שיטת ההרג הזה opsonophagocytic משמש כדי להשוות את היכולת של תאים חיסוניים phagocytic להגיב ולהרוג חיידקים בהתבסס על טיפולים שונים ו/או תנאים. באופן קלאסי, assay הזה משמש תקן זהב להערכת אפקטור פונקציות של נוגדנים שהועלו נגד חיידק בשם opsonin.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Opsonophagocytic הריגה הנועד להעריך תגובות אימונולוגי נגד פתוגנים חיידקיים
במאמר זה
סיכום
תקציר
היבט מרכזי של התגובה החיסונית מושבת חיידקים של הפונדקאי היא phagocytosis. Assay הריגה opsonophagocytic (OPKA) הוא תהליך ניסוי שבו תאים phagocytic הם תרבותי משותף עם יחידות חיידקי. תאים חיסוניים phagocytose ולהרוג את התרבויות חיידקי באופן תלוי-המשלים. היעילות של ההרג בתיווך החיסון התא תלויה במספר גורמים, והוא יכול לשמש כדי לקבוע כמה שונה בקטריאלי תרבויות להשוות מבחינת עמידות בפני מוות של תאים. בדרך זו, וצריך להעריך את היעילות של פוטנציאל הרפוי המבוסס על החיסון נגד זני חיידקים ספציפיים ו/או אשר נגרמו מהזנים אליהם. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים OPKA מפושטת אשר מנצל תנאים בסיסיים תרבות ותא לספור כדי לקבוע את הכדאיות תא החיידק אחרי תרבות משותפת עם הטיפול והתנאים תאים חיסוניים HL-60. בשיטה זו יש כבר מנוצל בהצלחה עם מספר שונה pneumococcal אשר נגרמו מהזנים אליהם, הסיבה acapsular זנים, ואת מיני חיידקים אחרים. היתרונות של פרוטוקול זה OPKA הם הפשטות שלה, צדדיות (כמו assay זו אינה מוגבלת נוגדן טיפולים כמו opsonins), ומינימיזציה של ריאגנטים להעריך קבוצות מעבדה בסיסית וזמן.
מבוא
Opsonophagocytic הורגת assay (OPKA) הוא כלי חיוני עבור קישור שינויים במבנה חיידקי או פונקציה לשינויים הבאים התגובה החיסונית ותפקוד. ככזה, הוא משמש לעתים קרובות כמו assay משלימים כדי לקבוע המבוסס על החיסון יעילותם של טיפולים נוגדן, חיסון מועמדים, אנזים אופטימיזציה, וכו '. בזמן מבחני ויוו נחוצים לקבוע סיווג יעיל או הגנה במודל של זיהום חיידקי, OPKA יכול לשמש כדי להעריך את התרומה חסין מוות תאים חיידקיים מרכיבים בסיסיים ביותר: חיידקים, תאי מערכת החיסון, וניסויים טיפולים. מחקרים קודמים הראו כי OPKAs יכול להיות שונה, המשמש למגוון רחב של חיידקים, אשר נגרמו מהזנים אליהם, כולל סטרפטוקוקוס pneumoniae1, Staphylococcus aureus
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. תרבות, בידול, ובדיקת התאים HL-60
- להכין HL-60 תא תרבות המדיה המורכבת של 500 מ"ל RPMI עם-גלוטמין ו- 50 מ ל חום-לא פעיל העובר שור סרום. אל תוסיף אנטיביוטיקה כמו זה משפיע על התמיינות של התאים HL-60.
- עבור הפצת/אחזקה של תאים HL-60, פרקו תרבות 5 x 106 תאים 10 מ"ל של HL-60 תא תרבות התקשורת 75 ס מ2 מבחנות-CO 37 ° C ו-5%2. מעבר תאים כל ימים 3−4 לשמור על ריכוזים תא אופטימלית.
הערה: ריכוז תא לא יעלה על 5 x 106/mL. - ליצור עבודה מניות של תאים HL-60 על ידי aliquoting כ עונה 1 פרק 106 תאים למ"ל בתקשורת התרבות HL60 עם 10% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) לתוך צינורות ק....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
אימות של בידול HL-60 יש לבצעו לפני שמתחילים את OPKA. זה יכול להתבצע באמצעות cytometry זרימה כדי לקבוע את הביטוי חוץ-תאי של CD11b, CD35, CD71, annexin V (איור 1). יודיד Propidium יכול גם לשמש כסמן הכדאיות. לאחר מטופל עם DMF במשך 3 ימים, צריך להיות מוגברת הביטוי של CD35 (≥55% של כל התאים), ביטוי של CD71 צריך להיות ירד (≤20% של כל התאים). האחוז של annexin V + ותאים propidium יודיד (PI +) ביחד צריך להיות < 35% כדי להבטיח מספיק תא הכדאיות. אם אחוזי אלה אינם עומדים בדרישות הסף, התנאים תרבות צרי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
OPKAs מגישים תפקידים חיוניים בהערכת תגובות חיסוניות מתווכת נוגדן המושרה על ידי חיסונים6,8. המשמעות העיקרית של OPKA פשוטה זו היא הסתגלות, בתנאים להיבדק (קרי, נוגדנים, אנזימים טיפולים, וכו '.). במובן זה, בעוד assay זה יכול לשמש כדי לבדוק את התרומה של opsonins (קרי, נוגדנים) phagocytosis, זה יכול לשמש גם כדי להעריך דרכים להתגבר על הגורמים התקפה אלימה (כלומר, הסיבה סוכרים) המעכבות בדרך כלל מסלולים phagocytic. צמצום מספר הצעדים המשמשים בדרך כלל OPKA מרובבת פוטנציאל ממ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
אנו מודים ד ר מון Nahm (אוניברסיטת אלבמה ברמינגהם) על שלו בפז סיוע בהקמת OPKA מבחני במעבדה שלנו. עבודה זו נתמכה על ידי מוסדות לאומיים של בריאות גרנט 1R01AI123383-01A1 כדי FYA.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| נספח V (מצומד APC) | BioLegend | 640919 | |
| אנטי-CD35, אנושי (מצומד PE) | BioLegend | 333405 | |
| אנטי-CD71, אנושי (מצומד PE) | BioLegend | 334105 | |
| זן חיידקים לשימוש (כלומר, Streptococcus pneumoniae, WU2) | מעבדת ייחוס חיידקי נשימה (ד"ר מון נהם) | ||
| צלחות אגר דם | Hardy Diagnostic | A10 | |
| סרום שיבוט עוברי | HyClone | SH30080.03 | |
| גליצרול | Sigma | G9012-1L | |
| HL-60 תאי | ATCC | CCL-240 | |
| IgG בקרת איזוטיפ (מצומד PE)BioLegend | 400907 | ||
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Fisher כימיקל | UN2265 | |
| פרופידיום יודיד | Sigma | P4864 | |
| RPMI מדיה עם L-גלוטמין | קורנינג | 10-040-CV |
מקורות
- Romero-Steiner, S., et al. Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).
- Nanra, J. S., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
