מאמר שיטה

ברזולוציה גבוהה 3D הדמיה של זיהום וירוס כלבת ברקמת המוח נקי ממס

DOI:

10.3791/59402

⸱

30 באפריל 2019

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular Virology and Cell Biology, Friedrich-Loeffler-Institut, Federal Research Institute for Animal Health

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רומן, חיסוני התאמה לניקוי רקמות הרקמה כמו הדמיה 3D האולטימטיבי של איברים הממס נקי לאפשר הדמיה 3D של זיהום המוח וירוס כלבת הסביבה הסלולרית המורכבת שלה. עבה, נוגדן מתויג פרוסות רקמת המוח נעשים שקופים להגדיל את עומק ההדמיה כדי לאפשר ניתוח תלת-ממד על ידי המיקרוסקופיה סריקת לייזר מיקרוסקופ.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההדמיה של תהליכי זיהום ברקמות ובאיברים על ידי immunolabeling היא שיטה מרכזית בביולוגיה זיהום מודרני. היכולת להתבונן וללמוד את ההפצה, tropism, שפע של פתוגנים בתוך רקמות האיברים מספק נתונים מרכזי על פיתוח המחלה והתקדמות. באמצעות שיטות מיקרוסקופ קונבנציונאלי, אימונויניום מוגבל בעיקר לחלקים דקים המתקבלים פרפין-מוטבע או מדגמים קפואים. עם זאת, מישור התמונה 2D מוגבל של סעיפים דקים אלה עשוי להוביל לאובדן מידע חיוני על המבנה המורכב של איבר נגוע ההקשר הסלולר של הזיהום. המודרנית multicolor, חיסוני מכתים לניקוי רקמות הרקמה כעת לספק דרך מהירה יחסית וזולה ללמוד בנפח גדול 3D התמונה ערימות של רקמת איבר נגוע וירוס. על-ידי חשיפת הרקמה לממיסים אורגניים, היא הופכת לשקופה בצורה אופטית. זה תואם את מדדי השבירה של המדגם ובסופו של דבר מוביל לירידה משמעותית של פיזור אור. כך, בשילוב עם מטרות ארוכות בטווח העבודה הפנוי, מקטעי רקמות גדולים עד גודל של 1 מ"מ ניתן לתמונה על ידי מיקרוסקופ מיקרוסקופית לייזר קונפוקלית וקד מקובל (clsm) ברזולוציה גבוהה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול להחיל הדמיה עמוקה רקמות לאחר ניקוי רקמות כדי להמחיש התפלגות וירוס כלבת במוח נגוע על מנת ללמוד נושאים כמו פתוגנזה וירוס, התפשטות, tropism, והפלישה neuroinvasion

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכניקות היסטולוגיה קונבנציונאלי להסתמך בעיקר על חלקים דקים של רקמות איברים, אשר יכול באופן מטבעו לספק רק התובנות 2D לתוך סביבת 3D מורכבת. למרות שניתן לעשות זאת בעיקרון, שחזור תלת-ממדי ממקטעים דקים סדרתיים מחייב קווים טכניים מסוימים לפריסה ולאחר מכן ביישור סיליקו של התמונות הנרכשים1. יתר על כן, שחזור חלק של כרכים z לאחר חיתוך מיקרוטום הוא קריטי כמו גם ממצאים מכניים וחישוביים יכולים להישאר בגלל רישום התמונה האופטימלי הנגרמת על ידי מטוסי התמונה לא חופפים, וריאציות מכתים, ופיזית , הרס רקמות על ידי. למשל, להב המיקרו-טומה לעומת זאת, חיתוך אופטי טהור של דגימות רקמה עבה שלמים מאפשר רכישה של מטוסי תמונה חופפים (דגימה מראש), ובכך, מקלה על שחזור תלת-ממד. זה, בתורו, מועיל מאוד לניתוח של תהליכים זיהום באוכלוסיות תאים מורכבות (למשל, רשתות נוירואליות בהקשר של התאים גליה המקיפים והחיסונית). עם זאת, מכשולים הטבועה של מקטעי רקמה עבים כוללים פיזור אור חדירה נוגדן מוגבלת לתוך הרקמה. בשנים האחרונות, מגוון של טכניקות פותחה ממוטבת להתגבר על בעיות אלה2,3,4,5,6,7,8 , מיכל בן 10 , מיכל עשור , מיכל בן 11 , מיכל בן 12 , 13. ביסודו של דבר, רקמות היעד הפכו שקופים באופן שקוף על ידי טיפול עם מימית2,3,4,5,6,7 ,8,9 או אורגני מבוסס הממס10,11,12,13 פתרונות. המבוא של 3disco (3disco הדמיה של איברים הממס נקי)11,12 ו udisco העוקבת שלה (3disco האולטימטיבי הדמיה של האיברים הממס נוקה)13 סיפק מהיר יחסית, פשוט, ו זול הכלי עם יכולות סליקה מצוינות. המרכיבים העיקריים של פרוטוקול סליקה הם ממיסים אורגניים טרט-butanol (יפורסם), בנזיל אלכוהול (BA), בנזיל בנזואט (BB), ו diphenyl אתר (dpe). הפיתוח והתוספת של iDISCO (immunolabeling מאופשר 3D הדמיה של איברים הממס נוקה)14, פרוטוקול חיסוני תואם, היוו יתרון נוסף על שיטות קיימות ואיפשר את התיוג העמוק ברקמה של אנטיגנים של עניין, כמו גם אחסון לטווח ארוך של דגימות מוכתם חיסוני. כך, השילוב של iDISCO14 ו udisco13 מאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של חלבונים המסומנים נוגדנים בסעיפים רקמות גדולות (עד 1 מ"מ) באמצעות clsm קונבנציונאלי.

