaccharide Renders the Bacterium Vulnerable to Host Defense. Infection and Immunity. , (2018).
  5. Baker, C. J., Noya, F. J. Potential use of intravenous immune globulin for group B streptococcal infection. Reviews of Infectious Diseases. 12, Suppl 4 476-482 (1990).
  6. Tian, H., Weber, S., Thorkildson, P., Kozel, T. R., Pirofski, L. A. Efficacy of opsonic and nonopsonic serotype 3 pneumococcal capsular polysaccharide-specific monoclonal antibodies against intranasal challenge with Streptococcus pneumoniae in mice. Infection and Immunity. 77 (4), 1502-1513 (2009).
  7. Parameswarappa, S. G., et al. A Semi-synthetic Oligosaccharide Conjugate Vaccine Candidate Confers Protection against Streptococcus pneumoniae Serotype 3 Infection. Cell Chemical Biology. 23 (11), 1407-1416 (2016).
  8. Jackson, L., et al. Randomized clinical trial of a single versus a double dose of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in adults 55 through 74 years of age previously vaccinated with 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine. Vaccine. 36 (5), 606-614 (2018).
  9. Cywes-Bentley, C., et al. Antibody to a conserved antigenic target is protective against diverse prokaryotic and eukaryotic pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (24), 2209-2218 (2013).
  10. Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).
  11. Collins, S. J., Ruscetti, F. W., Gallagher, R. E., Gallo, R. C. Terminal differentiation of human promyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polar compounds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 75 (5), 2458-2462 (1978).
  12. Melnick, N., Rajam, G., Carlone, G. M., Sampson, J. S., Ades, E. W. Evaluation of a novel therapeutic approach to treating severe pneumococcal infection using a mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (6), 806-810 (2009).
  13. Dwyer, M., Gadjeva, M. Opsonophagocytic assay. Methods in Molecular Biology. 1100, 373-379 (2014).
  14. Burton, R. L., Nahm, M. H. Development of a fourfold multiplexed opsonophagocytosis assay for pneumococcal antibodies against additional serotypes and discovery of serological subtypes in Streptococcus pneumoniae serotype 20. Clinical and Vaccine Immunololgy. 19 (6), 835-841 (2012).
  15. Clarke, M. L., et al. Low-cost, high-throughput, automated counting of bacterial colonies. Cytometry Part A. 77 (8), 790-797 (2010).
  16. Aanei, C. M., et al. Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation. Journal of Visualized Experiments. (141), e57867(2018).
  17. Hirz, T., Dumontet, C. Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents. Journal of Visulaized Experiments. (109), e53846(2016).
  18. Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death. Journal of Visualized Experiments. (50), 2597(2011).
  19. Blair, O. C., Carbone, R., Sartorelli, A. C. Differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells: simultaneous determination of phagocytic activity and cell cycle distribution by flow cytometry. Cytometry. 7 (2), 171-177 (1986).
  20. Middleton, D. R., et al. Identification and characterization of the Streptococcus pneumoniae type 3 capsule-specific glycoside hydrolase of Paenibacillus species 32352. Glycobiology. 28 (2), 90-99 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

דיפרנציאציה של תאי HL60פגוציטוזה בקטריאליתאנליזה בציטומטריית זרימהStreptococcus pneumoniaeהריגה תלוית קומפלימנטיחידות יוצרות מושבותתרבית משותפת של תאי מערכת החיסוןהשפעות של טיפול תרופתיהערכת סילוק בקטריאלי
Opsonophagocytic הריגה הנועד להעריך תגובות אימונולוגי נגד פתוגנים חיידקיים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.