שימור מבנה מורכב של איבר בכל שלושת הממדים חשוב במיוחד לרקמת המוח. נוירונים מהווים תת הטרוגנית התאית מאוד עם מורפולוגיות 3D מגוונים מאוד מבוסס על התחזיות הneurite שלהם (נבדק על ידי Masland15). יתרה מזאת, המוח מורכב ממספר תאים ותאי משנה, כל אחד מהם מורכב מאוכלוסיות שונות של תת-משנה ומיחס אליו, כולל תאים גליאל ונוירונים (שנבדקו על ידי פון ברטלד ואח '16). כווירוס נוירוטרופי, וירוס הכלבת (rabv, נבדק על ידי fooks ואח '17) מדביק בעיקר נוירונים, באמצעות מכונות ההובלה שלהם לנסוע בכיוון נסיגה לאורך אקסונים מהאתר העיקרי של זיהום למערכת העצבים המרכזית (cn). הפרוטוקול המתואר כאן (איור 1א) מאפשר זיהוי חיסוני בסיוע ויזואליזציה של התאים הנגועים RABV ו-rabv ב גדול, בערימות תמונה קוהרנטית שהתקבלו מרקמת המוח נגוע. הדבר מאפשר הערכה ברזולוציה גבוהה משוחדת, תלת-ממדית של סביבת הזיהום. זה חל על רקמת המוח ממגוון של מינים, ניתן לבצע מיד לאחר קיבעון או אחרי אחסון לטווח ארוך של דגימות של פאראפורמלדהיד (בתחתית), ומאפשר אחסון והדמיה מחדש של דגימות מוכתם ומנוקה במשך חודשים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שימוש בחומר המוח המאוחסן בארכיון באמצעות RABV. מחקרים ניסיוניים בעלי חיים בהתאמה הוערכו על ידי טיפול בעלי חיים אחראי, השימוש, וועדת האתיקה של משרד המדינה לחקלאות, בטיחות מזון, ודיג ב קלנבורג-מערב פומרניה (LALFF M-V) וקיבל אישור עם הרשאות 7221.3-2.1-002/11 (עכברים) ו-7221.3-1-068/16 (חמוסים). טיפול כללי ושיטות המשמשות בניסויים בבעלי חיים נעשו בהתאם להנחיות המאושרות.

התראה: פרוטוקול זה משתמש בחומרים רעילים ו/או מזיקים שונים, כולל המתנול, מימן (meoh), מי חמצן (H2O2), נתרן אזיד (נאן3), יפורסם, BA, BB, ו dpe. MeOH ו-יפורסם הם דליקים מאוד. הימנע מחשיפה על-ידי לבישת ציוד הגנה אישי מתאים (מעיל מעבדה, כפפות והגנת עיניים) וביצוע ניסויים בתוך מכסה המנוע. לאסוף פסולת בנפרד במיכלים המתאימים ולהיפטר ממנו על פי התקנות המקומיות. וירוס כלבת מסווג כרמת בטיחות ביולוגית (BSL)-2 הפתוגן והוא יכול, לכן, בדרך כלל להיות מטופלים תחת תנאי BSL-2. פעילויות מסוימות, כולל הליכים שעשויים לייצר אירוסולים, לעבוד עם ריכוזי וירוסים גבוהים, או לעבוד עם lyssaviruses הרומן, עשוי לדרוש סיווג BSL-3. מניעה טרום חשיפה מומלצת לעובדים בעלי סיכון גבוה, כולל מטפלים בבעלי חיים ועובדי מעבדה18,19. התייחס לתקנות הרשות המקומיות.

1. קיבוע רקמת המוח והסדר

  1. לתקן דגימות מוח בנפח מתאים של 4% בתחתית מלוחים באגירה פוספט (PBS [pH 7.4]) עבור לפחות 48 h ב 4 ° צ' (עם יחס רקמות משוער של 1:10 [v/v]).
  2. לשטוף את דגימות רקמות 3x ב PBS עבור לפחות 30 דקות כל לשטוף ולאחסן אותם 0.02% נאן3/PBS ב 4 ° צ' עד השימוש.
  3. מקטע את הרקמה לתוך מקטעים בעובי 1 מ"מ באמצעות רטט (קצב הזנת להב: 0.3 – 0.5 מ"מ/s, משרעת: 1 מ"מ, עובי פרוסה: 1,000 μm).
  4. כדי לשמור על רצף הפרוסה הנכון, אחסן כל אחד מסוגי הרקמה בנפרד בצלחת של לוחית התרבות של התאים המרובים. הוסף 0.02% NaN3/PBS ואחסן את מקטעי הרקמה ב -4 ° צ' עד השימוש.

2. לדוגמה טרום טיפול עם מתנול

הערה: בצע את כל שלבי הדגירה עם תנודה עדינה, ואם לא צוין אחרת, בטמפרטורת החדר. . להגן על הדגימות מהאור הטיפול במדגם משמש את המטרה הכוללת של שיפור הנוגדן והפחתת הרקמה האוטומטית של רקמות על ידי חשיפה MeOH ו-H2O2, בהתאמה14.

  1. להכין 20% (v/v), 40%, 60%, ו 80% MeOH פתרונות במים מזוקקים. למשל, עבור 20% MeOH, להוסיף 10 מ"ל של 100% MeOH ל 40 mL של מים מזוקקים בספינה מתאימה לאיטום ולערבב על ידי היפוך זה.
  2. העבירו את הדגימות לכלי בגודל סביר (למשל, 5 מ ל שפופרות תגובה). לדאוג לשימוש בחומרים עמידים כימית כדי ריאגנטים בשימוש בפרוטוקול זה. למשל, שים לב כי בעוד פוליפרופילן מתאים, הפוליסטירן אינו.
    הערה: מפרטי עוצמת הקול בפרוטוקול זה מתייחסים ל-5 שפופרות תגובה mL. אם נעשה שימוש בכלי קיבול אחר, התאימו את אמצעי האחסון בהתאם.
  3. מודאת הדגימות ב 4 מ ל של כל ריכוז של הסדרה המוכנה של פתרונות MeOH בסדר עולה עבור 1 h כל אחד.
  4. מודאת הדגימות 2x עבור 1 h כל אחד טהור (100%) שבילי.
  5. לצנן את הדגימות עד 4 ° צ' (למשל, במקרר מוגן מעבדה).
  6. הכנת פתרון הלבנה (5% H2O2 ב meoh) על ידי, למשל, דילול 30% H2O 2 מלאי פתרון ב 1:6 טהור (100%) . והירגע בארבע מעלות צלזיוס
  7. הסר את 100% MeOH מתוך דגימות קירור ולהוסיף 4 מ ל של פתרון הלבנת מקורר (5% H2O2 ב meoh). המלון משלב בין לילה ב -4 ° c.
  8. החלף את הפתרון הלבנת עבור 4 מ ל של 80% MeOH ו-דגירה עבור 1 h. המשך להשתמש בסדרה המוכנה של פתרונות MeOH בסדר יורד עבור 1 h כל אחד עד הדגימות כבר מודבטים עבור 1 h ב 4 מ ' של 20% MeOH.
  9. שטוף את דגימות 1x עבור 1 h עם 4 מ ל של PBS.

3. כתמים חיסוני

הערה: בצע את כל שלבי הדגירה עם תנודה עדינה, ואם לא צוין אחרת, בטמפרטורת החדר. . להגן על הדגימות מהאור כדי למנוע גידול בחיידקים, להוסיף נאן3 לריכוז הסופי של 0.02% לפתרונות בסעיף זה. דגימות רקמות הן חדירות נוספות על ידי טיפול עם דטרגנטים nonionic טריטון X-100 ו רצף 20. סרום רגיל משמש לחסימת כריכת נוגדנים שאינה ספציפית. גליצין והפארין מתווספים להפחתת הרקע האימונוולאבילינג14.

  1. לשטוף את הדגימות 2x עבור 1 h כל אחד ב 4 מ ל של 0.2% טריטון X-100/PBS.
  2. הפריית הדגימות עבור 2 ימים ב 37 ° c עם 4 מ ל של 0.2% טריטון X-100/20% DMSO/0.3 M גליצין/PBS.
  3. לחסום את הקשירה לא ספציפית של נוגדנים על ידי הדגירה של דגימות עבור 2 ימים ב 37 ° c ב 4 מ ל של 0.2% טריטון X-100/10% DMSO/6% סרום רגיל/PBS.
    הערה: השימוש בסרום רגיל מאותו מינים הנוגדן המשני הועלה כדי להשיג תוצאות החסימות האידיאליות.
  4. מודדת את הדגימות 2 מ ל של פתרון הנוגדן העיקרי (3% סרום רגיל/5% DMSO/לפטין [PBS-רצף 20 עם הפארין] + נוגדן ראשי/נוגדנים) במשך 5 ימים ב 37 ° c. לרענן את פתרון הנוגדן העיקרי לאחר 2.5 ימים.
    1. עבור לפטין, ליצור מחדש את מלח הפארין נתרן במים מזוקקים לעשות 10 מ"ג/mL פתרון מניות (לאחסן את הפתרון, מצוטט, ב 4 ° c). הוסף את הפתרון מניות ל 0.2% רצף 20/PBS לריכוז הסופי של 10 μg/mL.
      הערה: בחירת דילול הנוגדן הנכון עשוי לדרוש אופטימיזציה. בדרך כלל, ריכוזי אימונוהיסטוכימיה סטנדרטיים הם נקודת התחלה טובה.
  5. רוחצים את הדגימות ליום אחד ב-4 מ ל של פטין, החלפת מאגר הכביסה לפחות 4x – 5x במהלך היום והשארת הכביסה הסופית על הלילה.
  6. מודדת את הדגימות 2 מ ל של פתרון נוגדן משני (3% סרום רגיל/לפטין + נוגדן/נוגדנים משני) עבור 5 ימים ב 37 ° c. לרענן את פתרון הנוגדן המשני לאחר 2.5 ימים.
    1. לדלל את הנוגדן/נוגדנים משני ב 1:500 בפתרון נוגדן משני (כלומר, 4 μL ב 2 מ ל).
  7. רוחצים את הדגימות ליום אחד כמתואר בשלב 3.5, ומשאירים את השטיפה הסופית בלילה.

4. מכתים גרעיני

הערה: בצע את כל שלבי הדגירה עם תנודה עדינה, ואם לא צוין אחרת, בטמפרטורת החדר. . להגן על הדגימות מהאור אם אין כתמים גרעיניים נדרש או את הספקטרום עירור/הפליטה של ל-PRO-3 נדרש עבור עירור או זיהוי של fluorophore אחר, לדלג על שלב זה.

  1. לדלל את הכתם חומצות גרעין ל-PRO-3 ב 1:1000 בשנת לפטין ו-דגירה את דגימות 4 מ ל של פתרון מכתים גרעיני עבור 5 h.
  2. רוחצים את הדגימות ליום אחד כמתואר בשלב 3.5, ומשאירים את השטיפה הסופית בלילה.
    הערה: לאחר הניקוי ניתן לאחסן את הדגימות ב-PBS ב-4 ° צ' עד לניקוי אופטי.

5. ניקוי רקמות

הערה: בצע את כל שלבי הדגירה עם תנודה עדינה, ואם לא צוין אחרת, בטמפרטורת החדר. . להגן על הדגימות מהאור דגימות הרקמה מיובשות בסדרה מדורגת של פתרונות יפורסמו. כאשר החיסוני דורש פתרונות מימית, כל הליכי הצביעת צריך להסתיים לפני ניקוי רקמות. סיווג אופטי והתאמת מדד השבירה מושגת על ידי טיפול עם תערובת של BA, BB, ו DPE. הפתרון סליקה בתוספת עם DL-α-tocopherol כמו נוגד חמצון13.

  1. הכינו 30% (v/v), 50%, 70%, 80%, 90% ו-96% מפתרונות יפורסם במים מזוקקים. למשל, עבור 30% יפורסם, להוסיף 15 מ ל של 100% יפורסם עד 35 mL של מים מזוקקים בכלי האיטום המתאים ולערבב ידי היפוך.
    הערה: יפורסם בנקודת התכה של 25 עד 26 ° c; לכן, הוא נוטה להיות מוצק בטמפרטורת החדר. כדי להכין פתרונות יפורסמו, לחמם את הבקבוק האטום היטב ב 37 ° c בחממה או באמבט מים.
  2. מייבשים את הדגימות עם 4 מ ל של כל ריכוז של הסדרה המוכנה של פתרונות יפורסם בסדר עולה עבור 2 h כל אחד. השאירו את ה-96% יפורסם בלילה.
  3. מייבשים את הדגימות עוד יותר בטהור (100%) יפורסם במשך 2 שעות
  4. הכנת ניקוי פתרון BABB-D15.
    הערה: BABB-D15 הוא שילוב של BA ו-BB (BABB) אשר מעורבב עם DPE ביחס של x: 1, שבו x מצוין שם הפתרון, במקרה זה 15.
    1. עבור BABB, מערבבים תואר ראשון בשני חלקים ב-BB.
    2. מערבבים BABB ו DPE ביחס של 15:1.
    3. הוסף 0.4 vol% DL-α-tocopherol (ויטמין E).
      הערה: לדוגמה, עבור 20 מ ל של BABB-D15, לערבב 6.25 mL של BA עם 12.5 mL של BB. להוסיף 1.25 mL של DPE ומוסף אותו עם 0.08 mL של DL-α-tocopherol.
  5. נקה את הדגימות בניקוי התמיסה עד שהן שקופות באופן שקוף (2 – 6 שעות).
  6. הדגימות ניתן לאחסן ב 4 ° c ב BABB-D15, מוגן מפני אור, עד הרכבה והדמיה.

6. הרכבה לדוגמה

  1. באמצעות מדפסת תלת-ממד, הדפס את חדר ההדמיה ואת המכסה (חומר: copolyester [CPE], זרבובית: 0.25 מ"מ, גובה שכבה: 0.06 מ"מ, עובי קיר: 0.88 מ"מ, ספירת קירות: 4, infill: 100%, אין מבנה תמיכה; קובץ STL ניתן למצוא בחומרים המשלימים של פרוטוקול זה).
  2. הכנס את חדר ההדמיה (איור 2).
    1. הר שמיכות עגול (קוטר: 30 מ"מ) על חדר ההדמיה עם RTV-1 (חדר אחד-מרכיב-הטמפרטורה-בטמפרטורת המים) סיליקון גומי. מסירים את גומי הסיליקון העודף בעזרת ספוגית כותנה במים ומרפאת לילה.
    2. הר שמיכות עגול (קוטר: 22 מ"מ) על המכסה עם RTV-1 סיליקון גומי. מסירים את גומי הסיליקון העודף בעזרת מסיר כותנה מים ומרפא למשך הלילה.
  3. מניחים את המדגם בחדר הדמיה, להוסיף נפח קטן של BABB-D15, ולהוסיף את המכסה. למלא את החדר עם BABB-D15 דרך הים, באמצעות מחט תת-עורית (27 G x 3/4 אינטש [0.40 מ"מ x 20 מ"מ]).
  4. חבר את החלל ולאטום את חדר ההדמיה עם RTV-1 סיליקון גומי. לרפא לילה בחושך.

7. עיבוד תמונות והדמיה

  1. להגדיר את רכישת התמונה על ידי בחירת קווי לייזר בהתאמה להתאים fluorophores בשימוש. התאימו את טווחי הזיהוי של כל גלאי כדי למנוע חפיפה בין האותות בין הערוצים.
    הערה: טווחי זיהוי למופת עבור אלקסה Fluor 488, אלקסה Fluor 568, ו-PRO-3 הם 500 – 550 ננומטר, 590 – 620 ננומטר, ו 645 – 700 ננומטר, בהתאמה.
  2. בחרו בפרמטרי הרכישה, הגדירו את הגבול העליון והתחתון של מחסנית z, ורכשו את מחסנית התמונה.
    הערה: פרמטרים לרכישת מופת הם סריקה רציפה עם גודל פיקסל של 60-90 ננומטר, גודל z-step של 0.5 μm, קו ממוצע של 1, מהירות סריקה של 400 Hz, וגודל חריר של יחידה אוורירית 1.
  3. עבד את מחסנית התמונה באמצעות תוכנת ניתוח התמונה המתאימה (לדוגמה, פיג'י) כדי ליצור הקרנות תלת-ממד או לבצע ניתוחים מעמיקים.
    הערה: בשל גודלו הגדול של קבצי התמונה הנרכשים, השימוש בתחנת עבודה הוא בדרך כלל הכרחי.
    1. פתח את קבצי הרכישה או התמונה בפיג (קובץ | פתח | בחר קבצים).
      1. . אם נשתמש, למשל בחרו או בטלו את הבחירה באפשרויות הרצויות בחלון הדו ' תבניות ביולוגיות '. הצג מחסנית עם היפר-מחסנית. מלבד זאת, לא נחוצים בחירות או קרציות מסוימות. לחץ על אישור.
      2. אם הקובץ מכיל ערימות תמונות מרובות, בחר את אלה שניתן לנתח ולאשר על-ידי הקשה על אישור.
    2. בצע תיקון אקונומיקה על-ידי פיצול התמונה הממוזגת לערוצים בודדים (תמונה | צבע | הכלי ערוצים, ולאחר מכן בחר עוד | פצל ערוצים). עבור כל ערוץ, בחר תיקון אקונומיקה (תמונה | כוונן | תיקון אקונומיקה) ובחר יחס פשוט (עוצמת רקע: 0.0).
      הערה: במקרים מסוימים, לדוגמה, כאשר אין ריקבון ליניארי של האות או שהאות חלש מדי, היחס הפשוט עלול להיכשל. לחלופין, נסה התאמה מעריכית או דלג על תיקון האקונומיקה.
    3. כוונן את הבהירות והניגודיות עבור כל אחד מהערוצים באמצעות המחוונים (תמונה | כוונן | בהירות | ניגודיות).
    4. מזג את הערוצים (תמונה | צבע | מיזוג ערוצים), ליצור שילוב (תמונה | צבע | הכלי ערוצים, ולאחר מכן בחר עוד | הפוךללא משולב) והמר אותו לתבנית RGB (תמונה | צבע | הכלי ערוצים, ולאחר מכן בחר עוד | המיר ל-RGB).
    5. במקרה הצורך, שנה את גודל מחסנית התמונה כדי להקטין את זמן החישוב ואת גודל הקובץ (תמונה | כוונן | גודל, שתי האפשרויות תיקתק בתוספת אינטרפולציה בלבד).
    6. יצירת הקרנה תלת-ממדית (תמונה | ערימות | פרוייקט תלת-ממדי). בחרו ' נקודת מבריק כשיטת הקרנה ' וקבעו את מרווח הפרוסה כדי להתאים לגודל ה-z של מחסנית התמונה שנרכשה. לאיכות מרבית, קבעו את התוספת של זווית הסיבוב ל- 1 והפעל אינטרפולציה. שנה את הסיבוב הכולל, סף השקיפות והאטימות לפי הצורך.
    7. במקרה הצורך, הזמן את הניגודיות והבהירות באמצעות המרת ההטלה התלת-ממדית חזרה לתבנית של 8 סיביות (תמונה | סוג | 8 סיביות). השתמש במחוונים המתאימים (תמונה | כוונן | בהירות | ניגודיות) והמרה מפני ערימת התמונות לתבנית RGB כמתואר בשלב 7.3.4.
    8. שמרו את ההטלה התלת-ממדית. טיף קובץ (תבנית קובץ תמונה) ו. קובץ AVI (תבנית קובץ וידאו).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השילוב של iDISCO14 ו udisco13 בשילוב עם clsm ברזולוציה גבוהה מספק תובנות עמוקות לתוך הרזולוציה הטמפורלית ואת הפלסטיות של זיהום rabv של רקמת המוח והקשר הסלולר המקיף.

שימוש חיסוני של ראפופרוטאין (P), שכבות מורכבות של תאים עצביים נגועים יכול להיות דמיינו בחלקים עבים של מוחות העכבר (איור 3). לאחר מכן, התחזיות 3D חלקה של ערימות התמונה הנרכש ניתן לשחזור (איור 3A, B, הלוח הימני...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התחייה ופיתוח נוסף של טכניקות ניקוי רקמות בשנים האחרונות2,3,4,5,6,7,8 , מיכל בן 10 , מיכל עשור , מיכל בן 11 , מיכל בן 12 , מיכל

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לתומס סי מטנלייטר ולוורנה טה קמפ על שקראו באורח קשה את כתב היד. עבודה זו היתה נתמכת על ידי יוזמת מצוינות פדרלית של קלנבורג מערב פומרניה והקרן החברתית האירופית (esf) מענק ko kt (esf/14-BM-A55-0002/16) ו מענק מחקר משותף בקיר על lyssaviruses ב פרידריך-לופלר-מכון (Ri-0372).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<ריאגנטים חזקים>
בנזיל אלכוהולאלפא Aesar41218מגיב פינוי
בנזיל בנזואטסיגמא-אולדריץ'BB6630-500MLמגיב ניקוי
דימתיל סולפוקסידקארל רוט4720.2חוצצים שונים
דיפניל אתרסיגמא-אולדריץ'240834-100 גרםמגיב ניקוי
DL-α-טוקופרולאלפא AesarA17039נוגד חמצון
לחמורBio-RadC06SBZמגיב חוסם
גליציןקארל רוט3908.2סרום הפחתת
רקע עיזיםMerckS26-100MLמגיב חוסם
הפרין מלח נתרןקארלרוט 7692.1רקע הפחתה
תמיסת מי חמצן (30%)קארל רוט8070.2הלבנת מדגם
מתנולקארל רוט4627.4טיפול מקדים לדוגמא
פרפורמלדהידקארל רוט0335.3אבקה גבישית להכנת תמיסה מקבעת
נתרן אזידקארל רוטK305.1מניעת צמיחה מיקרוביאלית בתמיסות
מלאיtert-butanolAlfa Aesar33278התייבשות דגימה לניקוי רקמות
TO-PRO-3Thermo FisherT3605כתם חומצת גרעין
Triton X-100Carl Roth3051.2חומר ניקוי
Tween 20AppliChemA4974,0500חומר ניקוי
<חזק>שונות
5 מ"ל תגובה צינורותEppendorf0030119401צינורות דגימה
Coverslip, עגול (קוטר: 22 מ"מ)Marienfeld0111620חלק מתא ההדמיה
Coverslip, עגול (קוטר: 30 מ"מ)Marienfeld0111700חלק מתא ההדמיה
מחט היפודרמית (27 G x ¾ ” [0.40 מ"מ x 20 מ"מ])ב. בראון4657705מילוי תא ההדמיה בתמיסת ניקוי
גומי סיליקון RTV-1WackerElastosil E43להרכבת תא ההדמיה
Ultimaker CPE 2.85 מ"מ שקוףUltimaker8718836374869חוט קופוליאסטר למדפסת תלת מימד להדפסת חלקים מתא ההדמיה
<חזק>ציוד טכני ותוכנה
מדפסת תלת מימדUltimakerUltimaker 2+הדפסת תא הדמיה
מערכת טבילה אוטומטית במיםLeica15640019משאבת מים מבוקרת תוכנה
שייקר מסלולי ספסלElmiDOS-20Mדגירה לדוגמא בטמפרטורת החדר (~ 150 סל"ד)
שייקר מסלולי ספסל, מחומםניו ברונסוויק סיינטיפיקG24 דגירה של דגימת שייקר סביבתי ב-37 מעלות; C (~ 150 סל"ד)
מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקליLeicaDMI 6000 TCS SP5מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך להדמיה
פיג'יNIH (ImageJ)תוכנת קוד פתוח (v1.52h)חבילת עיבוד תמונה המבוססת על ImageJ
מטרת טבילה במים למרחק עבודה ארוךLeica15506360HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2
VibratomeLeicaVT1200Sחיתוך לדוגמא
עבודהמעבד DellPrecision 7920: Intel Xeon Gold 5118
GPU: Nvidia Quadro P5000
RAM: 128 ג'יגה בייט 2666 מגה-הרץ DDR4
SSD: 2 TB
חזק>נוגדנים ראשוניים
עז נגד RABV Nמכון פרידריך-לופלרסרום אנטי-RABV N רב-שבטי חד-שבטי, שנוצר על ידי חיסון עזים עם נוקלאופרוטאין RABV מבוטא ב-baculovirus ו-His-tag מטוהר N
דילול: 1:400
ארנב anti-GFAPDakoZ0334נוגדן פוליקלונלי (RRID:AB_10013382)
דילול: 1:100
ארנב anti-MAP2Abcamab32454נוגדן פוליקלונלי (RRID:AB_776174)
דילול: 1:250
ארנב נגד RABV P 160-5Friedrich-Loeffler-Institutסרום ארנב רב-שבטי חד-שבטי נגד RABV P, שנוצר על ידי חיסון ארנב עם פוספופרוטאין RABV מבוטא ב-baculovirus ו-His-tag-purified RABV phosphoprotein P (ראה הפניה 23: Orbanz et al., 2010)
דילול: 1:1,000
<חזק>נוגדנים משניים
חמור נגד עזים IgGThermo Fisher Scientificתלוי במצומד fluorophoreדילול בעל ספיגה צולבת גבוהה
: 1:500
חמור נגד עכבר IgGThermo Fisher מדעיתלוי בפלואורופור מצומד דילולבעל ספיגה צולבת גבוהה
דילול: 1:500
חמור נגד ארנב IgGThermo Fisher מדעיתלוי בפלואורופור מצומד דילולבעל ספיגה צולבת גבוהה
: 1:500
עיזים נגד עכבר IgGThermo Fisher מדעיתלוי בפלואורופור מצומדדילול בעל ספיגה צולבת גבוהה
: 1:500
עיזים נגד ארנב IgGThermo Fisher מדעיתלוי בפלואורופור מצומדדילול בעל ספיגה צולבת גבוהה
: 1:500
סרום דבק לדוגמה תחנת<

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pichat, J., Iglesias, J. E., Yousry, T., Ourselin, S., Modat, M. A Survey of Methods for 3D Histology Reconstruction. Medical Image Analysis. 46, 73-105 (2018).
  2. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  3. Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
  4. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  5. Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
  6. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  7. Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
  8. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  9. Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).
  10. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
  11. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nature Medicine. 18 (1), 166-171 (2011).
  12. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  13. Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
  14. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  15. Masland, R. H. Neuronal cell types. Current Biology. 14 (13), 497-500 (2004).
  16. von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
  17. Fooks, A. R., et al. Rabies. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17091(2017).
  18. WHO. WHO Expert Consultation on Rabies, Third Report. WHO Technical Report Series. , No. 1012 (2018).
  19. CDC. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 5th Edition. US Department of Health and Human Services. , (2009).
  20. Arnold, M. M., et al. Effects of fixation and tissue processing on immunohistochemical demonstration of specific antigens. Biotechnic & Histochemistry. 71 (5), 224-230 (1996).
  21. Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
  22. Werner, M., Chott, A., Fabiano, A., Battifora, H. Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry. The American Journal of Surgical Pathology. 24 (7), 1016-1019 (2000).
  23. Orbanz, J., Finke, S. Generation of recombinant European bat lyssavirus type 1 and inter-genotypic compatibility of lyssavirus genotype 1 and 5 antigenome promoters. Archives of Virology. 155 (10), 1631-1641 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

BABB D15

מאמרים קשורים